Name: Un Ex Vivo Metodo per Time-Lapse Imaging di coltura Rat mesenteriche microvascolari Networks (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: Scopri il metodo di imaging time-lapse ex vivo per reti microvascolari mesenteriche di ratto. Questa tecnica consente di studiare l'angiogenesi e valutare gli effetti di farmaci anti-angiogenici in tempo reale.

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Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of Health Grant 5-P20GM103629 a WLM e al Tulane Center for Aging. Ringraziamo Matthew Nice per il suo aiuto nella redazione del testo del protocollo.

Tutti gli esperimenti sugli animali e le procedure sono state approvate dalla cura e l&#39;uso degli animali Comitato Istituzionale della Tulane University (IACUC). 1. Procedura di impostazione chirurgica <ol><li> strumenti Autoclave, forniture chirurgiche, e le forniture di cultura prima dell&#39;intervento. forniture chirurgiche per ogni ratto sono: 1 telo, 1 telo con foro pre-cut (0,5 x 1,5 in) al centro, garze, e 1 underpad assorbente. Strumenti chirurgici includono: 1 bisturi con lama numero 10, 2 paia di pinzette, e un paio di forbici sottili. forniture Cultura includono: 1 telo, 1 paio di pinzette, e preparati inserti 6 pozzetti con filtri in policarbonato. </li><li> Sterilizzare una piattaforma plexiglass, una fase chirurgica e uno spazio banco chirurgica con il 70% di etanolo. Mantenere la fase chirurgica in una vaschetta sterile fino al momento dell&#39;uso. <ol><li> Creare una fase chirurgica perforando un approssimativamente 2 da 1 nel foro al centro di un piatto di coltura a 100 mm. Successivamente, utilizzare carta vetrata per lisciarebordi taglienti e aggiungere uno strato di colla di silicone ai bordi del foro per creare una superficie sollevata per i tessuti. </li><li> In alternativa, progettare la fase chirurgica utilizzando il software CAD e di fare del 3-D stampa (Figura 1). </li></ol></li><li> Posizionare un underpad assorbente sterile verso il basso e porre una piattaforma di plexiglas su di esso. Posizionare il telo, senza un foro pretagliato, su un tampone riscaldato accanto al underpad assorbente. </li><li> Pre-caldo sterile PBS (PBS), mezzi di comunicazione e soluzione salina a 37 ° C. Inserire i supporti e PBS in piatti della cultura separati in cima alla piastra elettrica e il luogo di soluzione salina in una provetta da 50 ml accanto alla configurazione chirurgica. </li><li> Assicurarsi che tutti i pacchetti vengono aperti prima dell&#39;inizio della chirurgia per garantire una manipolazione sterile di tutti i materiali. Un elenco completo degli strumenti comuni utilizzati in questa procedura sono elencati nella Tabella di materiali chirurgici specifici e strumenti. </li></ol> 2. Mesentery Tissue raccolta <ol><li> Usa adulti ratti maschi Wistar (350 ± 25 g, 6 - 8 settimane di età). Altri ceppi e l&#39;età dei ratti possono essere sostituiti. </li><li> Anestetizzare ratto con una iniezione intramuscolare di ketamina (80 mg / kg di peso corporeo) e xilazina (8 mg / kg di peso corporeo). Confermare il ratto è sotto anestesia da pizzicare tra le dita per controllare che la risposta riflessa; ci dovrebbe essere nessuno. analgesia preventiva per questa procedura terminale non è necessaria. </li><li> Radere la regione addominale e rimuovere i capelli rimanenti con crema depilatoria. Pulire la pelle addominale due volte con alcool isopropilico al 70% seguita da iodopovidone. Per le salviettine il chirurgo deve iniziare al centro del sito chirurgico e spostare all&#39;esterno dell&#39;area preparata in modo circolare da non sovrapporsi aree che sono stati precedentemente lavati con lo stesso pezzo di garza sterile o tampone di cotone sterile. Poi il trasferimento degli animali al setup chirurgica sterile e posizionare in cima alla piattaforma plexiglassmodulo. </li><li> Utilizzando una lama di bisturi, fare un 0.75 a - 1.25 in incisione nell&#39;intestino a partire dal 1 nel sotto lo sterno. Fare attenzione a non forare l&#39;intestino o meso (1 strato di pelle, 1 strato di tessuto connettivo, e 1 strato di muscolo). </li><li> Posizionare un drappo con un foro pre-taglio sopra l&#39;incisione e posizionare una fase chirurgica sterile in cima al telo. Assicurarsi che le allinea apertura con l&#39;incisione. Utilizzare applicatori di cotone con punta sterile per individuare ed estrarre l&#39;ileo attraverso l&#39;apertura fase chirurgica. </li><li> Tirare 6 - 8 finestre mesenterica attraverso la fase utilizzando applicatori con punta in cotone, e fare attenzione a non toccare le finestre (Figura 1). I tessuti sono tipicamente raccolti dalla regione ileo dell&#39;intestino tenue partire vicino cieco. Mantenere tessuti esposti umido con soluzione salina sterile riscaldato se necessario utilizzando una siringa sterile a gocciolare la soluzione. </li><li> Euthanize il ratto mediante iniezione intracardiaca di sodio pentobarbital (0,2 ml per topo). Prima di rimuovere mefinestre senteric, assicurano il ratto è eutanasia palpando il cuore; ci dovrebbe essere nessun impulso. </li><li> Rimuovere i tessuti mesentere desiderato utilizzando pinzette per afferrare il cuscinetto di grasso e forbici sottili per tagliare la finestra. Lasciare un bordo di grasso (2 mm) intorno alla finestra. Lavare i tessuti una volta riscaldato PBS sterile e una volta in media. </li><li> Rientro ileo esteriorizzato alla cavità addominale e smaltire animali secondo le linee guida istituzionali. </li></ol> 3. Mesentere Tissue Culture per gli Studi Time-Lapse <ol><li> Trasferimento forniture autoclave cultura (vedere paragrafo 1.1) e dei tessuti ad una cappa a flusso laminare sterile. </li><li> Utilizzare le pinzette per trasferire ogni tessuto in cima ad una membrana filtrante di policarbonato. tessuti afferrare da parte del cuscinetto di grasso per evitare di danneggiare il sistema vascolare. </li><li> si diffuse rapidamente il tessuto con il cuscinetto adiposo, facendo attenzione a non toccare la finestra. Invertire l&#39;inserto con il tessuto nel fondo di una piastra da 6 pozzetti e coprire con 3 mL di supporti (Figura 1 </strong&gt;). supporti tipici utilizzati per questa procedura include mezzi minimi essenziali (MEM) con 1% penicillina streptomicina (PenStrep) e il 10% siero fetale bovino (FBS). I supporti possono essere integrati con altri sieri e / o fattori di crescita per stimolare l&#39;angiogenesi. </li><li> Ripetere i passaggi 3,2-3,3 per ogni tessuto e la cultura in condizioni normali incubatore (5% di CO 2, 37 ° C) per un massimo di 5 giorni. </li></ol> 4. Time-Lapse Imaging di Mesentere Tissue <ol><li> Il giorno dell&#39;imaging, integrare i media in ciascun pozzetto con coniugato BSI-lectina ed incubare in condizioni standard di coltura per 30 min. Lavare i tessuti due volte con mezzi privi di lectina. BSI-lectina macchia rimarrà visibile sul tessuto mesentere per un massimo di 3 giorni in coltura. </li><li> Trasferire la lastra ad una fase microscopio. Identificare i vasi sanguigni e linfatici in base alla loro morfologia e la struttura di rete. </li><li> Individuare un&#39;area di rete desiderata su ogni tessuto e prendere le immagini. Prendere nota del dell&#39;imagingposizione per garantire la stessa regione verrà catturato per le immagini successive. Se si utilizza un palco motorizzato, documentare le coordinate. </li><li> Rientro tessuti per l&#39;incubatore e continuare alla cultura fino punto finale desiderato. Ripetere i passaggi 4,1-4,3 come necessario a seconda momenti sperimentali desiderati. </li></ol> 5. Tessuto immunomarcatura <ol><li> BSI-lectina Etichettatura <ol><li> Incubare tessuti per 30 min a 37 ° C con 01:40 lectina FITC-coniugato in mezzi (2,5 mL di soluzione di anticorpi per pozzetto nella piastra da 6 pozzetti) seguito da due risciacqui con supporti. Per risciacqui, aggiungere media e quindi sostituire immediatamente. </li></ol></li><li> Live / Etichettatura Morto <ol><li> Incubare tessuti per 10 minuti a 37 ° C con 1: 500 2 mM etidio omodimero-1 e 1: 500 1 mM calceina AM in mezzi (2,5 mL di soluzione di anticorpi per pozzetto nella piastra da 6 pozzetti) seguito da due risciacqui con supporti. </li></ol></li><li> BSI-lectina / NG2 Labeling <ol><li> tessuti Stendere su un microscopio scivolaronoe (1 - 2 tessuti / slide) e lasciare asciugare. Rimuovere il grasso in eccesso con un bisturi, premendo con forza per asportare il grasso. </li><li> Fix tessuti in metanolo freddo per 30 minuti a -20 ° C. Lavare tessuti con PBS (3 x 10 min). </li><li> Per l&#39;etichettatura anticorpo primario incubare tessuti per 1 ora a temperatura ambiente con 1: 100 di coniglio anticorpo policlonale NG2 e 5% di siero normale di capra (NGS). Lavare tessuti con PBS (3 x 10 min). </li><li> Per l&#39;etichettatura anticorpo secondario incubare tessuti per 1 ora a temperatura ambiente con 1: 100 di capra anti-coniglio coniugato CY2-anticorpi (GAR-CY2) e 5% NGS. Lavare tessuti con PBS (3 x 10 min). </li><li> Incubare tessuti per 30 min a temperatura ambiente con 01:40 lectina FITC-coniugato in PBS seguito da due lavaggi con PBS. Per risciacqui, aggiungere PBS e quindi sostituire immediatamente. </li><li> Per montare le diapositive, coprire i tessuti con 50:50 PBS e soluzione di glicerolo e posto coprioggetto sulla parte superiore. Sigillare i bordi di scorrimento con smalto. </li></ol></li><li> LYVE-1 / PECAM Labeling<ol><li> Stendere i tessuti su un vetrino da microscopio (1 - 2 tessuti / slide) e lasciare asciugare. Rimuovere il grasso in eccesso con un bisturi, premendo con forza per asportare il grasso. </li><li> Fix tessuti in metanolo freddo per 30 minuti a -20 ° C. Lavare i tessuti con PBS + 0,1% saponina (3 x 10 min). </li><li> Per l&#39;etichettatura anticorpo primario incubare tessuti per 1 ora a temperatura ambiente con 1: 200 monoclonale biotinilato anticorpo CD31 e 1: 100 policlonale di coniglio LYVE-1 anticorpi in PBS + 0,1% saponina + 2% di albumina sierica bovina (BSA) + 5% NGS . Lavare i tessuti con PBS + 0,1% saponina (3 x 10 min). </li><li> Per l&#39;etichettatura anticorpo secondario, incubare tessuti per 1 ora a temperatura ambiente con 1: anticorpi streptavidina 500 CY3 coniugato e 1: 100 GAR-CY2 in PBS + 0,1% saponina + 2% BSA + 5% NGS. Lavare i tessuti con PBS + 0,1% saponina (3 x 10 min). </li><li> Per montare scivoli, i tessuti di copertura con 50:50 soluzione PBS e glicerolo e mettere un coprioggetto sulla parte superiore. Sigillare i bordi di scorrimento con smalto. </li></ol></li><li> BrdU / BSI-lectina Etichettatura <ol><li> Aggiungere 1 mg / mL BrdU a media e sostituire il supporto del tessuto con una soluzione di BrdU. Incubare per 2 ore a 37 ° C. </li><li> Stendere i tessuti su un vetrino da microscopio (1 - 2 tessuti / slide) e lasciare asciugare. Rimuovere il grasso in eccesso con un bisturi, premendo con forza per asportare il grasso. </li><li> Fix tessuti in metanolo freddo per 30 minuti a -20 ° C. Lavare tessuti con PBS (3 x 10 min). </li><li> Denaturare il DNA del tessuto a 2 M HCl per 1 ora a 37 ° C. Lavare tessuti in PBS + 0,1% saponina (3 x 10 min). </li><li> Per l&#39;etichettatura anticorpo primario, incubare tessuti per 1 ora a temperatura ambiente con 1: 100 monoclonale anti-BrdU in PBS + 0,1% saponina + 2% BSA + 5% NGS. Lavare i tessuti con PBS + 0,1% saponina (3 x 10 min). </li><li> Per l&#39;etichettatura anticorpo secondario, incubare tessuti per 1 ora a temperatura ambiente con 1: anticorpi 100 di capra anti-topo Cy3-coniugati (GAM-Cy3) in PBS + 0,1% saponina + 2% BSA + 5% NGS. Lavare i tessuti con PBS + 0,1% saponina (3 x 10 min). </li><li&gt; incubare tessuti per 30 min a temperatura ambiente con 01:40 lectina FITC-coniugato in PBS seguito da due lavaggi con PBS. </li><li> Per montare le diapositive, i tessuti di copertura con 50:50 PBS e soluzione di glicerolo e luogo coprioggetto sulla parte superiore. Sigillare i bordi di scorrimento con smalto. </li></ol></li><li> BSI-lectina / etichettatura CD11b <ol><li> Stendere i tessuti su un vetrino da microscopio (1 - 2 tessuti / slide) e lasciare asciugare. Rimuovere il grasso in eccesso con un bisturi, premendo con forza per asportare il grasso. </li><li> Fix tessuti in metanolo freddo per 30 minuti a -20 ° C. Lavare i tessuti con PBS + 0,1% saponina (3 x 10 min). </li><li> Per l&#39;etichettatura anticorpo primario incubare tessuti per 1 ora a temperatura ambiente con 1: 100 topo anti-ratto CD11b in PBS + 0,1% saponina + 2% BSA + 5% NGS. Lavare i tessuti con PBS + 0,1% saponina (3 x 10 min). </li><li> Per l&#39;etichettatura anticorpo secondario incubare tessuti per 1 ora a temperatura ambiente con 1: 100 GAM-Cy3 in PBS + 0,1% saponina + 2% BSA + 5% NGS. Lavare i tessuti con PBS+ 0,1% saponina (3 x 10 min). </li><li> Incubare tessuti per 30 min a temperatura ambiente con 01:40 lectina FITC-coniugato in PBS seguito da due lavaggi con PBS. </li><li> Per montare le diapositive, i tessuti di copertura con 50:50 PBS e soluzione di glicerolo e luogo coprioggetto sulla parte superiore. Sigillare i bordi di scorrimento con smalto. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Carmeliet, P., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+in+cancer+and+other+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis in cancer and other diseases.</a> Nature. 407 (6801), 249-257 (2000).</li>
<li>Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+in+life%2C+disease+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis in life, disease and medicine.</a> Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).</li>
<li>Kaunas, R., Kang, H., Bayless, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+Regulation+of+Angiogenic+Sprouting+by+Biochemical+Factors+and+Wall+Shear+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Synergistic Regulation of Angiogenic Sprouting by Biochemical Factors and Wall Shear Stress.</a> Cell Mol Bioeng. 4 (4), 547-559 (2011).</li>
<li>Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+gene+targeting+in+the+neonatal+vasculature+and+analysis+of+retinal+angiogenesis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice.</a> Nat Protoc. 5 (9), 1518-1534 (2010).</li>
<li>Song, J. W., Munn, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+forces+control+endothelial+sprouting%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Fluid forces control endothelial sprouting.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (37), 15342-15347 (2011).</li>
<li>Chan, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+in+vitro+3D+capillary+beds+by+self-directed+angiogenic+sprouting%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Engineering of in vitro 3D capillary beds by self-directed angiogenic sprouting.</a> PLoS One. 7 (12), e50582(2012).</li>
<li>Peirce, S. M., Mac Gabhann, F., Bautch, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+experimental+and+computational+approaches+to+sprouting+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Hematol%22%5BJournal%5D)">Integration of experimental and computational approaches to sprouting angiogenesis.</a> Curr Opin Hematol. 19 (3), 184-191 (2012).</li>
<li>Stapor, P. C., Azimi, M. S., Ahsan, T., Murfee, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+angiogenesis+model+for+investigating+multicellular+interactions+across+intact+microvascular+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">An angiogenesis model for investigating multicellular interactions across intact microvascular networks.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304 (2), H235-H245 (2013).</li>
<li>Azimi, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ex+vivo+model+for+anti-angiogenic+drug+testing+on+intact+microvascular+networks%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An ex vivo model for anti-angiogenic drug testing on intact microvascular networks.</a> PLoS One. 10 (3), e0119227(2015).</li>
<li>Nicosia, R. F., Ottinetti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+microvessels+in+serum-free+matrix+culture+of+rat+aorta.+A+quantitative+assay+of+angiogenesis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Growth of microvessels in serum-free matrix culture of rat aorta. A quantitative assay of angiogenesis in vitro.</a> Lab Invest. 63 (1), 115-122 (1990).</li>
<li>Hutter-Schmid, B., Kniewallner, K. M., Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+brain+slice+cultures+as+a+model+to+study+angiogenesis+of+brain+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Organotypic brain slice cultures as a model to study angiogenesis of brain vessels.</a> Front Cell Dev Biol. 3, 52(2015).</li>
<li>Sawamiphak, S., Ritter, M., Acker-Palmer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+retinal+explant+cultures+to+study+ex+vivo+tip+endothelial+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation of retinal explant cultures to study ex vivo tip endothelial cell responses.</a> Nat Protoc. 5 (10), 1659-1665 (2010).</li>
<li>Unoki, N., Murakami, T., Ogino, K., Nukada, M., Yoshimura, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+imaging+of+retinal+angiogenesis+reveals+decreased+development+and+progression+of+neovascular+sprouting+by+anecortave+desacetate%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Time-lapse imaging of retinal angiogenesis reveals decreased development and progression of neovascular sprouting by anecortave desacetate.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (5), 2347-2355 (2010).</li>
<li>Norrby, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16989723">In vivo models of angiogenesis.</a> J Cell Mol Med. 10 (3), 588-612 (2006).</li>
<li>Kelly-Goss, M. R., Sweat, R. S., Azimi, M. S., Murfee, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+islands+during+microvascular+regression+and+regrowth+in+adult+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">Vascular islands during microvascular regression and regrowth in adult networks.</a> Front Physiol. 4, 108(2013).</li>
<li>Kelly-Goss, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+proliferation+along+vascular+islands+during+microvascular+network+growth%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cell proliferation along vascular islands during microvascular network growth.</a> BMC Physiol. 12, 7(2012).</li>
<li>Skalak, T. C., Price, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mechanical+stresses+in+microvascular+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">The role of mechanical stresses in microvascular remodeling.</a> Microcirculation. 3 (2), 143-165 (1996).</li>
<li>Kadohama, T., Nishimura, K., Hoshino, Y., Sasajima, T., Sumpio, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+different+types+of+fluid+shear+stress+on+endothelial+cell+proliferation+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of different types of fluid shear stress on endothelial cell proliferation and survival.</a> J Cell Physiol. 212 (1), 244-251 (2007).</li>
<li>Milkiewicz, M., Brown, M. D., Egginton, S., Hudlicka, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+between+shear+stress%2C+angiogenesis%2C+and+VEGF+in+skeletal+muscles+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Association between shear stress, angiogenesis, and VEGF in skeletal muscles in vivo.</a> Microcirculation. 8 (4), 229-241 (2001).</li>
<li>Corliss, B. A., Azimi, M. S., Munson, J. M., Peirce, S. M., Murfee, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages%3A+An+Inflammatory+Link+Between+Angiogenesis+and+Lymphangiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Macrophages: An Inflammatory Link Between Angiogenesis and Lymphangiogenesis.</a> Microcirculation. 23 (2), 95-121 (2016).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Questo protocollo documenta un metodo per l&#39;utilizzo del modello di cultura di ratto mesentere come uno strumento ex vivo per l&#39;imaging time-lapse di crescita della rete microvascolare. Impieghi precedenti nel nostro laboratorio ha stabilito l&#39;uso del nostro modello di 1) angiogenesi 8, 2) linfoangiogenesi 8, 3) periciti-endoteliali interazioni cellulare 8, e 4) anti-angiogenico test anti-droga 9. La poss...

Crescita della rete microvascolare e rimodellamento sono denominatori comuni per la funzione dei tessuti, la guarigione della ferita, e molteplici patologie e un processo chiave è l&#39;angiogenesi, definita come la crescita di nuovi vasi sanguigni da quelli esistenti 1, 2. Per Tissue Engineering nuovi vasi o la progettazione di terapie basate angiogenici, comprendendo l&#39;importanza delle dinamiche cellulari coinvolti nell&#39;angiogenesi è fondamentale. Tuttavia, questo processo è complesso. Può variare in punti specifici all&#39;interno di una rete microvascolare e coinvolge più tipi di cellule (ad esempio cellule endoteliali, cellule muscolari lisce, periciti, macrofagi, cellule staminali) e sistemi multipli (reti linfatici e reti neurali). Sebbene i modelli in vitro hanno contribuito enormemente ad esaminare il rapporto tra le diverse cellule coinvolte nell&#39;angiogenesi 3, la loro rilevanza fisiologica può essere compromessa a causa di thei<html> r limitata complessità e il fatto che essi non riflettono strettamente uno scenario in vivo. Per superare queste limitazioni, sistemi di coltura tridimensionale 3, ex vivo modelli di tessuto 4, sistemi microfluidici 5, 6, e 7 modelli di calcolo sono stati sviluppati e introdotti negli ultimi anni. Tuttavia, vi è ancora la necessità di un modello con funzionalità time-lapse per studiare l&#39;angiogenesi in reti microvascolari intatti ex vivo. La creazione di nuovi modelli di time-lapse per gli studi di angiogenesi con quel livello di complessità fornirà uno strumento prezioso per comprendere i meccanismi alla base che regolano l&#39;angiogenesi e per migliorare le terapie. Un modello potenziale che permette alla ex vivo indagini dell&#39;angiogenesi attraverso una rete microvascolare intatto è il modello di cultura mesentere ratto&gt; 8. Nel recente lavoro, abbiamo dimostrato che il sangue e le reti microvascolari linfatici rimangono vitali dopo la cultura. Ancora più importante, il mesentere modello di cultura del ratto può essere utilizzato per studiare le interazioni funzionali periciti-endoteliale di cellule del sangue, e le connessioni delle cellule endoteliali linfatiche, e time-lapse imaging. L&#39;obiettivo di questo lavoro è quello di fornire il nostro protocollo per il metodo time-lapse imaging. I nostri risultati rappresentativi documentano le molteplici tipi di cellule che rimangono vitali dopo la stimolazione dell&#39;angiogenesi con siero e offrono esempi di utilizzo di questo metodo per quantificare specifiche risposte angiogenici dei tessuti così come endoteliali studi di monitoraggio delle cellule.

<table><tbody><tr><td>Drappo</td><td>Cardinal Health</td><td>4012</td><td>12 "x 12" Bio-Shield Regular Sterilization Wraps</td></tr><tr><td>Scalpel Handle</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>RS-9843</td><td>Scalpel Handle, #3; Solido; lama chirurgica sterile da 4" di lunghezza</td></tr><tr><td></td><td>Cincinnati Surgical</td><td>0110</td><td>in acciaio inossidabile; Piatto di coltura misura 10</td></tr><tr><td>(60 mm)</td><td>Pinza per 130181 Thermo Scientific</td><td></td><td>10/Sleeve</td></tr><tr><td>Graefe (pinzette curve)</td><td>Strumento chirurgico Roboz</td><td>RS-5135</td><td>Pinza per micro dissezione; Seghettato; leggera curva; Larghezza della punta 0,8 mm; Pinza Graefe da 4" di lunghezza</td></tr><tr><td>(pinzette dritte)</td><td>Strumento chirurgico Roboz</td><td>RS-5130</td><td>Pinza per micro dissezione; seghettato, dritto; Larghezza della punta 0,8 mm; 4" di lunghezza</td></tr><tr><td>Noyes Micro Forbice</td><td>Roboz Strumento chirurgico</td><td>RS-5677</td><td>Noyes Micro Forbici a molla per dissezione; punte diritte, affilate-smussate; Tagliente da 13 mm; 0,25 mm di larghezza della punta, 4 1/2" di lunghezza totale</td></tr><tr><td>Garze</td><td>FisherBrand</td><td>13-761-52</td><td>Spugne di garza di cotone non sterili; 4" x 4" 12"</td></tr><tr><td>Applicatori in cotone</td> a 12 strati <td>FisherBrand</td><td>23-400-124</td><td>6" di lunghezza; fusto in legno; Piastra monouso a</td></tr><tr><td>6 pozzetti</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-49</td><td>Fondo piatto con coperchio a bassa evaporazione; Polistirene; Syring sterile apirogeno</td></tr><tr><td>5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-829-45</td><td>Luer-Lok</td></tr><tr><td>Tip Ciotola sterile</td><td>Medical Action Industries Inc.</td><td>01232</td><td>32 oz. Busta a buccia; Blu; Inserti sterili monouso</td></tr><tr><td>per piastre a 6 pozzetti (CellCrown Inserts)</td>Inserti per piastre a 6 pozzetti <td>SIGMA</td><td>Z681792-3EA</td><td>; Filtro a membrana in policarbonato non sterile</td></tr><tr><td></td><td>SIGMA</td><td>TMTP04700</td><td>Isopore Filtro a membrana; Policarbonato; Idrofilo; 5,0&nbsp; &micro; m, 47&nbsp; mm, Bianco Semplice</td></tr><tr><td><forte>Nome</forte></td><td><forte>Azienda</forte></td><td><forte>Numero di catalogo</forte></td><td><forte>Commenti/Descrizione</forte></td></tr><tr><td>Beuthanasia</td><td>Schering-Plough Animal Health Corp. Union (Ordinato da MWI Veterinary Supply)</td><td>MWI #: 011168</td><td>Principio attivo: Per 100 ml, 390 mg di pentobarbital sodico, 50 mg di fenitoina sodica&nbsp;</td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Fort Dodge Animal Health (Ordinato da MWI Veterinary Supply)</td><td>MWI #: 000680</td><td>Kateset 100 mg/mL</td></tr><tr><td>Xilazina</td><td>LLOYD. Inc. (Ordinato da MWI Veterinary Supply)</td><td>MWI #: 000680</td><td>Anased 100 mg/mL</td></tr><tr><td>Soluzione salina</td><td>Baxter</td><td>2F7122</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>Invitrogen</td><td>11095080</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>001-000-162</td><td></td></tr><tr><td>Saponina&nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>S7900-100G</td> Alcool isopropilico <td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>S25372</td><td></td></tr><tr><td>Operando povidone-iodio</td><td></td><td>82-226</td><td></td></tr><tr><td>Acido cloridrico</td><td>SIGMA</td><td>320331</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>56-81-5</td><td></td></tr><tr><td>FITC-coniugato Lectina</td><td>SIGMA</td><td>L9381-2MG</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NG2 Condroitina Solfato Anticorpo Proteoglicano</td><td>SIGMA</td><td>AB5320</td><td></td></tr><tr><td>PECAM (CD31) Anticorpo</td><td>BD Biosciences</td><td>555026</td><td></td></tr><tr><td>LYVE-1 Anticorpo</td><td>AngioBio Co.</td><td>11-034</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo coniugato Cy2 anti-coniglio di capra</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-585-144</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo coniugato Cy3 anti-topo di capra</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-227-003</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo coniugato Cy3 streptavidina Jackson</td><td>ImmunoResearch</td><td>016-160-084</td><td></td></tr><tr><td>Kit di vitalità/citotossicità vivo/morto</td><td>Invitrogen</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>Siero di capra normale&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>5-Bromo-2'-Deossiuridina</td><td>SIGMA</td><td>B5002</td><td></td></tr><tr><td>Monoclonale di Topo Anti-Bromodeossiuridina&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Clone Bu20a</td><td>Dako</td><td>M074401-8</td><td></td></tr><tr><td>Topo Anti-Topo CD11b&nbsp;</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA275R</td><td></td></tr></tbody></table>

un<em&gt; ex vivo</em&gt; metodo per time-lapse imaging di coltura rat mesenteriche microvascolari networks

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

L&#39;angiogenesi, definita come la crescita di nuovi vasi sanguigni da vasi preesistenti, coinvolge le cellule endoteliali, periciti, cellule muscolari lisce, cellule del sistema immunitario, e il coordinamento con i vasi linfatici e nervi. Il multi-cella, interazioni multi-sistema comportano la necessità di ricerca di angiogenesi in un ambiente fisiologicamente rilevanti. Così, mentre l&#39;uso di modelli di coltura cellulare in vitro hanno fornito intuizioni meccanicistici, una critica comune è che essi non riassumono la complessità associata con una rete microvascolare. L&#39;obiettivo di questo protocollo è quello di dimostrare la possibilità di fare confronti time-lapse di reti microvascolari intatte, prima e dopo la stimolazione dell&#39;angiogenesi nei tessuti di ratto coltivate mesentere. tessuti coltivati ​​contengono reti microvascolari che mantengono la loro gerarchia. etichettatura immunoistochimica conferma la presenza di cellule endoteliali, cellule muscolari lisce, periciti, vasi sanguigni e vasi linfatici. In unddition, etichettatura dei tessuti con BSI-lectina consente un confronto time-lapse di aree di rete locali prima e dopo la stimolazione siero o fattore di crescita caratterizzato da un aumento della germinazione capillare e densità dei vasi. Rispetto ai modelli comuni di coltura cellulare, questo metodo fornisce uno strumento per gli studi di lignaggio delle cellule endoteliali e specifica valutazione dei farmaci angiogenico tessuto in fisiologicamente rilevanti reti microvascolari.

Dopo 3 giorni in coltura, tessuti sono stati etichettati con un / morti kit di sopravvivenza / citotossicità diretta per dimostrare la fattibilità del microcircolo nel ratto mesentere cultura modello (Figura 2A). La maggior parte delle cellule presenti nel mesentere è rimasto vitale nella cultura in cui le cellule endoteliali sono stati individuati in base alla loro posizione nei segmenti microvascolari. Proliferazione delle cellule endoteliali è stata confermata anche m...

L'angiogenesi coinvolge interazioni multi-cellula e multi-sistema che devono essere studiate in un ambiente fisiologicamente rilevante. L'obiettivo di questo studio è dimostrare la capacità del modello di coltura del mesentere di ratto di effettuare confronti time-lapse di reti microvascolari intatte durante l'angiogenesi.

Un<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Metodo per Time-Lapse Imaging di coltura Rat mesenteriche microvascolari Networks

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è dimostrare l'utilizzo del modello di coltura del mesentere di ratto per l'analisi in time-lapse del rimodellamento della rete microvascolare ex vivo, al fine di valutare le interazioni tra parassiti e cellule endoteliali, le connessioni tra cellule endoteliali ematiche e linfatiche, oppure gli effetti di farmaci antiangiogenici. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo del rimodellamento microvascolare, come ad esempio: come fanno i vasi microscopici a sapere dove crescere, e qual è il destino dei segmenti cellulari endoteliali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che reti microvascolari reali e integre possono essere immaginate prima e dopo la crescita ex vivo.Il procedimento sarà dimostrato da Sadegh Azimi, uno studente laureato del nostro laboratorio che ha sviluppato il metodo. Iniziare posizionando una piattaforma in plexiglass sterilizzata con etanolo sopra un tappetino sterile assorbente e un ratto adulto maschio anestetizzato sopra la piattaforma. Disinfettare la regione addominale rasata del ratto con due salviette contenenti alcol isopropilico al 70%, seguite da povidone-iodio.Iniziando da un pollice sotto lo sterno, utilizzare un bisturi per praticare un'incisione lunga da tre quarti a un pollice e un quarto nell'intestino attraverso la pelle, il tessuto connettivo e il muscolo. Successivamente, posizionare un campo operatorio con un foro pre-tagliato sopra l'animale e collocare una piattaforma chirurgica sopra il campo operatorio, avendo cura di allineare le aperture di entrambi i materiali con l'incisione. Utilizzando applicatori sterili con estremit&agrave; in cotone, estrarre l'ileo attraverso l'apertura della piattaforma chirurgica insieme a sei-otto finestre mesenteriche.Utilizzare una siringa sterile per gocciolare soluzione fisiologica sterile a 37 gradi Celsius sui tessuti esposti secondo necessità. Quando tutte le finestre sono state esternalizzate, utilizzare pinzette per afferrare un cuscinetto adiposo e forbici per prelevare le finestre, lasciando un margine adiposo di due millimetri intorno a ciascun tessuto mesenterico. Prestare attenzione a non far toccare le pinzette alle finestre mesenteriche, toccando esclusivamente i margini adiposi circostanti.Lavare ogni frammento una volta in PBS a 37 gradi Celsius e una volta nel mezzo a 37 gradi Celsius man mano che vengono raccolti. Reintrodurre l'ileo nella cavità addominale dopo aver isolato tutti i frammenti. In un'appaio sterile a flusso laminare, utilizzare pinzette per trasferire ogni tessuto mesenterico dal bordo adiposo sulla membrana in policarbonato dell'inserto di una piastra per colture cellulari.Utilizzare il cuscinetto di grasso per stendere rapidamente i campioni di tessuto, avendo cura di non toccare le finestre. Quindi, capovolgere l'inserzione e posizionarla in una pozzetta di una piastra a sei pozzette in modo che il tessuto giaccia piatto sul fondo della pozzetta. Coprire il tessuto con tre millimetri di mezzo, e trasferire le restanti finestre nella piastra nello stesso modo.Quindi, coltivare le finestre del mesentere in condizioni standard di incubatore per colture cellulari fino a cinque giorni. Nel giorno dell'acquisizione delle immagini, aggiungere alle colture lectina BSI coniugata e reinserire la piastra nell'incubatore. Dopo 30 minuti, lavare i campioni due volte con mezzo privo di lectina e trasferire la piastra sul palco del microscopio a fluorescenza.Identificare i vasi sanguigni e linfatici in base alla loro morfologia e alla struttura della rete. Successivamente, individuare una regione di interesse della rete su ciascun tessuto per acquisire immagini, annotando la posizione per assicurarsi che la stessa area venga catturata nelle immagini successive. Una volta ottenute tutte le immagini, riporre i campioni nell'incubatrice fino alla successiva sessione di acquisizione o al termine sperimentale previsto.Dopo tre giorni di coltura, la maggior parte delle cellule presenti nel mesentere è vitale, con la presenza di cellule endoteliali confermata dalla loro localizzazione nei segmenti microvascolari. La proliferazione delle cellule endoteliali può essere inoltre confermata mediante etichettatura con lectina/BrdU, mentre la presenza di cellule muscolari lisce e parassiti lungo i vasi può essere confermata con etichettatura NG2. L'etichettatura della rete microvascolare linfatica e sanguigna ramificata conferma ulteriormente il mantenimento del fenotipo delle cellule linfatiche nel tessuto coltivato.L'aggiunta di siero al 10% al mezzo di coltura tissutale della finestra del mesentere per tre giorni induce una marcata risposta angiogenica, con nuovi segmenti vascolari e germogli capillari identificabili dopo cinque giorni di stimolazione. L'acquisizione di immagini in time-lapse consente la quantificazione del numero di vasi per area vascolare e del numero di germogli capillari per area vascolare a partire da un'immagine 4x per tessuto. Confronti in time-lapse di regioni della rete vascolare permettono inoltre il tracciamento di segmenti di cellule endoteliali e l'identificazione di un'errata conformazione dei vasi sanguigni e linfatici.Inoltre, l'etichettatura con lectina e Cd11b conferma ulteriormente la presenza di macrofagi residenti interstiziali nelle reti in rimodellamento. Una volta padroneggiata, questa tecnica dovrebbe poter essere completata in meno di quattro ore. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come isolare, coltivare e acquisire immagini in time-lapse di tessuti mesenterici di ratto.

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Research

Ricerca

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Un nuovo metodo versatile per l'osservazione del microcircolo è presentato. E 'considerato adatto per osservazione a lungo termine, e per la combinazione con interventi biologici pharmacophysiological o molecolare.

In vivo micro-circolazione di misura nel muscolo scheletrico da Intra-vitale Microscopia

Normale adulto tessuto vascolarizzato mammiferi che manca l'angiogenesi fisiologica e che non è stata esposta a un intervento chirurgico viene utilizzato per studiare: (i) l'avvio e lo sviluppo di angiogenesi in seguito alla somministrazione intraperitoneale di agenti di test, e (ii) la modifica di angiogenesi dopo somministrazione sistemica di selezionati agenti di test.

Rat mesentere angiogenesi Assay

Questo articolo descrive un semplice modello per stimolare l'angiogenesi nel mesentere ratto. Il modello produce aumenti drammatici nel capillare germinazione, zona vascolare e densità vascolare in un corso di tempo relativamente breve in un tessuto che permette la visualizzazione en faccia di intere reti microvascolari fino al livello di singola cellula.

Rat Esteriorizzazione mesentere: un modello per indagare le dinamiche cellulari coinvolti nell&#39;angiogenesi

La funzione delle cellule vascolari dipende dall'attività dei messaggeri intracellulari.  Qui descritto è un metodo di imaging ex vivo a due fotoni che consente la misurazione dei livelli intracellulari di calcio e ossido nitrico in risposta a stimoli fisiologici e farmacologici in singole cellule endoteliali e muscolari lisce di un'aorta isolata.

A due fotoni Imaging di Intracellulare Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Manipolazione e l&#39;ossido nitrico Produzione in endoteliale e della muscolatura liscia cellule di un isolato Rat Aorta

La tecnica Landis modificata consente la misurazione accoppiata della conducibilità idraulica di singoli microvasi nel mesentere di ratti normali e geneticamente modificati in condizioni di controllo e test utilizzando tecniche di microperfusione. Fornisce un metodo conveniente per valutare i meccanismi che regolano la permeabilità dei microvasi e lo scambio transvascolare in condizioni fisiologiche.

Microperfusione Tecnica per Indagare regolamento di microvasi permeabilità a Rat mesentere

Descriviamo un protocollo per monitorare il comportamento dei neutrofili e dei monociti nelle vene mesenteriche in condizioni stazionarie e infiammatorie utilizzando la microscopia confocale intravitale su topi anestetizzati.

Imaging neutrofili e monociti in mesenterica Veins intravitale Microscopia su topi anestetizzati in tempo reale

Questo protocollo descrive l'imaging videomicroscopia di topi transgenici che esprimono marcatori fluorescenti cellula-specifico. Videomicroscopia imaging fornisce un metodo non invasivo per osservazioni ad alta risoluzione in animali vivi utilizzando windows impiantabili attraverso il quale è possibile la visualizzazione microscopica dei processi. Questo metodo è particolarmente utile per studiare i processi longitudinali.

Videomicroscopia microscopia del sistema vascolare del tumore-associati utilizzando avanzate dorsale dello Skinfold finestra Chambers su topi transgenici fluorescenti

Questo manoscritto descrive protocolli di video microscopia in vitro per valutare la funzione vascolare nelle arterie di resistenza cerebrale del ratto. Il manoscritto descrive anche tecniche per la valutazione di densità del microvessel con aspersione di lectine e tessuto fluorescente contrassegnato utilizzando flussometria del Laser Doppler.

Valutazione dei meccanismi di controllo vascolare utilizzando Video microscopia del arterie di resistenza isolata dei ratti

Presentato qui è un protocollo per studiare il microcircolo coronarico nel tessuto cardiaco murino vivente monitorando ex vivo la pressione e il flusso di perfusione arteriosa che mantiene la pressione, così come i componenti dell'albero vascolare tra cui i letti capillari e i periciti, poiché l'arteria settale è cannulata e pressurizzata.

Misurazione dinamica e imaging di capillari, arterioli e periciti nel cuore del topo

Nel presente protocollo, la funzione di barriera endoteliale della ghiandola sottomandibolare (SMG) è stata valutata iniettando diversi traccianti fluorescenti pesati molecolari nelle vene angolari di modelli animali in vivo sotto un microscopio a scansione laser a due fotoni.

In vivo Rilevamento della permeabilità vascolare nella ghiandola sottomandibolare del topo

Questo protocollo presenta un metodo per indurre il danno da ischemia-riperfusione mesenterica e visualizzare le trappole extracellulari dei neutrofili (NET) nelle venule mesenteriche utilizzando la microscopia intravitale. Il flusso sanguigno nell'arteria mesenterica superiore è stato limitato per 1 ora, seguito da riperfusione, consentendo la quantificazione diretta dell'adesione leucocitaria e della NETosi.

Visualizzazione delle trappole extracellulari dei neutrofili nelle venule mesenteriche dopo danno da ischemia-riperfusione mesenterica tramite microscopia intravitale

Scopri il metodo di imaging time-lapse ex vivo per reti microvascolari mesenteriche di ratto. Questa tecnica consente di studiare l'angiogenesi e valutare gli effetti di farmaci anti-angiogenici in tempo reale.

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