Name: Un cellulare semplice Red Blood Metodo Lysis per listituzione di B linfoblastoidi linee cellulari (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Scopri un metodo semplice per stabilire linee cellulari B linfoblastoidi con alta efficienza di immortalizzazione utilizzando solo 0,5 millilitri di sangue intero. Questa tecnica riduce i tempi di preparazione e migliora la viabilità cellulare.

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Questo lavoro è stato supportato dai progetti chiave dell'Accademia Cinese delle Scienze (KFZD-SW-205), sistema strategico di supporto tecnologico delle risorse biologiche dell'Accademia Cinese delle Scienze (CZBZX-1).

Questo studio è stato approvato dal Comitato Etico dell&#39;Istituto di Genetica e Biologia dello sviluppo, e il protocollo segue le linee guida istituzionali per il benessere umano. 1. Preparazione di EB Virus <ol><li> Il giorno 1, scongelare B95-8 cellule e di coltura in 6 mL completo RPMI 1640 medium, supplementato con 10% siero fetale bovino, 2 mM L-glutammina e antibiotici (100 mg / ml di streptomicina, 100 U / ml penicillina) in un T25 pallone di coltura. Mettere il pallone di coltura in 5% CO 2 incubatore a 37 ° C. </li><li> Il giorno 2, osservare la morfologia delle cellule al microscopio. Le cellule sono in buone condizioni quando sono luminose e rotondo. Aggiungere 10 ml completo di media RPMI 1640. </li><li> Il giorno 4, aggiungere 10 ml di fresco completo RPMI 1640, e poi trasferire in un pallone di coltura T75. </li><li> Il giorno 8, aggiungere 20 ml completo di media RPMI 1640. </li><li> Mantenere le cellule per 8 giorni senza l&#39;aggiunta di mezzo fresco, vale a dire, la fame. </li><li> Il giorno 16, osservare le celluleosservata al microscopio. Raccogliere le cellule in una provetta da 15 centrifuga, 12 ml / provetta. </li><li> Cryo-conservazione a -80 ° C per 1 ora, e poi rapidamente scongelare a 37 ° C. Ripetere 3 volte fino a quando le particelle virali vengono rilasciati dalle cellule. </li><li> Centrifugare a 240 xg per 10 min a temperatura ambiente. </li><li> Filtrare il surnatante attraverso un filtro di 0,22 micron, aliquota, 12 mL / tubo, e conservare a -80 ° C. </li></ol> 2. Trattamento di sangue intero con Globulo rosso Lysis Buffer <ol><li> Aggiungere 0,5 ml di sangue intero anticoagulato con EDTA · K 2 in una provetta da 15 ml. </li><li> Mettere 1 ml tampone di lisi dei globuli rossi (filtrati da 0,22 micron filtro e scongelati a temperatura ambiente prima dell&#39;uso) per il sangue intero e mescolare bene. Posizionare la miscela a temperatura ambiente per 4 min. Poi aggiungere 5 - 7 mL PBS 1x rapidamente alla reazione di arresto. </li><li> Centrifugare a 240 xg per 5 min a temperatura ambiente. I globuli bianchi precipitano sul fondo della provetta. </li><li> Eliminare il surnatante e lavare la precipitazione con l&#39;aggiunta di 7 ml 1640 medium di base. Centrifugare per 5 minuti a 240 xg a temperatura ambiente. Ripetere due volte. </li><li> Risospendere il pellet di cellule in 300 microlitri di media trasformazione (terreno RPMI 1640, contenente 20% di siero fetale bovino e 10 ug / ml fitoemoagglutinina (PHA)). </li></ol> 3. EBV infezione <ol><li> Aggiungere 60 ml di 20 mg / ml ciclosporina A (CsA) alla sospensione cellulare. </li><li> Rapidamente scongelare un&#39;aliquota di EBV a 37 ° C. Aggiungere 240 microlitri EBV alla sospensione cellulare. </li><li> Mescolare bene e mettere la sospensione cellulare ad una piastra a 96 pozzetti, 200 ml per pozzetto. Per evitare l&#39;evaporazione, aggiungere 200 microlitri di PBS 1x ad ogni bene intorno della piastra a 96 pozzetti. Porre la piastra in un incubatore CO 2 5% a 37 ° C. </li></ol> 4. Ampliamento e crioconservazione di B-LCL <ol><li> Modificare la metà del mezzo una volta a settimana per il primo mese dopo l&#39;infezione da EBV. Solo un laye spessorer di frammenti cellulari è visibile al microscopio al giorno 7 (figura 2). Dopo un mese di infezione EBV, gruppi di cellule linfoblastoidi sono visibili sotto uno spesso strato di frammenti cellulari al microscopio (Figura 2). </li><li> Cambiare la metà del mezzo ogni 3 giorni fino a quando i gruppi di cellule sono chiaramente visibili al microscopio (Figura 2). In genere, questo processo richiede da 10 a 20 giorni. </li><li> Dopo la miscelazione, pipettare le cellule e trasferire alla piastra 24 pozzetti. Raddoppiare il volume di terreno di coltura con completo RPMI 1640 mentre diventa giallo. Questo processo dipende dal tasso di crescita cellulare. </li><li> Successivamente, trasferire le cellule a pallone di coltura T25. Raddoppiare il volume del terreno di coltura come risulta giallo finché il volume del mezzo espande a 10 - 15 mL. </li><li> Cambiare media 24 ore prima del congelamento. sospensione cellulare Centrifugare per 5 min a 240 x g. Contare le cellule con un contatore di cellule e congelare ad una densità di 5 - 10 x 10 6 / ml in frSoluzione Ozen contenente 90% FBS e il 10% dimetilsolfossido (DMSO). Congelare a una velocità di 1 ° C per min a -80 ° C e poi trasferire direttamente in azoto liquido. </li></ol> 5. 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil-tetrazolio bromuro (MTT) Assay 17 <ol><li> Preparare una sospensione singola cellula B-LCL con il mezzo 1640 contenente il 10% di siero fetale bovino. Seed 3 x 10 4 cellule per pozzetto sulla piastra da 96 pozzetti, 100 ml per pozzetto. </li><li> Porre la piastra in 5% CO 2 incubatore a 37 ° C per 12 - 16 h. </li><li> Aggiungere MTT (5 mg / ml) per i pozzi in cui le cellule sono in crescita e tenere lontano dalla luce per 4 ore a 37 ° C. </li><li> piastra di cella Centrifugare per 10 min a 168 x g. </li><li> Rimuovere il surnatante e aggiungere 100 ml di DMSO per pozzetto. NOTA: Attenzione. Non toccare i cristalli di colorante aghiformi. </li><li> Agitare la piastra per 10 min a bassa velocità per sciogliere completamente i cristalli. </li><li> l&#39;assorbimento di misura a 570 nm perutilizzando uno spettrofotometro per micropiastre. </li></ol>

<ol><li>Mohyuddin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+instability+in+EBV-transformed+lymphoblastoid+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Genetic instability in EBV-transformed lymphoblastoid cell lines.</a> Biochim Biophys Acta. 1670 (1), 81-83 (2004).</li>
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<li>Tosato, G., Cohen, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Epstein-Barr+Virus+%28EBV%29-immortalized+B+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Generation of Epstein-Barr Virus (EBV)-immortalized B cell lines.</a> Curr Protoc Immunol. , Chapter 7, Unit 7 22(2007).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Riportiamo lo sviluppo di un nuovo metodo per immortalare cellule B umane da sangue intero mediante lisi dei globuli rossi, e la sua vitalità cellulare dei stabilita B-LCL è stata valutata mediante il saggio MTT. I risultati hanno mostrato che la vitalità cellulare di B-LCL stabilita con il metodo di lisi dei globuli rossi è molto superiore a quella del metodo di separazione gradiente di densità. Il principale vantaggio del metodo di lisi dei globuli rossi è che è semplice e richiede un piccolo volume (non più di 0,5 ml...

Le cellule B a riposo potrebbero essere trasformate dal virus di Epstein-Barr (EBV) in vitro in linee cellulari linfoblastoidi B (B-LL) che proliferano attivamente. Le B-LCL sono simili alle cellule germinali nella differenziazione e nello sviluppo e il tasso di mutazione somatica delle B-LCL è stato solo dello 0,3%1, con alterazione genetica e fenotipica trascurabile. Pertanto, i B-LCL, come surrogati delle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC), hanno sostanzialmente accelerato il progresso dello studio genomico, trascrittomico e proteomico delle malattie associate all'EBV2,3. Inoltre, i B-LCL hanno anche importanti applicazioni nello screening degli anticorpi monoclonali4,5. 
Sono stati sviluppati diversi metodi per l'immortalizzazione dei linfociti B da parte di EBV. Le procedure più comuni includono l'isolamento dei linfociti B e l'uso di linee cellulari B95-8 per produrre EBV infettivo. Dall'isolamento alla trasformazione, questi metodi si dividono in tre strategie. I linfociti vengono separati dal sangue fresco mediante centrifugazione in gradiente di densità e trasformazione diretta di EBV6-8, chiamato metodo di separazione in gradiente di densità in questo studio. Tuttavia, altre tecniche superano la difficoltà di spedire sangue fresco e utilizzano una procedura per il congelamento dei linfociti purificati e il successivo scongelamento e l'infezione da EBV9-11. Il sangue intero crioconservato può essere utilizzato anche per l'isolamento dei linfociti B e la trasformazione12,13. Oltre alla centrifugazione a gradiente di densità per separare i linfociti B, alcuni ricercatori utilizzano un selezionatore di cellule magnetiche per selezionare i linfociti B12. Tuttavia, la separazione magnetica è un processo costoso, complesso e dispendioso in termini di tempo. Sebbene questi metodi siano utili per immortalare i linfociti B con un alto tasso di successo, la necessità di trattare un gran numero di campioni clinici e il volume relativamente piccolo di sangue richiedono un metodo più semplice per la creazione di una linea cellulare permanente.
Un altro metodo meno comunemente usato è l'uso del sangue intero come fonte di cellule nucleate per l'infezione da EBV e la creazione di B-LCL. Questi metodi semplificano la tecnica omettendo la procedura di separazione. Solo una piccola quantità di sangue intero, fresco14 o congelato15,16, è sufficiente per ottenere le linee cellulari. Sfortunatamente, c'è una grande variabilità nel successo dai documenti15,16 e da molti dei nostri test di convalida. Inoltre, le colonie trasformate sono difficilmente riconoscibili al microscopio a causa delle grandi impurità contaminanti. Pertanto, è necessario un metodo più affidabile per la trasformazione.
Sulla base delle considerazioni di cui sopra, abbiamo sviluppato un nuovo metodo per stabilire B-LCL senza previa purificazione dei linfociti, chiamato metodo di lisi dei globuli rossi. Questo metodo è conveniente, fa risparmiare tempo ed è applicabile a un gran numero di campioni. Appena 0,5 ml di sangue intero sono stati sufficienti per ottenere B-LCL che sono facilmente ottenibili da neonati e anziani senza danneggiare in modo significativo la loro salute.

<table><tbody><tr><td>Centrifuga</td><td>Techcomp</td><td>CT6T</td> Contatore di celle <td>automatizzato per centrifugazione</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Countstar</td><td>&nbsp; IC 1000&nbsp;</td><td>Per il conteggio delle cellule&nbsp;</td></tr><tr><td>Spettrofotometro per micropiastre Epoch</td><td>BioTek Instruments</td><td>SN263839</td><td>Per misurare l'assorbanza</td></tr> cluster di <tr><td>colture cellulari a 96 pozzetti</td><td>Corning Incorporated</td><td>3599</td><td>piastre in polistirene</td></tr><tr><td>cluster di colture cellulari a 24 pozzetti</td><td>Corning Incorporated</td><td>3524</td><td>piastre in polistirene</td></tr><tr><td>25 cm2 pallone per colture cellulari</td><td>Nido</td><td>707001</td><td>Polistirene nbsp;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td>Componente di B-LCLs medio</td></tr><tr><td>RPMI medio 1640</td><td>Gibco</td><td>31800-022</td><td>Per B-LCLs medio</td></tr><tr><td>L-Glutammina&nbsp; &nbsp;</td><td>Amresco</td><td>0374</td><td>Componente di B-LCLs medio</td></tr><tr><td>100x streptomicina penicillina soluzione BioRoYeeBRY-2309</td><td>BioRoYee</td><td>BRY-2309</td><td>Componente di B-LCLs medio</td></tr><tr><td>Ficoll paque plus</td><td>GE&nbsp; Sanità</td><td>17-1440-03</td><td>Per in vitro isolamento del linfocita</td></tr><tr><td>PHA-M</td><td></td><td>Sigma L8902</td><td>Per stimolare la proliferazione dei linfociti</td></tr><tr><td>Ciclosporina A</td><td>Cayman&nbsp; Sostanza chimica</td><td>12088</td><td>Per inibire l'effetto di citotossicità delle cellule</td></tr><tr><td>T Tampone di lisi dei globuli rossi</td><td>Tiangen</td><td>RT122-01</td><td>Per la lisi dei globuli rossi</td></tr><tr><td>MTT</td><td>Amresco</td><td>0793</td><td>Per il rilevamento della vitalità cellulare</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td>Per il congelamento delle cellule</td></tr></tbody></table>

un cellulare semplice red blood metodo lysis per l&#39;istituzione di b linfoblastoidi linee cellulari

A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines

Esistono numerosi metodi per la trasformazione dei linfociti B da parte del virus di Epstein Barr in vitro in linee cellulari immortalizzate. Abbiamo sviluppato un nuovo metodo con una strategia potente e semplice per l'istituzione di B-LCLs, il metodo di lisi dei globuli rossi. Questo metodo ha semplificato la procedura di separazione della PBMC con la rimozione dei globuli rossi e ha utilizzato un minimo di 0,5 ml di sangue intero per stabilire linee cellulari immortalizzate da EBV, che possono proliferare in un numero elevato di cellule in un tempo relativamente breve con un tasso di successo del 100%. Il metodo è semplice, affidabile, fa risparmiare tempo e si applica al trattamento di un gran numero di campioni clinici.

Durante il processo di trasformazione, i cambiamenti morfologici di cellule sono visualizzati al microscopio ottico (Figura 2). Piccoli gruppi di cellule erano chiaramente visibile con il metodo di separazione gradiente di densità dopo 7 giorni di infezione, mentre solo uno spesso strato di frammenti cellulari sono visibili dal metodo di lisi dei globuli rossi. Tuttavia, gruppi di cellule linfoblastoidi sono visibili sotto lo spesso strato di frammenti di cellule di 30 g...

Un semplice metodo di lisi dei globuli rossi per stabilire B-LCL stato sviluppato con alta efficienza di immortalizzazione, richiede una piccola quantità di sangue e risparmio di tempo tra l&#39;inizio di crioconservazione.

Un cellulare semplice Red Blood Metodo Lysis per l&#39;istituzione di B linfoblastoidi linee cellulari

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new ...

L'obiettivo generale di questo metodo semplice è quello di stabilire linee cellulari di linfoblastoidi B, o B-LCL, con elevata efficienza di immortalizzazione, utilizzando solo una piccola quantità di sangue e riducendo il tempo tra l'avvio e la criopreservazione. Si tratta di un metodo innovativo per l'immortalizzazione di linfociti B umani a partire da sangue intero mediante ilisi dei globuli rossi. Le B-LCL forniscono una fonte preziosa di materiali biologici per eseguire diversi tipi di studi.Il principale vantaggio di questo metodo è che solo 0,5 millilitri di sangue sono sufficienti per ottenere LCL-B con un'efficienza di immortalizzazione e un'alta vitalità cellulare. Per stabilire LCL-B mediante il virus di Epstein-Barr, o EBV, che trasforma i linfociti B, il metodo comunemente utilizzato prevede l'isolamento separato di cellule mononucleate del sangue periferico o PBMC, mediante centrifugazione su gradiente di densità con Ficoll. Tuttavia, quando il campione è inferiore a un millilitro, l'aggiunta di un agente emolitico fallirà.L'idea iniziale di questo metodo è nata quando abbiamo constatato che isolare le PBMC dai globuli rossi piccoli è difficile utilizzando un metodo di separazione tramite gradiente di densità. Per preparare il virus di Epstein-Barr, al primo giorno iniziare scongelando le cellule B95-8 e coltivarle in un'ampolla di coltura T25 con sei millilitri di terreno RPMI 1640 completo, integrato con il 10% di FBS, due millimoli di L-glutammina e antibiotici. Incubare la coltura a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica.Al secondo giorno, osservare al microscopio la morfologia delle cellule. Le cellule sono in buone condizioni quando appaiono brillanti e rotonde. Aggiungere 10 millilitri di terreno RPMI 1640 completo alla coltura.Al quarto giorno, aggiungere 10 millilitri di mezzo fresco e trasferire le cellule in un’aliquota T75. Successivamente, all’ottavo giorno, aggiungere altri 20 millilitri di mezzo e mantenere le cellule per otto giorni senza aggiungere mezzo fresco. Al sedicesimo giorno, esaminare le cellule al microscopio.Quindi raccogliere 12 millilitri di cellule in provette da centrifuga da 15 millilitri. Successivamente, criopreservare le cellule a meno 80 gradi Celsius per un'ora e scongelare rapidamente le colture a 37 gradi Celsius. Ripetere il ciclo di congelamento e scongelamento altre tre volte fino al rilascio delle particelle virali dalle cellule.Centrifugare le colture a 240 volte g a temperatura ambiente per 10 minuti. Successivamente, filtrare il sopranatante attraverso un filtro da 0,22 micron. Aliquotare 12 millilitri del filtrato per provetta e conservare le provette a meno 80 gradi Celsius.In un tubo da 50 millilitri, aggiungere 0,5 millilitri di sangue intero anticoagulato con EDTA K2. Aggiungere un millilitro di tampone per la lisi dei globuli rossi al sangue intero e mescolare accuratamente. Incubare la miscela a temperatura ambiente per quattro minuti. Successivamente, aggiungere rapidamente da cinque a sette millilitri di PBS 1x per arrestare la reazione di lisi.Dopo aver aggiunto il tampone emolitico al sangue, assicurarsi di miscelare accuratamente. L'inversione garantisce che la reazione venga interrotta in modo tempestivo. Successivamente, centrifugare il tubo a 240 ×g a temperatura ambiente per cinque minuti.Le cellule bianche del sangue precipiteranno sul fondo del tubo. Eliminare il soprannatante e lavare il precipitato aggiungendo sette millilitri di Mezzo Base 1640. Quindi centrifugare la soluzione prima di ripetere il lavaggio.Con 300 microlitri di mezzo di trasformazione, risospendere il pellet cellulare. Successivamente, per eseguire l'infezione da EBV, aggiungere 60 microlitri di Ciclosporina A a 20 microgrammi per millilitro alla sospensione cellulare. Scongelare rapidamente un'aliquote di EBV a 37 gradi Celsius e aggiungere 240 microlitri del virus alle cellule.Mescolare accuratamente la sospensione e trasferire 200 microlitri per pozzetto in una piastra a 96 pozzetti. Quindi incubare la piastra a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Nel primo mese successivo all'infezione da EBV, sostituire metà del mezzo di coltura cellulare una volta alla settimana.Al settimo giorno, solo uno strato spesso di frammenti cellulari è visibile al microscopio. Dopo un mese di infezione, si osservano ammassi di cellule linfoblastoidi al di sotto di uno strato spesso di frammenti cellulari. Da questo momento in poi, sostituire metà del mezzo ogni tre giorni fino a quando gli ammassi cellulari non risultano chiaramente visibili al microscopio.Dopo aver risospeso le cellule, trasferire la sospensione nei pozzetti di una piastra a 24 pozzetti. Successivamente, a seconda della velocità di crescita cellulare, quando il mezzo di coltura diventa giallo, raddoppiare il volume del mezzo RPMI 1640 completo. Quando i cluster di cellule linfoblastoidi sono visibili ad occhio nudo, trasferire la coltura in un’ampolla di coltura T25.Quando il mezzo di coltura diventa giallo, raddoppiare il volume del mezzo fino a quando il volume raggiunge i 10-15 millilitri. Prima del congelamento, sostituire il mezzo 24 ore prima. Per congelare le cellule, centrifugare la sospensione cellulare e utilizzare un contatore cellulare per contare le cellule.Con la soluzione stock congelata contenente 90% di FBS e 10% di DMSO, regolare la sospensione a una densità compresa tra cinque e dieci volte 10 alla sesta cellule per millilitro. Successivamente, congelare la sospensione a un tasso di un grado Celsius al minuto fino a meno 80 gradi Celsius, prima di trasferire direttamente le cellule congelate in azoto liquido. Durante il processo di trasformazione, i cambiamenti morfologici delle cellule sono visibili mediante microscopia ottica.Dopo sette giorni di infezione, piccoli gruppi di cellule sono chiaramente visibili utilizzando il metodo di separazione tramite gradiente di densità, mentre con il metodo di lisi dei globuli rossi è visibile solo uno strato spesso di frammenti cellulari. A 30 giorni dall'infezione, i gruppi di cellule linfoblastoidi sono visibili al di sotto dello strato spesso di frammenti cellulari. Con cambiamenti del mezzo più frequenti, i detriti cellulari si riducono e i gruppi cellulari diventano chiaramente visibili, apparendo simili alla coltura ottenuta tramite separazione con gradiente di densità.Infine, il saggio MTT è stato utilizzato per valutare la vitalità delle B-LCL. I risultati qui mostrati indicano che le cellule B-LCL coltivate utilizzando il metodo di lisi dei globuli rossi presentavano una vitalità significativamente maggiore rispetto alle colture stabilite mediante il metodo di separazione su gradiente di densità. Una volta acquisita padronanza, il processo di trasformazione virale da EBV può essere eseguito in 30 minuti se effettuato correttamente.Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come stabilire linee cellulari B-LCL mediante un semplice e rapido metodo di lisi dei globuli rossi, senza la pregressa purificazione dei linfociti. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha accelerato i progressi negli studi di genomica, trascrittomica e proteomica delle malattie associate al virus di Epstein-Barr e nella produzione di anticorpi monoclonali. Non bisogna dimenticare che lavorare con patogeni umani, come il virus di Epstein-Barr, può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è sempre necessario adottare le opportune precauzioni.

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