Un cellulare semplice Red Blood Metodo Lysis per l'istituzione di B linfoblastoidi linee cellulari

L'obiettivo generale di questo semplice metodo è quello di stabilire linee cellulari linfoblastoidi B, o B-LCL, con un'elevata efficienza di immortalizzazione utilizzando solo una piccola quantità di sangue e risparmiando tempo tra l'inizio e la crioconservazione. Questo è un nuovo metodo per immortalare le cellule B umane dal sangue intero mediante la lisi dei globuli rossi. I B-LCL forniscono una preziosa fonte di biomateriali per condurre vari studi.

Il vantaggio principale di questo metodo è che solo 0,5 millilitri di sangue sono sufficienti per ottenere B-LCL con efficienza di immortalizzazione e alta vitalità cellulare. Per stabilire le B-LCL da parte del virus di Epstein-Barr, o EBV, trasformando i linfociti B, il metodo ampiamente utilizzato in cellule mononucleate separate del sangue periferico o PBMC, mediante centrifugazione a gradiente di densità di Ficoll. Tuttavia, quando il campione è inferiore a un millilitro di lisi dei globuli rossi, l'aggiunta fallirà.

Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando abbiamo capito che isolare la PBMC da piccoli globuli rossi è difficile utilizzando un metodo di separazione a gradiente di densità. Per preparare l'EBV, il primo giorno iniziare scongelando le cellule B95-8 e coltivarle in un pallone di coltura T25 in sei millilitri di terreno RPMI 1640 completo integrato con il 10% di FBS, due millimolari di L-glutammina e antibiotici. Incubare la coltura a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.

Il secondo giorno, al microscopio, osserva la morfologia cellulare. Le celle sono in buone condizioni quando sono luminose e rotonde. Aggiungere 10 millilitri di RPMI 1640 Medium completo alla coltura.

Il quarto giorno, aggiungere 10 millilitri di terreno fresco e trasferire le cellule in un pallone di coltura T75. Quindi, l'ottavo giorno, aggiungere 20 millilitri in più di terreno e mantenere le cellule per otto giorni senza aggiungere terreno fresco. Il giorno 16, controlla le cellule al microscopio.

Quindi raccogliere 12 millilitri di cellule in provette da centrifuga da 15 millilitri. Successivamente, crioconservare le cellule a meno 80 gradi Celsius per un'ora e scongelare rapidamente le colture a 37 gradi Celsius. Ripetere il congelamento e il disgelo, altre tre volte fino a quando le particelle virali non vengono rilasciate dalle cellule.

Centrifugare le colture a 240 volte g a temperatura ambiente per 10 minuti. Quindi, filtrare il surnatante attraverso un filtro da 0,22 micron. Aliquotare 12 millilitri di filtrato per provetta e conservare le provette a meno 80 gradi Celsius.

A una provetta da 50 millilitri, aggiungere 0,5 millilitri di sangue intero che è stato anticoagulato con EDTA K2. Aggiungere un millilitro di tampone di lisi dei globuli rossi a tutto il sangue e mescolare bene. Incubare la miscela a temperatura ambiente per quattro minuti. Quindi aggiungere rapidamente da cinque a sette millilitri di 1x PBS per fermare la reazione di lisi.

Dopo aver aggiunto il tampone di lisi dei globuli rossi al sangue, assicurarsi di mescolare bene. L'inversione assicura che la reazione venga terminata in modo tempestivo. Quindi, centrifugare la provetta a 240 volte g a temperatura ambiente per cinque minuti.

I globuli bianchi precipiteranno sul fondo della provetta. Scartare il surnatante e lavare il precipitato aggiungendo sette millilitri di 1640 Basic Medium. Quindi centrifugare la soluzione prima di ripetere il lavaggio.

Con 300 microlitri di terreno di trasformazione, risospendere il pellet cellulare. Quindi, per eseguire l'infezione da EBV, aggiungere 60 microlitri di 20 microgrammi per millilitro di ciclosporina A alla sospensione cellulare. Scongelare rapidamente un'aliquota di EBV a 37 gradi Celsius e aggiungere 240 microlitri di virus alle cellule.

Miscelare accuratamente la sospensione e trasferire 200 microlitri per pozzetto in una piastra da 96 pozzetti. Quindi incubare la piastra a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Per il primo mese dopo l'infezione da EBV, cambiare metà del terreno nella coltura cellulare una volta alla settimana.

Il settimo giorno, al microscopio è visibile solo uno spesso strato di frammenti cellulari. Dopo un mese dall'infezione, i cluster di cellule linfoblastoidi sono visibili sotto uno spesso strato di frammenti cellulari. Da questo punto in poi, cambiare metà del terreno ogni tre giorni fino a quando i gruppi di cellule sono chiaramente visibili al microscopio.

Dopo aver risospeso le cellule, trasferire la sospensione nei pozzetti di una piastra a 24 pozzetti. Quindi, a seconda del tasso di crescita cellulare, quando il terreno di coltura diventa giallo, raddoppiare il volume del terreno RPMI 1640 completo. Quando i cluster di cellule linfoblastoidi sono visibili ad occhio nudo, trasferire la coltura in un pallone di coltura T25.

Quando il terreno di coltura diventa giallo, raddoppiare il volume del terreno fino a quando il volume non si espande a 10-15 millilitri. Prima del congelamento, cambiare il mezzo 24 ore prima di un tempo. Quindi, per congelare le cellule, centrifugare la sospensione cellulare e utilizzare un contatore di cellule per contare le cellule.

Con la soluzione madre congelata contenente il 90% di FBS e il 10% di DMSO, regolare la sospensione a una densità da cinque a 10 volte da 10 a una sesta cellula per millilitro. Quindi congelare la sospensione a una velocità compresa tra un grado Celsius al minuto e meno 80 gradi Celsius prima di trasferire le cellule congelate direttamente nell'azoto liquido. Durante il processo di trasformazione, i cambiamenti morfologici delle cellule sono visibili al microscopio ottico.

Dopo sette giorni dall'infezione, piccoli gruppi di cellule sono chiaramente visibili utilizzando il metodo di separazione con gradiente di densità, mentre solo uno spesso strato di frammenti cellulari è visibile dal metodo di lisi dei globuli rossi. 30 giorni dopo l'infezione, i gruppi di cellule linfoblastoidi sono visibili sotto lo spesso strato di frammenti cellulari. Con cambi di terreno più frequenti, i detriti cellulari si riducono e i gruppi cellulari sono chiaramente visibili e hanno un aspetto simile alla coltura stabilita dalla separazione in gradiente di densità.

Infine, il test MTT è stato utilizzato per valutare la vitalità dei B-LCL. I risultati qui mostrati indicano che le cellule B-LCL coltivate con il metodo della lisi del sangue rosso erano significativamente più vitali rispetto alla coltura stabilita con il metodo di separazione con gradiente di densità. Una volta padroneggiato, il processo di trasformazione virale dell'EBV può essere eseguito in 30 minuti se eseguito correttamente.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come stabilire i B-LCL con un metodo di lisi dei globuli rossi semplice e che fa risparmiare tempo senza previa purificazione dei linfociti. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha accelerato il progresso dello studio genomico, trascrittomico e proteomico delle malattie associate all'EBV e questa applicazione nella produzione di anticorpi mononucleati. Non dimenticare che lavorare con agenti patogeni umani, come l'EBV, può essere estremamente pericoloso e le precauzioni dovrebbero essere sempre prese durante l'esecuzione di questa procedura.