Regia di differenziazione dei progenitori ematopoietici primitivi e definitivo da cellule staminali pluripotenti umane

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di dirigere il Differenziamento delle Cellule Staminali Pluripotenti Umane verso il Programma Ematopoietico Primitivo o Definitivo utilizzando un approccio di manipolazione del segnale specifico per stadio. Questo metodo può rispondere a molte questioni chiave nel campo, come la comprensione del segnale e dei regolatori trascrizionali dell'emopoiesi definitiva umana. Il vantaggio principale di questa tecnica è che utilizza istantaneamente la manipolazione specifica del palco.

A dimostrare questa procedura è Carissa Dege, un post-doc nel mio laboratorio. Per iniziare il protocollo, procurarsi linee cellulari staminali pluripotenti umane o HPSC precedentemente preparate, coltivate su fibroblasti embrionali di topo o MEF con una confluenza compresa tra il 70% e l'80% in un incubatore a 37 gradi Celsius con il cinque percento di CO2. Aspirare il terreno HPSC e aggiungere un millilitro di tripsina EDTA a 37 gradi Celsius 0,25% a ciascun pozzetto per un minuto.

Dopo un minuto, aspirare la tripsina e aggiungere un millilitro di terreno madre a ciascun pozzetto. Usando un raschietto per cellule, raschiare le cellule dalla piastra. Quindi, aggiungere un millilitro di tampone di lavaggio a ciascun pozzetto.

Con una pipetta sierologica da due millilitri, triturare le cellule da tre a cinque volte per rompere i grumi di grandi dimensioni. E trasferire le cellule in una provetta conica da 50 millilitri. Centrifugare le HPSC a 330 x G per cinque minuti.

Dopo la centrifuga, aggiungere il terreno HPSC e risospendere le celle. Quindi, aggiungere due millilitri di HPSC ri-sospese a ciascun pozzetto di plastica codificata MAT e incubare le cellule durante la notte. Dopo 24 ore, aspirare il terreno e sostituirlo con 37 gradi Celsius 0,05% di tripsina EDTA per un minuto.

Aspirare la tripsina EDTA. Aggiungere un millilitro di materiale di coltura e raschiare energicamente le cellule con un raschietto per cellule. Quindi aggiungere un millilitro di liquido di lavaggio.

Con una pipetta sierologica da due millilitri, triturare le cellule tre volte e trasferirle in una provetta conica da 50 millilitri. Centrifugare le celle a 220 x G per cinque minuti. Quindi aspirare il terreno, aggiungere 20 millilitri di terreno di lavaggio e utilizzare una pipetta sierologica da cinque millilitri per risospendere delicatamente le cellule.

Dopo la centrifugazione e l'aspirazione, risospendere con cura i corpi embrioidi o EB in terreno del giorno zero. Erogare due millilitri di terreno di differenziazione contenente EB in ciascun pozzetto di una piastra di coltura cellulare a sei pozzetti a bassa aderenza utilizzando una pipetta sierologica da dieci millilitri. Posizionare gli EB in un incubatore multigas a 37 gradi Celsius, cinque percento di CO2 e cinque percento di O2.

Ventiquattro ore dopo, aggiungi due millilitri di supporto Day One. Incubare le cellule per una notte in un incubatore multigas. Dopo 18 ore, raccogliere delicatamente gli EB con una pipetta sierologica da cinque millilitri e farli girare a 100 x G per cinque minuti.

Lavare e combinare l'intera coltura con dieci millilitri di Dulbecco Medium modificato o IMDM di Iscove. Dopo aver fatto girare nuovamente la coltura a 100 X G per cinque minuti per rimuovere i detriti, aspirare il terreno. Risospendere delicatamente gli EB con il terreno del secondo giorno utilizzando una pipetta P1000.

Quindi erogare due millilitri di EB per pozzetto in piastre di coltura cellulare a sei pozzetti a bassa aderenza. Aggiungere tre CHIR99021 micromolari o IWP2 per specificare rispettivamente i progenitori ematopoietici definitivi o primitivi. Incubare la piastra in un incubatore multigas a 37 gradi Celsius per 30 ore.

Dopo 30 ore, isolare gli EB con una pipetta sierologica da due millilitri trasferendoli in una provetta conica da 50 millilitri e centifugendoli a 330 x G per cinque minuti. Risospendere delicatamente gli EB e lavarli con 10 millilitri di IMDM. Risospendere gli EB nel terreno del terzo giorno ed erogare due millilitri in ciascun pozzetto di piastre a sei pozzetti a bassa aderenza.

Incubare le cellule in un incubatore multigas a 37 gradi Celsius per 72 ore. Dopo 72 ore di incubazione, aggiungere due millilitri di Day Six Media a ciascun pozzetto. Quindi incubare gli EB in un incubatore multigas a 37 gradi Celsius per altre 48 ore.

Isolare gli EB trattati con CHIR99021 l'ottavo giorno di differenziazione e procedere alla sezione successiva. Centrifugare gli EB a 330 x G per cinque minuti. Aspirare il surnatante.

Quindi aggiungere due millilitri di tripsina EDTA allo 0,25% agli EB. Agitare gli EB per cinque secondi e incubare gli Eb in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per otto minuti. Quindi aggiungere cinque millilitri di soluzione di arresto e centrifugare gli EB.

Quindi aspirare il surnatante. Risospendere gli EB in cinque millilitri di collagenasi II.Agitare il tubo per cinque secondi e poi incubare gli EB in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Dopo 60 minuti, agitare gli EB per cinque secondi e aggiungere cinque millilitri di soluzione di arresto.

Dopo la centrifugazione, aspirare il surnatante e risospendere le cellule in un millilitro di tampone FACS. Passare le cellule attraverso un colino cellulare da 40 micron per rimuovere i grumi cellulari non dissociati. Procedere con la marcatura degli anticorpi e l'isolamento FACS dei progenitori endoteliali emogenici CD34-positivi.

Dopo l'isolamento del FACS, risospendere le cellule nel terreno HE. Distribuire le cellule in aliquote da 50 microlitri in una piastra di coltura a bassa aderenza da 96 pozzetti e quindi incubare le cellule durante la notte. La mattina successiva, i progenitori ematopoietici dovrebbero aggregarsi in gruppi di sei-dieci cellule.

Trasferire delicatamente i volumi da 50 miroliti di cellule riaggregate al centro di una piastra con codifica MAT a 24 pozzetti. Posizionare delicatamente la piastra nell'incubatore multigas per quattro-sei ore fino a quando le celle non sono attaccate. Dopo quattro-sei ore, per consentire alle cellule di attaccarsi, aggiungere lentamente un millilitro di terreno HE appena preparato a ciascun pozzetto.

Incubare le cellule nell'incubatore multigas fino a quando le cellule ematopoietiche sono visibili. Successivamente, raccogli i progenitori ematopoietici definitivi rimuovendo delicatamente il terreno di istruzione superiore dalle cellule e facendolo passare attraverso un colino cellulare da 40 micron per raccogliere il flusso. Per le restanti cellule aderenti, aggiungere 0,5 millilitri di tripsina EDTA allo 0,25% alle cellule e incubarle in un incubatore a 37 gradi Celsius per cinque minuti.

Dopo la tripsinizzazione, aggiungere 0,5 millilitri di soluzione di arresto in ciascun pozzetto. Far passare le cellule attraverso lo stesso filtro cellulare da 40 micron per raggruppare tutte le cellule aderenti e non aderenti e far girare le cellule. Aggiungere da 2.000 a 10.000 cellule isolate FACS a un pozzetto delle cellule OP9 DL4 in terreni OP9

Incubare in un incubatore a 37 gradi Celsius, 5% CO2. Per far passare le cellule ogni quattro o cinque giorni, triturare le cellule con una pipetta da un millilitro. Passare attraverso un filtro da 40 micron per rimuovere i grumi.

Dopo la centrifugazione, aspirare il terreno. Risospendere le cellule in due millilitri di terreno di coltura delle cellule T fresche e posizionarle su cellule OP9 DL4 fresche. Dopo almeno 21 giorni di coltura a freddo, triturare vigorosamente le cellule e passarle attraverso un filtro da 40 micron per rimuovere i detriti cellulari.

Centrifugare a 330 x G per cinque minuti e aspirare il surnatante, quindi continuare con la citometria a flusso standard. La citometria a flusso mostra che le colture di differenziazione trattate con IWP2 producono una popolazione distinta CD34 positiva, CD43 negativa e CD34 bassa CD43 positiva. Mentre le colture di differenziazione trattate con CHIR hanno meno dell'1% di cellule CD43 positive all'ottavo giorno di differenziazione.

I progenitori ematopoietici primitivi derivati in condizioni IWP2 isolate il nono giorno daranno origine a progenitori eritroidi e mieloidi prevalentemente primitivi nei saggi di metilcellulosa. La popolazione CD34 positiva CD43 negativa derivata dal trattamento CHIR99021 è una popolazione eterogenea contenente progenitori endoteliali e endotenio emogenico CD34 positivo, CD43 negativo, CD73 negativo, CD184 negativo, che una volta isolato mediante FACS formerà inizialmente un monostrato di cellule endoteliali che poi subisce una transizione da endoteliale a ematopoietica con conseguente rotonda, rifrattile, cellule ematopoietiche non aderenti. Queste cellule ematopoietiche possono essere valutate mediante citometria a flusso per l'espressione di CD34 e CD45.

I progenitori ematopoietici isolati dai saggi EHT possono essere utilizzati nei saggi di metilcellulosa e danno origine a grandi unità formanti colonie eritroidi simili a scoppietti, piccole unità formanti colonie eritroidi e progenitori mieloidi. Queste analisi citofluorimetriche rappresentative del potenziale dei saggi dei linfociti T da progenitori ematopoietici CD34 positivi, CD43 negativi, CD73 negativi, CD184 negativi derivati da CHIR99021 e progenitori ematopoietici CD34 positivi e CD43 negativi derivati da IWP2 mostrano la presenza di una popolazione CD45 positiva, CD56 negativa, CD4 positiva e CD8 positiva nei progenitori derivati da CHIR, indicativa del potenziale ematopoietico all'interno della popolazione CD34 positiva in ingresso. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come differenziare le cellule staminali pluripotenti umane verso una quantità primitiva o definitiva di progenitori ematopoietici.