Name: Preparazione e valutazione di 99m Tc marcato tridentate chelati di pre-targeting Utilizzando Bioorthogonal Chimica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 54 s
Description: Impara a marcare tetrazine con tecnezio-99m per imaging pre-targeting mediante chimica bioortogonale. Questo metodo consente di visualizzare organi e tessuti con elevata specificità diagnostica.

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Questo lavoro è supportato da sovvenzioni per la ricerca del Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) del Canada, dell'Ontario Institute for Cancer Research (OICR, #P.SI.015.8) e della Canadian Cancer Society (CCS, #703857). Gli autori riconoscono il contributo del Dr. Denis Snider che ha fornito assistenza nella preparazione del manoscritto.

Gli studi sugli animali sono stati approvati dal Consiglio di Ricerca Etica degli animali alla McMaster University in accordo con il Consiglio Canadese Animal Care (CCAC) le linee guida. 1. radiomarcatura di ligandi Tz-tridentati con 99m Tc NOTA: Le seguenti procedure richiedono l&#39;uso di composti radioattivi. Il lavoro dovrebbe essere fatto solo in un laboratorio autorizzato con aderenza alle norme di sicurezza e di smaltimento. reazioni microonde devono essere eseguiti in un forno a microonde specificamente progettato per sintesi chimica. <ol><li> Sintesi di [99m Tc (CO) 3 (H 2 O) 3] + 19, 20 <ol><li> In una fiala forno a microonde, unire 8 mg K 2 [BH 3 CO 2], 15 mg di Na 2 CO 3, 20 mg di Na 2 B 4 O 7 · 10H 2 O, e 25 mg KOCO [CH (OH)]2 COONa · 4H 2 O. spurgo la fiala per 10 minuti con gas argon. </li><li> Aggiungere 4 ml di 99m TcO 4 - (~ 1.100 MBq, ~ 30 MCI) in soluzione fisiologica 0,9% al flaconcino. </li><li> Riscaldare la reazione in un forno a microonde per 3,5 min a 110 ° C dopo 10 s di agitazione per assicurare una completa miscelazione dei reagenti. </li><li> Regolare il pH della soluzione a 3,5-4 utilizzando ~ 400 ml di 1 M HCl. Verificare utilizzando carta pH. </li></ol></li><li> Radiomarcatura di tetrazina ligandi 1-5 <ol><li> Sciogliere 2 mg di ciascun ligando (composti 1-5) in 250 ml MeOH 21. </li><li> Aggiungere 250 ml di [99m Tc (CO) 3 (H 2 O) 3] + (~ 74 MBq, ~ 2 MCI) a ogni soluzione. </li><li> Riscaldare la miscela di reazione utilizzando un forno per 20 minuti a 60 ° C. NOTA: Questo passaggio era identica per tutti i 5 tetrazines. </li><li> Per composti 2- 5, si evapora il solvente e re-dissolve i prodotti risultanti in 1 ml di 1: 1 v / v DCM: TFA. </li><li> Riscaldare i prodotti di reazione disciolti (2-5) a 60 ° C in un forno a microonde per 6 minuti (2-4) o 10 min (5). </li><li> Dopo raffreddamento a temperatura ambiente, si evapora il solvente usando un evaporatore (36 ° C, 8 mbar, 3 min, 6.000 rpm) e sciogliere il composto essiccato in 1: 1 ACN: H 2 O o 1: 1 MeOH: H 2 O, prima purificazione HPLC. </li><li> Purificare i 99m Tc-marcato composti (1-5), tra cui la separazione del prodotto etichettato da senza etichetta ligando tetrazina, utilizzando HPLC (C 18 in fase inversa). Tipicamente, utilizzare un gradiente di eluizione di 30:70 ACN: H 2 O (entrambi con 0,1% TFA) a 40:60 ACN: H 2 O oltre 20 min (18 min) e una analitica colonna C 18 4,6 x 100 mm. Utilizzare sia UV (254 nm) e la rilevazione di gamma. <ol><li> Prendere un piccolo campione di ciascun prodotto etichettato e confrontare il suo tempo di ritenzione HPLC a quella di un co-injette, non radioattivo, standard di Re-marcato (0,125 mg nel 20% di metanolo-H 2 O). Lo standard Re-marcato è identificato nella traccia UV HPLC, e verrà eluire al tempo stesso come il 99m Tc composto marcato nella traccia γ-HPLC. Questa co-iniezione mostra picchi a tempi di ritenzione comparabili, confermando l&#39;identità del 99m Tc-etichettato compound. </li></ol></li><li> Evaporare il solvente dalle frazioni HPLC utilizzando un evaporatore (36 ° C, 8 mbar, 3 min, 6,000 rpm). </li><li> Formulare il composto purificato ad una concentrazione di 7,4 kBq / ml in PBS, contenente 0,5% di BSA e 0,01% Tween-80. </li><li> Per garantire i composti marcati sono stabili, effettuare uno studio in vitro stabilità. Incubare il composto formulato a 37 ° C per 1, 4 e 6 h, iniettando una piccola quantità (3,7 MBq) della miscela sulla HPLC ad ogni tempo per valutare la stabilità. </li></ol></li></ol> 2. Studi Bio-Pre-distribuzione mirati <ol><li&gt; Preparazione degli animali <ol><li> Utilizzando 7-9 settimane di età, i topi femmina BALB / c (n = 3), amministrare TCO-BP formulato in soluzione salina (20 mg / kg) (5 mg / mL), mediante iniezione coda vena. </li><li> Posizionare il mouse in un dispositivo di contenzione fisica, e identificare le vene situate sulle superfici laterali della coda e pulire con un tampone imbevuto di alcol. A circa 2 cm dall&#39;estremità della coda, inserire un ago da 30 gauge con un angolo basso, parallelamente alla vena. Premere lentamente lo stantuffo per iniettare, rimuovere l&#39;ago ed applicare pulita garza al sito di iniezione con una leggera pressione fino a quando si arresta l&#39;emorragia. </li><li> Al 1 ore dopo l&#39;iniezione di TCO-BP, amministrare ~ 0,74 MBq (20 pCi) di 99m Tc-tetrazina formulati in 100 ml di 0,5% di BSA, 0,01% di Tween-80 in PBS, tramite iniezione coda vena. </li></ol></li><li> Studi Bio-distribuzione <ol><li> Al punto di tempo desiderato (t = 6 h), anestetizzare i topi utilizzando 3% isoflurano e miscela gassosa di ossigeno 2%. Dimostrare un ae un pizzico di ritiro sul mouse anestetizzato per assicurare che siano in aereo chirurgico di anestesia. </li><li> Raccogliere il sangue (1 mL) mediante puntura cardiaca usando una siringa pre-trattati con eparina. Posizionare il mouse sul dorso con il naso nel cono di naso per continuare l&#39;anestesia e individuare il processo xifoideo sull&#39;animale. <ol><li> Inserire un ago G 25, leggermente a sinistra della linea mediana dell&#39;animale sotto il processo xifoideo, ad un angolo di 20 °. Inserire completamente l&#39;ago, e lentamente tirare indietro lo stantuffo per vedere il sangue nel mozzo ago se il cuore è stato perforato. Leggermente regolare nuovamente l&#39;ago tenendo lo stantuffo se necessario, forare il cuore. Lentamente prelevare il sangue nella siringa. </li></ol></li><li> Eutanasia dell&#39;animale mediante dislocazione cervicale, mentre sotto anestesia. </li><li> Mettere ogni animale in un sacchetto di plastica e utilizzare un calibratore di dosi (99m impostazione Tc) per misurare tutto il livello di attività del corpo. </li><li> Raccogliere i seguenti tessuti e fluidi in pre-pesareEd contando tubi: sangue, midollo (ginocchio e della spalla), cistifellea, reni, fegato, dello stomaco (con il contenuto), piccolo intestino (con il contenuto), intestino crasso e cieco (con il contenuto), tiroide e trachea, vescica urinaria con l&#39;urina , e la coda. </li><li> Risciacquare tessuti idonei (ad esclusione del sangue, della cistifellea e vescica urinaria) in PBS per rimuovere il sangue e asciugare prima di mettere i tessuti nelle provette di conteggio appropriati. </li><li> Mettere carcassa animale in un sacchetto di plastica e misurare l&#39;attività residua di tutto il corpo con un calibratore di dosi. </li><li> Pesare ciascuna provetta contenente un campione di tessuto. Sottrarre peso iniziale del tubo per ottenere la massa del tessuto. </li><li> Utilizzare un calibratore di dosi (99m Tc impostazione) per misurare la quantità di attività in un campione di prova (100 mL) al momento dell&#39;iniezione per ogni mouse. NOTA: Questo campione è uguale al volume di iniezione, dando così il conteggio attività al momento dell&#39;iniezione. </li><li> Al momento della misurazione del tessuto, unliquot 5 ml di campione usato in precedenza. Utilizzare un contatore gamma multi-detector (99m impostazione Tc) e contare per ottenere il conteggio al minuto (CPM) per il campione 5 ml. </li><li> Utilizzare i due valori ottenuti in 2.2.9 e 2.2.10 per calcolare l&#39;attività e rapporto CPM con l&#39;equazione 1 per ottenere un fattore di conversione (CPM pCi -1). (1) <img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/55188/55188eq1.jpg" /></li><li> Utilizzare il contatore gamma per misurare la quantità di radioattività in ogni tessuto o campione di fluido. </li><li> Utilizzare equazione 1 per calcolare la quantità di attività in ciascun tessuto o fluido al momento della misura relativa alla dose totale iniettata. Questo valore viene quindi normalizzata per il peso degli organi e riportato come la dose percentuale iniettata per grammo (cioè,% ID / g) di tessuto. </li><li> Seguire i passaggi 2.1.2 a 2.2.13 per condurre un esperimento di controllo negativo utilizzando i 99m Tc-marcato ligandi tetrazina nel Absence di TCO-BP. topi sacrificio (n = 3) a 0.5, 1, 4 e 6 ore dopo l&#39;iniezione ed ottenere tessuti o fluidi come sopra descritto. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Una collezione di tetrazina linked chelati tridentati di polarità variabile è stata preparata, e l&#39;utilità dei loro complessi 99m Tc nella reazione IEDDA con un derivato TCO in vivo è stata valutata. Un metodo di etichettatura 99m Tc efficace e riproducibile stato sviluppato per cinque tetrazina chelati, dove la concentrazione del ligando era 10 -3 M. Il passo etichettatura è stata seguita da deprotezione del t-butil (per i composti 2-5). L&#39;elev...

99m Tc rimane il radioisotopo dominante utilizzato in medicina nucleare diagnostica, con oltre 50 milioni di procedure di imaging condotti ogni anno in tutto il mondo 1, 2, 3. La maggior parte degli agenti 99m Tc usati clinicamente sono di tipo perfusione radiofarmaci. Ci sono un numero limitato di composti mirati attivamente in cui 99m Tc è diretto ad associare un biomarker specifico mediante legatura ad un costrutto targeting. La creazione di 99m mirata Tc radiofarmaci è spesso ostacolato dalla influenza di 99m complessi Tc-ligando sulla capacità della molecola targeting impegnare la biomarker di interesse, o gli isotopi emivita non è sufficiente per l&#39;utilizzo con elevate biomolecole peso molecolare come gli anticorpi. Quest&#39;ultimo richiede tipicamente diversi giorni prima immagini sono acquisite in modo che la biomolecola cancellare da non bersaglio tiss<html> UES. Pre-targeting offre un approccio alternativo per superare queste sfide. Pre-targeting combinato con la chimica bioorthogonal ha dimostrato di essere un modo efficace per sviluppare nuove sonde imaging molecolare sia per fluorescenza e radio imaging 4, 5, 6, 7, 8. La domanda di elettroni inversa Diels-Alder (IEDDA) reazione tra 1,2,4,5-tetrazina (Tz) e derivati -cyclooctene trans (TCO), come mostrato nella Figura 1, ha dimostrato di essere particolarmente efficace 6. La reazione IEDDA con questi componenti può esibire una rapida cinetica in PBS (k 2 ≈ 6.000 M -1 s -1) e alta selettività, che lo rende ideale per in vivo pre-targeting applicazioni 9, 10. e_content &quot;&gt; L&#39;approccio più comune utilizzato implica la gestione di un vettore targeting TCO-derivati e dopo un periodo di ritardo sufficiente, un tetrazina radioattivo viene somministrato. tetrazines radioattivo sulla base di 11 C, 18 F, 64 Cu, 89 Zr, e 111 sono stati segnalato 11, 12, 13, 14, 15. al contrario, c&#39;è solo un rapporto di un 99m Tc-etichettato Tz, che è stato preparato utilizzando un tipo ligando HYNIC richiedere l&#39;uso di co-ligandi per prevenire legame proteico e la degradazione in vivo 16. in alternativa, riportiamo qui la sintesi di 99m Tc (I) etichettato tetrazines utilizzando una famiglia di leganti che formano complessi stabili con tridentati [99m Tc (CO) 3] + nucleo. Figura 1: La reazione IEDDA bioorthogonal tra tetrazina e -cyclooctene trans. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55188/55188fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> La famiglia di leganti preparati contengono chelati tridentati che variano in polarità e la natura del gruppo linker tra la regione di legame del metallo e Tz (Figura 2). L&#39;obiettivo era quello di individuare una 99m Tc-tetrazina costrutto che potrebbe efficacemente localizzare e reagire con i siti TCO-etichettati in vivo e rapidamente chiaro non collegate, al fine di produrre alta target-to-non-bersaglio rapporti. Per testare i ligandi, un TCO-derivato di un bisfosfonato (TCO-BP) è stato utilizzato 17. Abbiamo dimostrato in precedenza che il TCO-BP localizza alle aree di metabolismo osseo attivo e può reagire contetrazines radiomarcati in vivo 18. È un reagente conveniente per testare nuove tetrazines, perché può essere preparato in un&#39;unica fase e gli esperimenti può essere eseguita in topi normali dove localizzazione luogo soprattutto nelle articolazioni (ginocchia e spalle).

<table><tbody><tr><td>Gas argon</td><td>Alphagaz</td><td>---</td><td>---</td></tr><tr><td>Na2CO3</td><td>EMD Millipore</td><td>106395</td><td>---</td></tr><tr><td>Na2B4O7&#183; 10H2O</td><td>Anachemia</td><td>S9640</td><td>---</td></tr><tr><td>KNaC4H4O6&#183; 4H2O</td><td>Anachemia</td><td>217255</td><td>---</td></tr><tr><td>Technelite 99mTc generatore</td><td>Lantheus imaging medico Lantheus</td><td>---</td><td>Fonte di 99mTcO4-</td></tr><tr><td>0,9% Salino</td><td>Lantheus imaging medico</td><td>---</td><td>Per eluire il generatore</td></tr><tr><td>1 M HCl</td><td>Lab Chem</td><td>---</td><td>---</td></tr><tr><td>MeOH</td><td>Caledon</td><td>---</td><td>---</td></tr><tr><td>ACN</td><td>Caledon</td><td>---</td><td>HPLC</td></tr><tr><td>grado Millipore H2O</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Barnstead Nanopure</td><td>---</td></tr><tr><td>DCM</td><td>Caledon</td><td>---</td><td>---</td></tr><tr><td>TFA</td><td>Caledon</td><td>---</td><td>---</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td>pH 7,4 1x</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7906</td><td>---</td></tr><tr><td>Tween80</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8047</td><td>---</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>CDMV</td><td></td><td>108737 Fornitore: Fresenius Kabi Animal Health</td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Waters</td><td>1525 Binary Pump, 2998 Photodiodde Array Detector, E-SAT/IN, Bioscan Flowcount PMT detector (articolo # 15590)</td><td>---</td></tr><tr><td>Colonna HPLC per analisi e purificazione di composti 2-4</td><td>Phenomenex</td><td>00G-4435-E0</td><td>Gemini&reg; 5 &micro; m C18 110&nbsp; &Aring;, Colonna LC 250 x 4,6 mm</td></tr><tr><td>Colonna HPLC per analisi e purificazione di composti 1 e 5</td><td>Acque&nbsp;</td><td>186003115</td><td>XBridge BEH C18 Colonna, 130 &Aring;, 5 &5; m, reattore a microonde da 4,6 mm x 100 mm</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Biotage&nbsp;</td><td>Iniziatore 8</td><td>---</td></tr><tr><td>Biotage V10 Evaporatore</td><td>Biotage&nbsp;</td><td>Numero di serie # V1041</td><td>---</td></tr><tr><td>Calibratore di dose</td><td>Capintec, Inc.</td><td>CRC-25R</td><td>---</td></tr><tr><td>Contatore gamma</td><td>Perkin Elmer</td><td>Wizard 1470 Contatore gamma automatico</td><td></td></tr><tr><td>---Bilancia per ambienti animali&nbsp;</td><td>Mettler Toledo</td><td>XP105 Delta Range</td><td></td></tr><tr><td>---Fiale per microonde&nbsp;</td><td>Biotage&nbsp;</td><td>355629</td><td>0,5-2 ml</td></tr></tbody></table>

preparazione e valutazione di<sup&gt; 99m</sup&gt; tc marcato tridentate chelati di pre-targeting utilizzando bioorthogonal chimica

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

Il pre-targeting combinato con la chimica bioortogonale sta emergendo come un modo efficace per creare nuovi radiofarmaci. Tra i metodi disponibili, la cicloaddizione di Diels-Alder a domanda di elettroni inversa (IEDDA) tra tetrazine radiomarcate e trans-ciclooctene (TCO) legata a una biomolecola si è dimostrata un approccio bioortogonale altamente efficace per l'imaging di specifici bersagli biologici. Nonostante il fatto che il tecnezio-99m rimanga l'isotopo più utilizzato nella medicina nucleare diagnostica, c'è una scarsità di metodi per preparare tetrazine marcate con 99mTc. Qui riportiamo la preparazione di una famiglia di derivati tridentati-chelati-tetrazina e dei loro complessi Tc(I). Questi composti, finora sconosciuti, sono stati radiomarcati con 99mTc utilizzando un metodo assistito da microonde con una resa radiochimica compresa tra il 31% e l'83%. I prodotti sono stabili in soluzione salina e PBS e reagiscono rapidamente con i derivati TCO in vitro. Le loro capacità di pre-targeting in vivo sono state dimostrate utilizzando un derivato TCO-bifosfonato (TCO-BP) che si localizza nelle regioni del metabolismo osseo attivo o del danno. Negli studi murini, le Tc-tetrazine 99mhanno mostrato alte concentrazioni di attività nelle ginocchia e nelle articolazioni della spalla, che non sono state osservate quando gli esperimenti sono stati eseguiti in assenza di TCO-BP. L'assorbimento complessivo negli organi non bersaglio e la farmacocinetica variavano notevolmente a seconda della natura del linker e della polarità del chelato.

I leganti sono stati sintetizzati utilizzando diversi linker e chelanti tramite una semplice strategia amminazione riduttiva (figura 2), seguita da accoppiamento del prodotto ad un tetrazina disponibile in commercio 22, 23. Radiomarcatura è stata effettuata utilizzando lo stesso metodo per tutti i composti ed era altamente riproducibile. Il processo è stato ottimizzato variando il pH, quantità di ligando, tempo d...

Qui, descriviamo un protocollo per la radiomarcatura e il test in vivo di derivati tridentati 99mTc(I) chelato-tetrazina per il pre-targeting e la chimica bioortogonale.

Preparazione e valutazione di<sup&gt; 99m</sup&gt; Tc marcato tridentate chelati di pre-targeting Utilizzando Bioorthogonal Chimica

Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the ...

L'obiettivo generale di questa procedura è produrre tetrazine marcate con tecnezio-99m per l'imaging pre-targetizzato, utilizzando una chimica bioortogonale con biomolecole modificate con trans-cicloottene come vettori di targeting. Questo metodo fornisce una piattaforma importante e innovativa per lo sviluppo di nuovi radiofarmaci. Grazie al pre-targeting, i complessi di tecnezio descritti qui possono essere utilizzati per immagini di una vasta gamma di organi, tessuti e biomarcatori.Questa tecnica presenta il vantaggio di fornire un metodo solido e passo dopo passo per produrre tetrazine radio-marcate con tecnezio-99m, l'isotopo medico più utilizzato nella medicina diagnostica. Questa tecnica può essere impiegata con diversi vettori mirati, inclusi molecole di piccole dimensioni e anticorpi. Può inoltre essere utilizzata per la radio-terapia sostituendo il tecnezio con isotopi del renio emettitori di particelle beta.Parte delle procedure sugli animali sarà dimostrata da Nancy Janzen, tecnico di biologia del nostro laboratorio. Per iniziare la procedura di marcatura radioattiva, in un vial da microonde, mescolare otto milligrammi di potassio boranocarbonato, 15 milligrammi di carbonato di sodio, 20 milligrammi di tetraborato di sodio decaidrato e 25 milligrammi di tartrato di potassio e sodio tetraidrato. Spurgare il vial con gas argon per 10 minuti.Quindi, aggiungere quattro millilitri di pertecnetato di tecnezio-99m in soluzione salina 0,9% con un'attività di 1.110 megabecquerel al flaconcino. Caricare la miscela di reazione in un reattore a microonde e agitare per 10 secondi. Successivamente, riscaldare la miscela a 110 gradi Celsius per 3,5 minuti per ottenere il catione triaqua tricarbonilico di tecnezio-99m.Aggiungere circa 400 microlitri di acido cloridrico uno molare per regolare il pH della soluzione da 3,5 a 4. Successivamente, per ogni ligando tetrazinico, sciogliere due milligrammi di ligando in 250 microlitri di metanolo. Aggiungere 250 microlitri del complesso di tecnezio-99m con un'attività di 74 megabecquerel a ciascuna soluzione di ligando.Riscaldare la miscela in un reattore a microonde a 60 gradi Celsius per 20 minuti. Per i ligandi tetrazinici con gruppi protettivi t-butile, trasferire la soluzione da un vial per microonde a un vial per scintillazione da 20 millilitri, quindi evaporare il solvente e risolubilizzare ciascun complesso in un millilitro di una soluzione uno a uno in volume di diclorometano e acido trifluoroacetico. Successivamente, trasferire la soluzione in un vial per microonde e riscaldare tali complessi in un reattore a microonde a 60 gradi Celsius per sei-dieci minuti per rimuovere la protezione dai ligandi.Raffreddare i complessi a temperatura ambiente, quindi evaporare il solvente. Ricongelare i residui in 500 microlitri di una soluzione acquosa uno a uno di acetonitrile o metanolo e acqua prima di procedere alla purificazione mediante HPLC. Utilizzare una colonna C18 in fase inversa per purificare ciascun complesso di tetrazina radio-marcato con un gradiente di eluizione da 30 a 70, quindi da 40 a 60 di acetonitrile in acqua nell'arco di 20 minuti, in presenza di acido trifluoroacetico allo 0,1% nell'eluente per tutta la durata del processo.Raccogliere il prodotto purificato quando appare in uscita nel tracciato gamma. Quindi, iniettare contemporaneamente ciascun complesso marcato con una soluzione contenente 0,125 milligrammi del corrispondente complesso radio-tetrazina in acqua al 20% di metanolo. Confrontare i tempi di ritenzione del picco del complesso di renio nel tracciato UV e del picco del complesso di tecnezio nel tracciato gamma per verificare l'identità del picco gamma.Rimuovere il solvente da ciascun complesso purificato di tecnezio-tetrazina. Formulare ciascun complesso a una concentrazione di 7,4 kilobecquerel per microlitro in soluzione salina tamponata al fosfato contenente 0,5% di albumina sierica bovina e 0,01% di polisorbato 80. Per ogni soggetto murino, aspirare in una siringa 100 microlitri di una soluzione di derivato TCOPB a cinque microgrammi per microlitro in soluzione salina per preparare una dose di 20 milligrammi per chilogrammo.Collegare un ago da 30 gauge alla siringa per la somministrazione. Posizionare il topo nel dispositivo di contenimento fisico. Identificare le vene sulla superficie laterale della coda a circa due centimetri dall'estremità della coda e detergere l'area con un batuffolo di alcol.Inserire l'ago della siringa con un angolo poco profondo parallelo alla vena. Iniettare lentamente il derivato TCOBP. Rimuovere l'ago e applicare una garza pulita con una leggera pressione sul sito di iniezione fino a quando l'emorragia non si arresta.Un'ora dopo l'iniezione del derivato TCOBP, somministrare una dose di 100 microlitri del complesso tetrazina-tecnzio-99m desiderato con un'attività di circa 0,74 megabecquerel mediante iniezione nella vena della coda. Utilizzare un calibratore di dose per misurare l'attività di un campione di prova di 100 microlitri del complesso di tecnzio al momento dell'iniezione. Conservare il campione di prova per misurazioni successive.Anestetizzare il topo con una miscela gassosa di isoflurano al 3% e ossigeno al 2% sei ore dopo l'iniezione. Posizionare il topo supino con il naso nel cono nasale per mantenere l'anestesia e localizzare il processo xifoidale. Collegare un ago da 25 gauge a una siringa pretrattata con eparina.Inserire l'ago con un angolo di 20 gradi al di sotto del processo xifoidale, leggermente a sinistra della linea mediana. Una volta inserito completamente l'ago, ritirare lentamente lo stantuffo per verificare la presenza di sangue nel connettore dell'ago, confermando così una puntura cardiaca riuscita. Regolare nuovamente l'ago secondo necessità.Dopo aver perforato il cuore, aspirare lentamente un millilitro di sangue nella siringa. Trasferire il campione di sangue in un tubo per conteggio pre-pesato. Eutanasia il topo mediante dislocazione cervicale mentre è sotto anestesia.Posizionare l'animale eutanasizzato in un sacchetto di plastica e misurare l'attività dell'intero corpo con un calibratore di dose. Quindi, raccogliere le ossa del ginocchio e della spalla, la cistifellea, i reni, il fegato, la tiroide e la trachea, e la coda. Insieme al loro contenuto, raccogliere lo stomaco, l'intestino tenue, l'intestino crasso e il cieco, e la vescica urinaria.Risciacquare il sangue da tutti i tessuti raccolti, eccetto la colecisti e la vescica urinaria, in soluzione salina tamponata al fosfato. Asciugare i tessuti tamponandoli delicatamente, quindi posizionare ciascun tessuto in un tubo per conteggio pre-pesato. Misurare l'attività residua del cadavere.Pesare ogni campione di tessuto e calcolare la massa del tessuto singolo. Utilizzare un contatore gamma con multiplo rivelatore per misurare l'attività di un'aliquote di cinque microlitri del campione in esame del complesso di tecnezio. Utilizzando il valore ottenuto in conteggi al minuto e l'attività misurata al momento dell'iniezione, calcolare un fattore di conversione.Misurare l'attività di ciascun campione di tessuto e di fluido mediante il rilevatore gamma. Convertire i valori in microcurie e normalizzare ciascun valore rispetto al peso dell'organo per determinare la percentuale della dose iniettata per grammo di tessuto. Ripetere questo processo con ulteriori topi non iniettati con il derivato TCOPB come serie di controllo negativo.Utilizzando questo metodo, cinque complessi di tetrazina, diversi per le combinazioni tra linker e key-leader, sono stati marcati con tecnezio-99m. Un derivato del TCOPB, che si localizza nelle regioni con elevato turnover del calcio nell'osso, è stato utilizzato per pre-orientare le articolazioni della spalla e del ginocchio nei topi. Sono stati calcolati i rapporti tra la percentuale di dose iniettata per grammo di tessuto per l'osso e il sangue per ciascun composto di tetrazina.Tutti e cinque i composti sono stati rapidamente eliminati dal sangue e hanno bersagliato l'osso, indicando che la reazione di accoppiamento bioortogonale selettiva tra i composti tetrazinici e il derivato TCOBP si era verificata in vivo. Il composto tre ha mostrato la migliore combinazione di bersaglio e rimozione dal sangue. Gli esperimenti di controllo negativo hanno indicato che i complessi tetrazinici marcati radioattivamente non si localizzavano significativamente nell'osso in assenza del derivato TCOBP.Ad esempio, quando il derivato TCOBP non è stato somministrato, il composto due ha mostrato livelli elevati nella colecisti e nell'intestino, ma pochissimi nell'osso. È stata osservata una notevole variabilità nella localizzazione tissutale nei topi trattati con il derivato TCOBP tra i cinque composti testati. Ad esempio, quantità molto ridotte del composto tre sono state riscontrate nel colon, nel fegato e nelle urine e nella vescica rispetto agli altri complessi, mentre quantità molto maggiori del composto tre sono state osservate nell'osso.Una volta padroneggiata, la tecnica di marcatura qui descritta può essere eseguita da cima a fondo in meno di due ore, se realizzata correttamente. Durante il tentativo di applicare questa tecnica, è importante assicurarsi che tutti i reagenti siano pesati con precisione e che i sali siano spurgati con argon prima dell’aggiunta alla soluzione di tecnezio. È inoltre fondamentale che il pH della soluzione di tecnezio venga regolato a 3,5-4 prima dell’aggiunta del ligando tetrazina.Dopo aver visionato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare e purificare tetrazine marcate con tecnezio e di come possono essere utilizzate per creare nuovi radiofarmaci mediante chimica pre-targeting e bioortogonale. Non dimenticare di adottare le opportune precauzioni quando si lavora con radioattività, come comprendere il tipo di radiazione emessa e il modo migliore per schermare e manipolare i campioni.

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Sfruttando la domanda Bioorthogonal Inverse Electron Diels-Alder cicloaddizione per Pretargeted PET Imaging

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Il bioconjugation e radiosintesi di<sup&gt; 89</sup&gt; Anticorpi Zr-DFO-etichettati

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Un protocollo ottimizzato per la radiomarcatura efficiente di oro nanoparticelle utilizzando un<sup&gt; 125</sup&gt; Azide gruppo I-etichettati protesico

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Murino linfociti Etichettatura da<sup&gt; 64</sup&gt; Cu-anticorpo recettore Targeting per<em&gt; In Vivo</em&gt; Cell Traffico da PET / CT

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