L'isolamento di cellule progenitrici endoteliali da volontari sani e il loro potenziale migratori influenzato dal siero campioni dopo cardiochirurgia

cellule progenitrici endoteliali (EPC) sono cruciale coinvolti nella neovascolarizzazione di tessuti ischemici. Questo metodo descrive l'isolamento di EPC umani da sangue periferico, così come l'identificazione della loro potenziale migratorio contro campioni di siero di pazienti chirurgici cardiaci.

L'obiettivo generale di questa procedura di isolamento cellulare e protocollo di migrazione è quello di mostrare un modo affidabile per isolare le cellule progenitrici endoteliali e il loro potenziale migratorio verso campioni di siero di pazienti cardiochirurgici. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella rigenerazione del rivestimento endoteliale e dei vasi sanguigni, necessaria dopo un intervento cardiochirurgico a causa di lesioni correlate all'ischemia e alla riperfusione. Il vantaggio principale di questa tecnica è il modo relativamente semplice di isolare le cellule progenitrici, compreso il pre-isolamento delle cellule CD-34 positive.

Oltre ai decessi, le complicanze maggiori della cardiochirurgia rimangono troppo comuni. Sottolineando la necessità di identificare il rischio di cravatta e i meccanismi protettivi durante la cardiochirurgia. Le cellule progenitrici endoteliali sono coinvolte in modo cruciale nella neovascolarizzazione dei tessuti ischemici e sono note per fornire proprietà cardioprotettive.

Per iniziare l'esperimento, mescolare il sangue, uno a uno, con PBS senza calcio e senza magnesio. Aggiungere 15 millilitri di soluzione a gradiente di densità in un tubo da 50 millilitri. E sovrapporre lentamente il sangue diluito sopra la soluzione del gradiente di densità.

Quindi, centrifugare i campioni. Utilizzando una pipetta di plastica sterile, raccogliere con cura lo strato di buffy coat di ogni provetta e posizionarlo in un'altra provetta evitando la soluzione a gradiente di densità. Diluire la cellula mononucleata del sangue periferico, o frazione di PBMC, con almeno tre volumi di PBS e mescolare la soluzione mediante pipettaggio.

Centrifugare la miscela a temperatura ambiente per 15 minuti a 200 volte G.Quindi, aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in cinque millilitri di terreno di crescita delle cellule endoteliali, MV-2. Dopo aver risospeso le cellule, aggiungere 100 microlitri di anticorpo umano CD-34 per buffy coat usato e ruotare le cellule. Aggiungere 50 microlitri di perle magnetiche rivestite di destrano per ogni buffy coat usato e ruotare le celle.

Dopo l'incubazione, trasferire la sospensione in provette fax con un massimo di tre millilitri per ciascuna provetta. Quindi, inserisci i tubi del fax nei magneti e attendi cinque minuti. Eliminare il super natante senza estrarre i tubi fax dal magnete.

Quindi, all'esterno dei magneti, risospendere le celle in ciascun tubo fax con tre millilitri di terreno MV-2. Trasferire la sospensione cellulare in matracci T-75 pre-rivestiti. Aggiungere 17 millilitri di terreno MV-2 a ciascun pallone.

Per preparare il saggio di migrazione, utilizzare una pipetta per rimuovere il terreno dalle cellule progenitrici endoteliali o dalle EPC, nel pallone T-75. Lavare le cellule con cinque millilitri di soluzione salina tamponata con fosfato o PBS e agitare accuratamente il pallone. Quindi, rimuovere il PBS e aggiungere cinque millilitri di soluzione commerciale per il distacco delle cellule.

Quindi, attendere che le cellule si stacchino al microscopio ottico. Accelera il distacco picchiettando con cautela il fondo della fiaschetta. Quando le cellule sono staccate, aggiungere rapidamente cinque millilitri di terreno completo MV-2 e trasferire la sospensione cellulare in un altro tubo.

Centrifugare le celle a 2.000 x G per cinque minuti. Dopo aver pellettato le cellule, risospenderle in cinque-dieci millilitri di PBS. E centrifugarli di nuovo.

Risospendere nuovamente le cellule in cinque-dieci millilitri di PBS e proseguire con la centrifugazione. Risospendere il pellet di cella in un mezzo affamato di MV-2. Quindi, diluire il campione di siero da uno a cinque in un terreno affamato di MV-2.

Preparare la piastra di migrazione aggiungendo 235 microlitri di campione di siero nella camera inferiore. Aggiungere l'inserto poco prima di aggiungere la soluzione cellulare. Quindi, aggiungere 75 microlitri della soluzione cellulare nella camera superiore.

Consentire la migrazione degli EPC. Rimuovere la camera superiore contenente tutte le cellule non migrate. Aggiungere 75 microlitri di soluzione di paraformaldeide al 3,6% incluso il colorante hoechst diluito a 1.000 euro.

Centrifugare brevemente la piastra per portare tutte le cellule sullo stesso piano focale a 2.000 x G per uno o due minuti. Per evitare artefatti di autofluorescenza sierica, quantificare le cellule migrate scattando cinque foto per pozzetto con ingrandimento 100x al microscopio. Infine, contare le celle migrate utilizzando il software semiautomatico.

L'analisi via fax delle EPC verifica l'assorbimento di acLDL, così come l'espressione di CD-31 sulla superficie della popolazione cellulare isolata. L'isolamento dell'analisi di acLDL e CD-31 rivela una distribuzione omogenea di ciascun marcatore. Elyso per identificare l'influenza della cardiochirurgia a seguito di danno da riperfusione miocardica sulle concentrazioni dei livelli sierici circolanti di MIF, CXCL12, CXCL8 e VEGF.

I campioni di siero sono stati prelevati prima e intraoperatoriamente. I livelli sierici di MIF, CXCL12 e CXCL8 hanno mostrato un aumento intraoperatorio significativo rispetto ai valori basali. Al contrario, le concentrazioni di VEGF non hanno mostrato cambiamenti significativi.

Un test di migrazione ex vivo, utilizzando campioni di siero prelevati prima e durante l'intervento chirurgico, è stato eseguito utilizzando EPC isolate da volontari sani e ha rivelato un tasso di migrazione significativamente aumentato verso i campioni prelevati intraoperatoriamente. Seguendo questa tecnica, le cellule mononucleate del sangue periferico possono essere facilmente isolate, al fine di rispondere a ulteriori domande relative all'infiammazione.