Name: Analisi ottimizzata delle In Vivo e In Vitro Epatica steatosi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Scopri metodi ottimizzati per generare e caratterizzare la steatosi epatica in vivo e in vitro. Queste tecniche permettono valutazioni non invasive della progressione fisiologica, offrendo approfondimenti sulle malattie metaboliche correlate.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ringraziamo Feifei Zhang per le utili discussioni. Siamo grati a Jing Gao e Yixuan Sun per l'assistenza tecnica e a Zhengshuai Liu e Fengguang Ma per gli studi sugli animali.

Tutti i protocolli sperimentali su animali sono stati approvati dal comitato di cura degli animali e uso istituzionale presso l&#39;Istituto di Scienze dell&#39;Alimentazione, Istituti di Shanghai per Scienze Biologiche, Accademia Cinese delle Scienze (Shanghai, Cina). 1. DIO modello murino <ol><li> alimentazione HFHS <ol><li> Feed the otto settimane di età maschile C57BL / 6 topi con una HFHS che contiene 40 kcal% di grassi e 40 kcal% di saccarosio. loro casa a 12 h Condizioni ciclo dark-light. </li><li> Mantenere i topi in HFHS condizione di dieta al seno per quattro a sedici settimane. Controllare il settimanale del peso corporeo. </li></ol></li><li> Analisi della composizione corporea e analisi delle immagini pseudo-color <ol><li> Sottoporre i topi a una analisi della composizione corporea analizzatore. <ol><li> Fissare cosciente, topi non anestetizzati in un tubo di plastica nel. Misurare la massa grassa, massa magra, e fluidi che utilizzano un sistema di NMR, come descritto in precedenza 2. </li></ol></li><li> Eseguire la scansione di tutto il corpo di ogni mouse utilizzando un sistema di risonanza magnetica. <ol><li> Anestetizzare i topi con 1% avertin tramite iniezione intraperitoneale (25 ml / g) ed eseguire l&#39;analisi di imaging in tubi di vetro specializzati. NOTA: Il processo di formazione immagine ha una durata di circa 0,5 ore per ogni mouse. Quando la misurazione è completata, restituire i topi per gabbia. </li></ol></li><li> Eseguire la scansione l&#39;intero corpo dei topi in dorsale centrale, e gli strati ventrale; scandire il fegato in direzione verticale. Utilizzare un magnete 0,55 T e dei seguenti parametri strumentali: spazio K = 192 x 256 micron, lo spessore della sezione = 3 mm, TE = 14,8 ms, TR = 400 ms, FOVRead = 100 mm, FOVPhase = 100 mm, e il numero di scansioni = 8. scansione utilizzando la stessa condizione magnetica per i tutti i gruppi di topi. </li><li> Mappa scala di grigio dell&#39;immagine una pseudo-colore sul secondo l&#39;intensità del segnale 9. </li></ol></li><li> l&#39;eutanasia del mouse <ol><li> sterilizzare dissectistrumenti NG, come pinze e forbici. </li><li> Versare isoflurano sufficienti su un tovagliolo di carta e lasciare che il isoflurano volatilizza in un barattolo di vetro. Assicurarsi che i topi sono eutanasia dal isoflurano. </li><li> Fissare i topi su un tavolo operatorio. Spruzzare ogni addome con 75% etanolo, fare un&#39;incisione nel derma del processo xifoideo con le forbici, e strappare il derma longitudinalmente attraverso la linea mediana con le mani per esporre il peritoneo. </li><li> Bloccare il processo xifoideo con una pinza e tagliare il peritoneo in larghezza attraverso il fondo delle nervature per esporre le viscere. </li><li> Prelevare il sangue in provette EDTA rivestite mediante puntura cardiaca. </li><li> Tagliare il diaframma lungo il fegato e rimuovere con attenzione il fegato dai enterocoelia con le forbici sottili. Tagliare tre pezzi di tessuto epatico per le seguenti misure lipidi: a) 6 x 3 x 3 mm per H &amp; E colorazione, b) 6 x 3 x 3 mm per Oil Red O colorazione, e c) 20-40 mg di fegato per il cloroformio / l&#39;estrazione metanolo. </li></ol></li><li> Colorazione H &amp; E <ol><li> Fissare il fegato in 4% tampone fosfato di formalina acetato a 4 ° C durante la notte e poi incorporare in paraffina. </li><li> Tagliare sezioni di paraffina (5 micron) e montare su vetrini per colorazione H &amp; E, come precedentemente descritto 3, 10. </li></ol></li><li> Oil Red O colorazione <ol><li> preparazione Regent <ol><li> Preparare la soluzione di lavoro Oil Red O con formalina al 10%, il 60% di isopropanolo, ematossilina, e gelatina glicerolo. Sciogliere 0.5 g di Oil Red O polvere con 100 ml di isopropanolo e riscaldare in un bagno a 60 ° C per ottenere una soluzione stock di 0,5%. </li><li> Diluire con acqua bidistillata (DDH 2 O) in un rapporto 3: 2 (3 ml di soluzione madre e 2 ml di DDH 2 O). Filtrare la soluzione di lavoro e lasciate riposare per almeno 10 minuti a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Incorpora il fegato di temperatura di taglio ottimale (OCT) composto in apscatola incasso lastic. Congelarlo a -20 ° C per 30 min. Tagliare in sezioni di 8 micron di un microtomo di congelamento, montare il tessuto su un vetrino, e metterlo a temperatura ambiente per 30 min. </li><li> Posizionare un tovagliolo di carta sul fondo di una vasca di colorazione e versare una piccola quantità di formalina al 10% di bagnare l&#39;asciugamano di carta. Posizionare il vetrino nella colorazione vasca e fissare le sezioni congelate in vapori di formaldeide per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Immergere il vetrino nel 60% isopropanolo nella vasca colorazione per 3 s; ripetere una volta. </li><li> Aggiungere poche gocce di soluzione di lavoro Oil Red O alla diapositiva per coprire tutto il tessuto e incubare per 15 min. Proteggere i tessuti dalla luce a temperatura ambiente. </li><li> Lavare il vetrino in nuova isopropanolo 60% nella vasca colorazione per 3 s; ripetere due volte. </li><li> Lavare delicatamente il vetrino con acqua distillata due volte e rimuovere l&#39;acqua in tutto il tessuto. Assicurarsi di non asciugare il tessuto. </li><li> Posizionare il vetrino in ematossilina per 1 min e risciacquare delicatamente con acqua corrente per 5-10min. Lavare delicatamente il vetrino in acqua distillata due volte e mantenere l&#39;in acqua distillata fino al momento di mettere sul vetrino. </li><li> Riscaldare la gelatina glicerolo nel microonde e mettere alcune gocce sulla parte superiore del tessuto. Posizionare delicatamente il coprioggetto sulla parte superiore e fare attenzione a non formare bolle. </li><li> Osservare la macchia sotto un microscopio e catturare immagini caratteristici utilizzando 20X e 40X obiettivi. </li></ol></li><li> Dosaggio dei lipidi del fegato <ol><li> Posizionare il tessuto epatico sezionato in una nuova provetta da centrifuga 2 mL di plastica. Omogeneizzare in 1 mL di PBS con un omogeneizzatore e trasferire il lisato in un tubo di vetro da 15 ml. </li><li> Aggiungere 5 ml di cloroformio / metanolo (2: 1, v / v), vortex la miscela vigorosamente per 1 minuto, e lasciate riposare per 2 ore sul ghiaccio. </li><li> Centrifugare a 1.650 xg per 10 min a 4 ° C; la miscela deve separare in 3 strati: lo strato superiore metanolo, il disco proteine ​​centrale, e il cloroformio inferiore e lipidi. </li><li> Tran<html> SFER la fase di fondo in un nuovo tubo di vetro con una lente di Pasteur pipetta; non vi è alcuna necessità di ottenere ogni goccia della frazione inferiore. Impostare il tubo da parte su ghiaccio. </li><li> Aggiungere 600 ml di 4 mM MgCl 2 e 1,5 mL di cloroformio alla frazione supernatante sinistra nel tubo precedente e agitare vigorosamente. Incubare in ghiaccio per 30 minuti e centrifugare a 1.650 xg per 10 min a 4 ° C. </li><li> Unire la fase di fondo con il primo tubo fase di fondo utilizzando Pasteur pipetta. Eliminare gli strati superiori e medie. </li><li> Si evapora il cloroformio sotto azoto in un bagno a 37 ° C. Lavare i lati dei tubi di vetro a fondo con 200 ml di 1% Triton X-100 / cloroformio (v / v). Far evaporare sotto azoto. Sciogliere il lipidico con 200 ml di DDH 2 O e vortice bene a fare l&#39;emulsione finale. </li><li> Misurare la trigliceridi totali (TG) e colesterolo (TC) livelli utilizzando un trigliceride o colesterolo kit secondo il protocollo del produttorexref &quot;&gt; 3. NOTA: I valori lipidici sono normalizzati a quelli delle concentrazioni di proteine in omogenato iniziale, come determinato dalla proteina quantificazione 3. </li></ol></li></ol> Modello 2. principale del mouse epatociti <ol><li> L&#39;isolamento di epatociti primari di topo <ol><li> Anestetizzare ogni mouse con il 6% cloralio idrato (10 ml / g per via intraperitoneale). </li><li> Isolare epatociti primari, come descritto in precedenza 10. Crescere le cellule su vetrini collagene rivestite in un 6-pozzetti per Oil Red O colorazione. Per l&#39;estrazione dei lipidi, seminare le cellule su un 10-cm coltura cellulare piatto 10. </li></ol></li><li> Trattamento con cellule e Oil Red O colorazione <ol><li> Sostituire il mezzo con 2 mL di terreno fame e incubare a 37 ° C per 24 h. Trattare con 30 mM glucosio e di insulina 100 nM. Incubare a 37 ° C cultura incubatore per 24 h. </li><li> Aspirare il mezzo. Aggiungere 2 ml di PBS e miscelare delicatamente per sciacquare il medium; ripetere una volta. </li><li> Fissare il vetrino alla slitta con un elastico. Esporre le cellule aderenti alla superficie esterna. Eseguire la colorazione Oil Red O come descritto sopra (punto 1.5). NOTA: I livelli basali di accumulo di lipidi vengono stimolati con un elevato glucosio più trattamento insulina dopo deprivazione di siero. Le gocce lipidiche vengono visualizzati con Oil Red O colorazione. </li></ol></li><li> Dosaggio dei lipidi <ol><li> Trattare gli epatociti con alte concentrazioni di glucosio più insulina nella stessa condizione (punto 2.2.1). Aggiungere 1 ml di soluzione salina in ogni 10 cm piatto di coltura cellulare. Raschiare le cellule e li raccolgono in nuovi tubi di vetro da 15 ml, da cui aliquote di 100 microlitri vengono trasferiti ai tubi freschi 1.5 mL per la quantificazione delle proteine. </li><li> Aggiungere 4 mL di cloroformio / metanolo (2: 1, v / v) al residuo 900 ml di cellule. Con ultrasuoni per circa il 20 emette un segnale acustico e poi vortice vigorosamente per liberarei lipidi nelle cellule. Incubare la miscela in ghiaccio per 2 ore. Eseguire l&#39;estrazione dei lipidi (passo 1,6). </li></ol></li></ol>

<ol><li>Angulo, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11961152">Medical progress - Nonalcoholic fatty liver disease.</a> New England Journal of Medicine. 346 (16), 1221-1231 (2002).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+ATF6+Increases+Fatty+Acid+Oxidation+to+Attenuate+Hepatic+Steatosis+in+Mice+through+Peroxisome+Proliferator-Activated+Receptor+Alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Hepatic ATF6 Increases Fatty Acid Oxidation to Attenuate Hepatic Steatosis in Mice through Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Alpha.</a> Diabetes. 65 (7), 1904-1915 (2016).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPK+phosphorylates+and+inhibits+SREBP+activity+to+attenuate+hepatic+steatosis+and+atherosclerosis+in+diet-induced+insulin-resistant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">AMPK phosphorylates and inhibits SREBP activity to attenuate hepatic steatosis and atherosclerosis in diet-induced insulin-resistant mice.</a> Cell Metab. 13 (4), 376-388 (2011).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+SIRT1+attenuates+hepatic+steatosis+and+controls+energy+balance+in+mice+by+inducing+fibroblast+growth+factor+21%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Hepatic SIRT1 attenuates hepatic steatosis and controls energy balance in mice by inducing fibroblast growth factor 21.</a> Gastroenterology. 146 (2), 539-549 (2014).</li>
<li>Esau, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-122+regulation+of+lipid+metabolism+revealed+by+in+vivo+antisense+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">miR-122 regulation of lipid metabolism revealed by in vivo antisense targeting.</a> Cell Metabolism. 3 (2), 87-98 (2006).</li>
<li>Kanda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MCP-1+contributes+to+macrophage+infiltration+into+adipose+tissue%2C+insulin+resistance%2C+and+hepatic+steatosis+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">MCP-1 contributes to macrophage infiltration into adipose tissue, insulin resistance, and hepatic steatosis in obesity.</a> Journal of Clinical Investigation. 116 (6), 1494-1505 (2006).</li>
<li>Cohen, J. C., Horton, J. D., Hobbs, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+fatty+liver+disease%3A+old+questions+and+new+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human fatty liver disease: old questions and new insights.</a> Science. 332 (6037), 1519-1523 (2011).</li>
<li>Hebbard, L., George, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+nonalcoholic+fatty+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Animal models of nonalcoholic fatty liver disease.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 8 (1), 35-44 (2011).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+effective+inhibition+of+lung+cancer+growth+and+metastasis+by+systemic+delivery+of+siRNA+via+multimodal+mesoporous+silica-based+nanocarrier%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Highly effective inhibition of lung cancer growth and metastasis by systemic delivery of siRNA via multimodal mesoporous silica-based nanocarrier.</a> Biomaterials. 35 (38), 10058-10069 (2014).</li>
<li>Gong, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor+21+improves+hepatic+insulin+sensitivity+by+inhibiting+mammalian+target+of+rapamycin+complex+1+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor 21 improves hepatic insulin sensitivity by inhibiting mammalian target of rapamycin complex 1 in mice.</a> Hepatology. 64 (2), 425-438 (2016).</li>
<li>Anstee, Q. M., Targher, G., Day, C. P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23507799">Progression of NAFLD to diabetes mellitus, cardiovascular disease or cirrhosis.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (6), 330-344 (2013).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti. Finanziamento: Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Science Foundation naturale della Cina (n ° 81.270.930, 31.471.129, e 31.671.224) e le cento talenti del programma della Accademia Cinese delle Scienze (2013OHTP04) a YL

NAFLD è una serie di malattie epatiche progressive che è associato con la sindrome metabolica, l&#39;obesità, insulino-resistenza, o diabete mellito tipo 2 (DM2) 11. Il segno distintivo di NAFLD è steatosi, l&#39;accumulo di lipidi negli epatociti. Qui, uno spettro di metodi è presentata per caratterizzare i fenotipi e parametri di steatosi epatica utilizzando topi DIO e epatociti del mouse primarie. Questa procedura potrebbe essere utile per chiarire i meccanismi molecolari di NAFLD e altre mala...

L&#39;obesità è un problema di salute in rapida crescita nei paesi sviluppati e in via di sviluppo. E &#39;stato segnalato per essere una delle condizioni coesistenti frequentemente associati con steatosi epatica non alcolica (NAFLD), con una prevalenza che varia tra il 30 e il 100 per cento in pazienti con NAFLD 1. A causa della forte correlazione tra il fegato grasso e l&#39;obesità, obesi (DIO) modelli murini di dieta-indotta sono ampiamente utilizzati per studiare i meccanismi molecolari complessi associati con lo sviluppo di NAFLD 2, 3, 4, 5, 6. Steatosi epatica è il primo stadio della NAFLD, e può progredire a steatoepatite non alcolica (NASH), cirrosi, e in ultima analisi, il cancro del fegato 7. Pertanto, l&#39;obiettivo generale di questo metodo è quello di generare modelli animali e cellulari di condizioni steatosico epatiche e al PrOvide protocolli dettagliati per la misurazione dei lipidi efficiente ed accurato. Questi modelli e misure sono utili anche per la ricerca di altri disordini metabolici, come la resistenza all&#39;insulina e diabete di tipo 2. Come l&#39;obesità è identificato come uno dei principali fattori di rischio per la NAFLD, un alto contenuto di grassi, ad alto saccarosio dieta (HFHS) che imita la dieta ricca di grassi di tipo occidentale è usato per indurre l&#39;obesità nei topi. Successivamente, il grado di steatosi epatica può essere valutata con metodi diversi. In primo luogo, il peso corporeo e analisi della composizione corporea con risonanza magnetica nucleare (NMR) mostrano l&#39;accumulo di lipidi durante il tempo di alimentazione. La massa grassa e massa magra possono essere quantificati in modo non invasivo e in tempo reale. Inoltre, la risonanza magnetica (MRI) viene utilizzata sia per il corpo intero e la distribuzione fegato grasso. Il segnale scala di grigi dell&#39;analisi MRI può essere convertito un&#39;immagine pseudo-colori leggibile in, e l&#39;intensità dellala scala di grigi e colore è emi-quantificabile. Questa tecnologia offre vantaggi unici per la misurazione di accumulo di lipidi di animali vivi. In secondo luogo, l&#39;analisi istologica del fegato è il metodo più comunemente utilizzato per determinare steatosi epatica. Ematossilina ed eosina (H &amp; E) colorazione istologica fornisce informazioni, quali epatociti morfologia e infiltrazione di macrofagi, mentre Oil Red O colorazione mostra la dimensione e la posizione delle goccioline lipidiche in epatociti. In terzo luogo, l&#39;analisi del contenuto di lipidi utilizzando estrazione con cloroformio / metanolo è una misurazione accurata e quantitativa dei lipidi epatici. Totale livelli di trigliceridi e di colesterolo possono essere misurati con metodi biochimici. È importante sottolineare che l&#39;analisi estrazione dei lipidi e Oil Red O colorazione possono essere utilizzati anche in geneticamente manipolato o trattato farmaceuticamente epatociti. Il vantaggio del presente metodo è la sua utilizzazione di approcci multipli ottimizzati per generare modelli steatosico epatichee caratterizzare completo fenotipi sia in vivo che in vitro. I modelli DIO mouse possono ricapitolare i patologia e metaboliche fenotipi di malattia del fegato grasso umano. Altri parametri metabolici negli esseri umani possono essere replicati in questo modello, come pure 8. La generazione del modello epatociti steatosico in risposta ad alta glucosio più insulina è efficiente, utile, e supera la limitazione del lavoro costoso e richiede tempo mouse. Nel loro insieme, questi metodi sono sufficienti ed essenziali per lo studio della disfunzione epatica lipidi e insulino-resistenza durante sovraccarico di nutrienti.

<table><tbody><tr><td>Composto OCT</td><td>SAKURA</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Olio Rosso O Sigma</td><td></td><td>O0625-25G</td><td></td></tr><tr><td>Kit Trigliceridi Infinito</td><td>Fisher Kit scientifico</td><td>TR22421</td><td></td></tr><tr><td>Infinity Colesterolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>TR13421</td><td></td></tr><tr><td>Collagene tipo I, coda di ratto</td><td>Millipore</td><td>08-115</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (basso glucosio)</td><td>Invitrogen</td><td>11885-092</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina / Streptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>10099141</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>cellgro</td><td>R21-040-CVR</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>cellgro</td><td>20-021-CV</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>TOCRIS Bioscience</td><td>3435</td><td>sciogliere in PBS, 1 mM per stock</td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Sigma</td><td>G8270-100G</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Olympus</td><td>BX53</td><td></td></tr><tr><td>Pompa peristaltica</td><td>Longerpump</td><td>BT100-2J</td><td></td></tr><tr><td>Piatto per colture cellulari da 10 cm</td><td>Corning</td><td>420167</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 6 pozzetti</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Saggio BCA</td><td>Beyotime</td><td>P0010</td><td></td></tr><tr><td>Risonanza magnetica nucleare</td><td>Tecnologia Niumag</td><td>MiniQMR23-060H-I</td><td></td></tr><tr><td>Dieta ad alto contenuto di grassi e alta surcosa (HFHS)</td><td>Diete di ricerca</td><td>D12327</td><td></td></tr></tbody></table>

analisi ottimizzata delle<em&gt; in vivo</em&gt; e<em&gt; in vitro</em&gt; epatica steatosi

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Stabilire un sistema di procedure per caratterizzare qualitativamente e quantitativamente la steatosi epatica in vivo e in vitro è importante per lo studio metabolico nel fegato. Qui vengono descritti numerosi saggi per misurare in modo completo il fenotipo e i parametri della steatosi epatica in modelli murini ed epatociti. 
Combinando i metodi fisiologici, istologici e biochimici, questo sistema può essere utilizzato per valutare il progresso della steatosi epatica. In vivo, le misurazioni del peso corporeo e della risonanza magnetica nucleare (NMR) forniscono una comprensione generale dei topi in modo non invasivo. L'ematossilina e l'eosina (H&E) e la colorazione con olio rosso O determinano la morfologia istologica e la deposizione lipidica del tessuto epatico in condizioni di sovraccarico di nutrienti, come l'alimentazione con una dieta ricca di grassi. Successivamente, il contenuto lipidico totale viene isolato mediante estrazione con cloroformio/metanolo, seguita da un'analisi biochimica per trigliceridi e colesterolo. Inoltre, gli epatociti primari di topo sono trattati con glucosio alto più insulina per stimolare l'accumulo di lipidi, un modello in vitro efficiente per imitare l'iperglicemia indotta dalla dieta e l'iperinsulinemia in vivo. Quindi, la deposizione lipidica viene misurata mediante colorazione con olio rosso O ed estrazione con cloroformio/metanolo. La colorazione Oil Red O determina fenotipi steatotici epatici intuitivi, mentre l'analisi dell'estrazione lipidica determina i parametri che possono essere analizzati statisticamente. Gli attuali protocolli sono di interesse per gli scienziati nel campo delle malattie del fegato grasso, dell'insulino-resistenza e del diabete di tipo 2.

Come mostrato in figura 1A, il peso del corpo del mouse è stato aumentato a 45 ± 1,2 g dopo 16 settimane di HFHS alimentazione, che è circa 1,5 volte superiore rispetto al gruppo di alimentazione dieta chow. La composizione corporea NMR analisi mostra la massa grassa e massa magra di topi sono indicati (Figura 1B). Le distribuzioni di grasso del corpo e del fegato sono state determinate mediante MRI, e immagini rappresentative pseudo-colori in vivo, topi...

Qui, vengono descritti metodi ottimizzati per generare modelli in vivo e in vitro di steatosi epatica e per analizzare i fenotipi steatotici e i relativi parametri fisiologici.

Analisi ottimizzata delle<em&gt; In Vivo</em&gt; e<em&gt; In Vitro</em&gt; Epatica steatosi

Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic ...

L'obiettivo generale di questa procedura è fornire un metodo ottimizzato per generare e caratterizzare la steatosi epatica utilizzando approcci in vivo e in vitro. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nello studio meccanicistico della deregolazione epatica del metabolismo dei lipidi e del glucosio durante il sovraccarico nutrizionale e l'obesità. Un vantaggio di questa tecnica è che il decorso fisiologico della steatosi epatica può essere valutato in modo non invasivo prima dell'analisi istologica e biochimica.Questo metodo può fornire informazioni sulla steatosi epatica. Può inoltre essere applicato ad altre malattie metaboliche come resistenza all'insulina, diabete di tipo II e obesità. La procedura sarà dimostrata da Zhimin, Yamei e Aoyuan.Sono tutti studenti laureati del mio laboratorio che lavorano sulla regolazione trascrizionale del metabolismo dei lipidi e del glucosio. Dopo aver anestetizzato il topo donatore, prelevare un campione di sangue mediante puntura cardiaca e raccogliere il sangue in un tubo con EDTA. Per rimuovere il fegato, tagliare il diaframma lungo la lunghezza del fegato ed estrarlo con cura dall'entero colia.Prelevare dal fegat

optimized-analysis-of-in-vivo-and-in-vitro-hepatic-steatosis

Research

Ricerca

JoVE Journal

Medicine

Medicina

In questo video, dimostriamo la colorazione in vitro di lipidi neutri negli epatociti per rilevare la steatosi epatica o l'eccessivo accumulo di grasso nel fegato. Il grasso in eccesso si accumula nelle cellule sotto forma di goccioline lipidiche. L'olio rosso O è un colorante liposolubile che si lega ai lipidi neutri intracellulari in queste goccioline lipidiche. Se osservate al microscopio ottico, queste goccioline lipidiche intracellulari appaiono di colore rosso intenso.

Colorazione Oil Red O: una tecnica per colorare i lipidi neutri negli epatociti per rilevare la steatosi epatica in vitro

De novo lipogenesi e acido ossidazione β-grassi costituiscono importanti vie metaboliche in epatociti, percorsi che sono perturbate in diversi disordini metabolici, tra cui malattia del fegato grasso. Qui mostriamo isolamento di epatociti primari di topo e descriviamo la quantificazione di ossidazione degli acidi β-grassi e lipogenesi.

Determinazione della ossidazione degli acidi grassi e la lipogenesi nel topo primaria Epatociti

Il presente rapporto descrive un test enzimatico in vitro per misurare l'attività della fosfatidiletanolammina metiltransferasi utilizzando estratti cellulari di Leishmania. Questo test si basa sul trasferimento di un gruppo metilico radioattivo dalla S-[metil-3H]adenosil-L-metionina alla fosfatidiletanolammina endogena.

In vitro misurare phosphatidylethanolamine metiltransferasi attività

In questo studio, descriviamo un protocollo dettagliato per indurre la steatosi vescicolare del fegato in cellule HepaRG differenziate con l'oleate di sodio acido grasso e impieghiamo metodi per il rilevamento e la quantificazione dell'accumulo di lipidi, compresi gli anti-Stokes coerenti Microscopia a dispersione Raman (CARS), analisi citofluorimetrica, colorazione Oo rosso olio e qPCR.

Indurre e caratterizzare la vesapica steatosi nelle celle HepaRG differenziate

Questo protocollo vuole essere uno strumento per studiare la steatosi e i cambiamenti molecolari, biochimici, cellulari prodotti dalla sovraeposizione degli epatociti ai lipidi in vitro.

Un modello di steatosi sperimentale in vitro:coltura cellulare di epatociti in mezzo condizionato da sovraccarico lipidico

L'β-ossidazione degli acidi grassi è una via metabolica essenziale responsabile della generazione di energia in molti tipi di cellule diverse, compresi gli epatociti. Qui, descriviamo un metodo per misurare l'β-ossidazione degli acidi grassi in epatociti primari appena isolati utilizzando acido palmitico marcato con 14C.

Misurazione della β-ossidazione degli acidi grassi in una sospensione di epatociti di topo appena isolati

Utilizzando un modello murino di steatosi epatica non alcolica (NAFLD) indotto dalla dieta, descriviamo l'uso di nuove tecniche di imaging di tomografia microcomputerizzata in vivo come metodo non invasivo per valutare le fasi di progressione della NAFLD, concentrandoci prevalentemente sulla rete vascolare epatica a causa del suo significativo coinvolgimento nella disregolazione epatica correlata alla NAFLD.

Nuove tecniche di imaging con tomografia microcomputerizzata in vivo per valutare la progressione della steatosi epatica non alcolica

Qui, dimostriamo un protocollo ottimizzato basato sulla fluorescenza BODIPY 493/503 per la caratterizzazione delle goccioline lipidiche nel tessuto epatico. Attraverso l'uso di proiezioni ortogonali e ricostruzioni 3D, il fluoroforo consente una discriminazione di successo tra steatosi microvescicolare e macrovescicolare e può rappresentare un approccio complementare ai protocolli istologici classici per la valutazione della steatosi epatica.

Analisi di goccioline lipidiche colorate con fluorescenza con ricostruzione 3D per la valutazione della steatosi epatica

Questo articolo descrive l'uso di cellule HepG2 indotte da acido oleico come modello per la malattia steatosica epatica associata a disfunzione metabolica.

Modellazione in vitro della deposizione di grasso nella malattia epatica steatosica associata a disfunzione metabolica

Un sistema ottico è stato sviluppato per visualizzare microcircolazione epatica con eritrociti marcata con FITC e per misurare la pressione parziale di ossigeno nel microvasi con laser assistita phosphorimetry. Questo metodo può essere usato per studiare i meccanismi fisiologici e patologici analizzando struttura microvascolare, diametro, velocità del flusso ematico, e tensione di ossigeno.

Visualizzazione e analisi del flusso ematico e consumo di ossigeno nella microcircolazione epatica: Applicazione di un modello di epatite acuta

Scopri metodi ottimizzati per generare e caratterizzare la steatosi epatica in vivo e in vitro. Queste tecniche permettono valutazioni non invasive della progressione fisiologica, offrendo approfondimenti sulle malattie metaboliche correlate.

Analisi ottimizzata delle

Esplora altri video