Preparazione e valutazione di ^99m Tc marcato tridentate chelati di pre-targeting Utilizzando Bioorthogonal Chimica

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di produrre tetrazine marcate con tecnezio-99m per l'imaging pre-mirato utilizzando la chimica bioortogonale con biomolecole modificate trans-ciclooctene come vettori di targeting. Questo metodo fornisce una nuova importante piattaforma per lo sviluppo di nuovi radiofarmaci. Attraverso il pre-targeting, i complessi di tecnezio qui descritti possono essere utilizzati per visualizzare un'ampia gamma di organi, tessuti e biomarcatori.

Questa tecnica è vantaggiosa in quanto fornisce un robusto metodo graduale per produrre tetrazine radiomarcate con tecnezio-99m, l'isotopo medico più utilizzato in medicina diagnostica. Questa tecnica può essere utilizzata con diversi vettori di targeting, tra cui piccole molecole e anticorpi. Può essere utilizzato anche per la radioterapia scambiando il tecnezio con gli isotopi beta-emettitori del renio.

A dimostrare parte delle procedure sugli animali sarà Nancy Janzen, tecnico di biologia nel nostro laboratorio. Per iniziare la procedura di radiomarcatura, in una fiala per microonde, combinare otto milligrammi di boranocatonato di potassio, 15 milligrammi di carbonato di sodio, 20 milligrammi di tetraborato di sodio decaidrato e 25 milligrammi di tartrato di sodio di potassio tetraidrato. Spurgare la fiala con gas argon per 10 minuti.

Quindi, aggiungere alla fiala quattro millilitri di tecnezio-99m pertecnetato in soluzione salina allo 0,9% con un'attività di 1.110 megabecquerel. Caricare la miscela di reazione in un reattore a microonde e mescolare per 10 secondi. Quindi, riscaldare la miscela a 110 gradi Celsius per 3,5 minuti per ottenere il catione triaqua tricarbonil tecnezio-99m.

Aggiungere circa 400 microlitri di acido cloridrico molare per regolare il pH della soluzione da 3,5 a quattro. Successivamente, per ogni ligando della tetrazina, sciogliere due milligrammi di ligando in 250 microlitri di metanolo. Aggiungere 250 microlitri del complesso tecnezio-99m con un'attività di 74 megabecquerel a ciascuna soluzione di ligando.

Scaldare la miscela in un reattore a microonde a 60 gradi Celsius per 20 minuti. Per i ligandi della tetrazina con gruppi t-butilici, trasferire la soluzione da una fiala a microonde a una fiala a scintillazione da 20 millilitri, quindi far evaporare il solvente e risciogliere ciascun complesso in un millilitro di una soluzione uno-a-uno in volume di diclorometano e acido trifluoroacetico. Quindi, trasferire la soluzione in una fiala a microonde e riscaldare quei complessi in un reattore a microonde a 60 gradi Celsius per 6-10 minuti per de-proteggere i ligandi.

Raffreddare i complessi a temperatura ambiente, quindi far evaporare il solvente. Risciogliere i residui in 500 microlitri di una soluzione acquosa uno a uno di acetonitrile o metanolo e acqua prima di procedere alla purificazione HPLC. Utilizzare l'HPLC a fase inversa C18 per purificare ciascun complesso di tetrazina radiomarcato con un gradiente di eluizione compreso tra 30 e 70 e tra 40 e 60 acetonitrile in acqua per 20 minuti con acido trifluoroacetico allo 0,1% presente nell'eluente in tutto il dispositivo.

Raccogliere il prodotto purificato quando viene mostrato che elude nella traccia gamma. Quindi, co-iniettare ogni complesso marcato con una soluzione di 0,125 milligrammi del corrispondente complesso radio-tetrazina in 20% di metanolo in acqua. Confrontare i tempi di ritenzione del picco del complesso del renio nella traccia UV e del picco del complesso tecnezio nella traccia gamma per verificare l'identità del picco gamma.

Rimuovere il solvente da ogni complesso tecnezio-tetrazina purificato. Formulare ciascun complesso a una concentrazione di 7,4 kilobecquerel per microlitro in soluzione salina tamponata con fosfato con lo 0,5% di albumina sierica bovina e lo 0,01% di polisorbato 80. Per ogni soggetto topo, aspirare in una siringa 100 microlitri di una soluzione da cinque microgrammi per microlitro del derivato TCOPB in soluzione fisiologica per preparare una dose di 20 milligrammi per chilogrammo.

Collegare un ago calibro 30 alla siringa dosatrice. Posizionare il soggetto del mouse in un dispositivo di ritenuta fisico. Identifica le vene sulla superficie laterale della coda a circa due centimetri dall'estremità della coda e pulisci l'area con un tampone imbevuto di alcol.

Inserire l'ago della siringa con un angolo poco profondo parallelo alla vena. Iniettare lentamente il derivato TCOBP. Rimuovere l'ago e applicare una spugna di garza pulita con una leggera pressione sul sito di iniezione fino a quando l'emorragia non si ferma.

Un'ora dopo l'iniezione del derivato TCOBP, somministrare una dose di 100 microlitri del complesso di tecnezio-99m tetrazina desiderato con un'attività di circa 0,74 megabecquerel mediante iniezione della vena caudale. Utilizzare un calibratore di dose per misurare l'attività di un campione di prova da 100 microlitri del complesso tecnezio al momento dell'iniezione. Conservare il campione di prova per misurazioni successive.

Anestetizzare il topo con una miscela di gas al 3% di isoflurano e ossigeno al 2% sei ore dopo l'iniezione. Posiziona il topo sulla schiena con il naso nel cono del naso per continuare l'anestesia e individua il processo xifoideo. Collegare un ago calibro 25 a una siringa pretrattata con eparina.

Inserire l'ago con un angolo di 20 gradi sotto il processo xifoideo, leggermente a sinistra della linea mediana. Una volta che l'ago è completamente inserito, estrarre lentamente lo stantuffo per verificare la presenza di sangue nel mozzo dell'ago, confermando l'avvenuta perforazione cardiaca. Regolare nuovamente l'ago secondo necessità.

Una volta che il cuore è stato perforato, aspirare lentamente un millilitro di sangue nella siringa. Trasferire il campione di sangue in una provetta per conteggio pre-pesata. Sopprimere il topo mediante lussazione cervicale mentre è sotto anestesia.

Metti l'animale soppresso in un sacchetto di plastica e misura l'attività di tutto il corpo con un calibratore di dose. Quindi, raccogli le ossa del ginocchio e della spalla, la cistifellea, i reni, il fegato, la tiroide e la trachea e la coda. Insieme al loro contenuto, raccogli lo stomaco, l'intestino tenue, l'intestino crasso e il cieco e la vescica urinaria.

Sciacquare il sangue da tutti i tessuti raccolti, ad eccezione della bile e della vescica urinaria, in soluzione salina tamponata con fosfato. Asciugare i fazzoletti e metterli in una provetta per conteggio pre-pesata. Misurare l'attività residua della carcassa.

Pesare ogni campione di tessuto e calcolare la massa del tessuto da solo. Utilizzare un contatore gamma multi-rivelatore per misurare l'attività di un'aliquota di cinque microlitri del campione di prova del complesso tecnezio. Utilizzando il valore ottenuto in conteggi al minuto e l'attività misurata al momento dell'iniezione, calcolare un fattore di conversione.

Misura l'attività di ogni campione di tessuto e fluido con il rivelatore gamma. Converti i valori in microcurie e normalizza ogni valore in base al peso dell'organo per determinare la percentuale di dosi iniettate per grammo di tessuto. Ripetere questo processo con altri topi senza l'iniezione del derivato TCOPB come serie di controllo negativo.

Utilizzando questo metodo, cinque complessi di tetrazina che differiscono nelle loro combinazioni di linker e key-leader sono stati marcati con tecnezio-99m. Un derivato del TCOPB, che si localizza nelle regioni ad alto turnover di calcio nell'osso, è stato utilizzato per pre-colpire le articolazioni della spalla e del ginocchio dei topi. I rapporti tra la percentuale di dose iniettata per grammo di tessuto per osso e sangue sono stati calcolati per ciascun composto di tetrazina.

Tutti e cinque i composti hanno eliminato rapidamente il sangue e hanno preso di mira l'osso, indicando che la reazione di accoppiamento bioortogonale selettivo tra i composti della tetrazina e il derivato TCOBP si era verificata in vivo. Il composto tre ha mostrato la migliore combinazione di targeting e rimozione dal sangue. Gli esperimenti di controllo negativo hanno indicato che i complessi di tetrazina radiomarcati non si localizzavano significativamente nell'osso in assenza del derivato TCOBP.

Ad esempio, quando il derivato TCOBP non è stato somministrato, il composto due aveva livelli elevati nella cistifellea e nell'intestino, ma molto poco nelle ossa. È stata osservata un'ampia variazione nella localizzazione tissutale nei topi che hanno ricevuto il derivato TCOBP tra i cinque composti testati. Ad esempio, molto poco del composto tre è stato visto nell'intestino crasso, nel fegato o nelle urine e nella vescica rispetto ad altri complessi, mentre molto di più del composto tre è stato visto nelle ossa.

Una volta padroneggiata, la tecnica di etichettatura qui descritta può essere eseguita dall'inizio alla fine in meno di due ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa tecnica, è importante assicurarsi che tutti i reagenti siano pesati accuratamente e che i sali vengano spurgati con argon prima di essere aggiunti alla soluzione di tecnezio. È inoltre fondamentale che il pH della soluzione di tecnezio sia regolato da 3,5 a quattro prima dell'aggiunta del legante della tetrazina.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione su come preparare e purificare le tetrazine marcate con tecnezio e su come possono essere utilizzate per creare nuovi radiofarmaci utilizzando il pre-targeting e la chimica bioortogonale. Non dimenticare di prendere le dovute precauzioni quando si lavora con la radioattività, come capire il tipo di radiazione emessa e come schermare e gestire al meglio i campioni.