Regia di differenziazione dei progenitori ematopoietici primitivi e definitivo da cellule staminali pluripotenti umane

L'obiettivo generale di questo metodo è indirizzare la differenziazione delle cellule staminali pluripotenti umane verso il programma ematopoietico primitivo o definitivo, utilizzando un approccio basato sulla manipolazione specifica dei segnali in base alla fase. Questo metodo può rispondere a numerose domande fondamentali nel campo, come comprendere i regolatori dei segnali e della trascrizione nell'ematopoiesi definitiva umana. Il principale vantaggio di questa tecnica è che utilizza una manipolazione specifica per fase in modo immediato.

Dimostra questa procedura Carissa Dege, un ricercatore post dottorato nel mio laboratorio. Per iniziare il protocollo, procurarsi linee cellulari di cellule staminali pluripotenti umane precedentemente preparate, o HPSC, coltivate su fibroblasti embrionali di topo, o MEF, fino a una confluenza del 70%-80% in un incubatore a 37 gradi Celsius con il 5 percento di CO2. Aspirare il mezzo di coltura delle HPSC e aggiungere un millilitro di tripsina EDTA 0,25% a 37 gradi Celsius per ogni pozzetto per un minuto.

Dopo un minuto, aspirare la tripsina e aggiungere un millilitro di mezzo di riserva in ogni pozzetto. Utilizzando un raschietto per cellule, staccare le cellule dalla piastra. Successivamente, aggiungere un millilitro di buffer di lavaggio in ogni pozzetto.

Con una pipetta sierologica da due millilitri, triturare le cellule da tre a cinque volte per rompere gli aggregati più grandi. Quindi trasferire le cellule in un tubo conico da 50 millilitri. Centrifugare le HPSC a 330 x G per cinque minuti.

Dopo la centrifugazione, aggiungere il mezzo per HPSC e risospendere le cellule. Successivamente, aggiungere due millilitri di HPSC risospese in ogni pozzetto della plastica codificata MAT e incubare le cellule durante la notte. Dopo 24 ore, aspirare il mezzo e sostituirlo con tripsina 0,05% EDTA a 37 gradi Celsius per un minuto.

Aspirare la tripsina EDTA. Aggiungere un millilitro di mezzo di coltura e staccare le cellule energeticamente con una spatola per cellule. Quindi aggiungere un millilitro di mezzo di lavaggio.

Con una pipetta sierologica da due millilitri, triturare le cellule tre volte e trasferirle in un tubo conico da 50 millilitri. Centrifugare le cellule a 220 x G per cinque minuti. Quindi aspirare il mezzo, aggiungere 20 millilitri di mezzo di lavaggio e utilizzare una pipetta sierologica da cinque millilitri per risospendere delicatamente le cellule.

Dopo la centrifugazione e l'aspirazione, risospendere con attenzione gli Embryoid Bodies (EB) nel mezzo del Giorno Zero. Distribuire due millilitri di mezzo di differenziamento contenente EB in ogni pozzetto di una piastra per colture cellulari a sei pozzetti con superficie a bassa adesione, utilizzando una pipetta sierologica da dieci millilitri. Collocare gli EB in un incubatore multigas a 37 gradi Celsius, con cinque percento di CO2 e cinque percento di O2.

Ventiquattro ore dopo, aggiungere due millilitri di mezzo del primo giorno. Incubare le cellule tutta la notte in un incubatore a gas misti. Dopo 18 ore, raccogliere delicatamente gli EB con una pipetta sierologica da cinque millilitri e centrifugarli a 100 x G per cinque minuti.

Lavare e combinare l'intera coltura con dieci millilitri di mezzo di Iscove modificato di Dulbecco o IMDM. Dopo aver centrifugato nuovamente la coltura a 100 X G per cinque minuti per rimuovere i detriti, aspirare il mezzo. Ri-sospendere delicatamente gli EB con il mezzo del Giorno Due utilizzando una pipetta P1000.

Quindi distribuire due millilitri degli EB per pozzetto in piastre per coltura cellulare a sei pozzetti con superficie a bassa adesività. Aggiungere tre micromoli di CHIR99021 o IWP2 per specificare rispettivamente progenitori ematopoietici definitivi o primitivi. Incubare la piastra in un'incubatrice multigas a 37 gradi Celsius per 30 ore.

Dopo 30 ore, isolare gli EB con una pipetta sierologica da due millilitri trasferendoli in un tubo conico da 50 millilitri e centrifugandoli a 330 x G per cinque minuti. Ri-sospendere delicatamente gli EB e lavarli con 10 millilitri di IMDM. Ri-sospendere gli EB nel mezzo del Giorno Tre e distribuire due millilitri in ciascun pozzetto di piastre a sei pozzetti a bassa adesione.

Incubare le cellule in un'incubatrice multigas a 37 gradi Celsius per 72 ore. Dopo 72 ore di incubazione, aggiungere due millilitri di Mezzo del Giorno Sei in ogni pozzetto. Successivamente, incubare gli EB in un'incubatrice multigas a 37 gradi Celsius per ulteriori 48 ore.

Isoletto gli EB trattati con CHIR99021 al giorno otto della differenziazione e procedete alla sezione successiva. Centrifugare gli EB a 330 x G per cinque minuti. Aspirare il soprannatante.

Aggiungere successivamente due millilitri di tripsina EDTA 0,25%. Vortexare gli EB per cinque secondi e incubarli in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per otto minuti. Quindi aggiungere cinque millilitri di soluzione di arresto e centrifugare gli EB.

Quindi aspirare il soprannatante. Ri-sospendere gli EB in cinque millilitri di Collagenasi II. Vortexare il tubo per cinque secondi, quindi incubare gli EB in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Dopo 60 minuti, vortexare gli EB per cinque secondi e aggiungere cinque millilitri di soluzione di arresto.

Dopo la centrifugazione, aspirare il sopranatante e risospendere le cellule in un millilitro di buffer FACS. Far passare le cellule attraverso un filtro cellulare da 40 micron per rimuovere gli aggregati cellulari non dissociati. Procedere con l'etichettatura anticorpale e l'isolamento FACS dei progenitori endoteliali ematopoietici positivi per CD34.

Dopo l'isolamento mediante FACS, risospendere le cellule nel mezzo HE. Distribuire le cellule in aliquote da 50 microlitri in una piastra da coltura a 96 pozzetti a bassa adesione e quindi incubare le cellule durante la notte. La mattina successiva, i progenitori ematopoietici dovrebbero aggregarsi in grumi di sei-dieci cellule.

Trasferire delicatamente i volumi di 50 µL di cellule reaggreghate al centro di una piastra codificata MAT da 24 pozzetti. Posizionare con delicatezza la piastra nell'incubatore a gas misto per quattro-sei ore, fino a quando le cellule non si saranno attaccate. Dopo quattro-sei ore, per consentire l'adesione delle cellule, aggiungere lentamente un millilitro di mezzo HE appena preparato in ciascun pozzetto.

Incubare le cellule nell'incubatore multigas fino a quando le cellule ematopoietiche diventano visibili. Successivamente, raccogliere i progenitori ematopoietici definitivi rimuovendo delicatamente il mezzo HE dalle cellule e facendolo passare attraverso un filtro cellulare da 40 micron per raccogliere il flusso in uscita. Per le cellule aderenti rimanenti, aggiungere 0,5 millilitri di tripsina 0,25% EDTA alle cellule e incubare in un incubatore a 37 gradi Celsius per cinque minuti.

Dopo la tripsinizzazione, aggiungere 0,5 millilitri di soluzione di arresto in ogni pozzetto. Far passare le cellule attraverso lo stesso filtro cellulare da 40 micron per raccogliere insieme tutte le cellule aderenti e non aderenti e centrifugare le cellule. Aggiungere da 2.000 a 10.000 cellule isolate mediante FACS a un pozzetto di cellule OP9 DL4 in mezzo OP9.

Incubare in un incubatore a 37 gradi Celsius, 5% CO2. Per il passaggio delle cellule ogni quattro o cinque giorni, triturare le cellule con una pipetta da un millilitro. Far passare attraverso un filtro da 40 micron per rimuovere gli aggregati.

Dopo la centrifugazione, aspirare il mezzo. Ri-sospendere le cellule in due millilitri di mezzo fresco per linfociti T e collocarle su cellule OP9 DL4 fresche. Dopo almeno 21 giorni di coltura a freddo, triturare vigorosamente le cellule e farle passare attraverso un filtro da 40 micron per rimuovere i detriti cellulari.

Centrifugare a 330 x G per cinque minuti, aspirare il soprannatante e quindi proseguire con la citometria a flusso standard. La citometria a flusso mostra che le colture di differenziamento trattate con IWP2 producono una popolazione distinta positiva per CD34, negativa per CD43 e con bassa espressione di CD34 e positiva per CD43. Al contrario, le colture di differenziamento trattate con CHIR presentano meno dell'1% di cellule positive per CD43 al giorno otto del differenziamento.

I progenitori ematopoietici primitivi ottenuti in condizioni con IWP2, isolati al nono giorno, daranno origine prevalentemente a progenitori eritroidi e mieloidi primitivi nei saggi in metilcellulosa. La popolazione CD34 positiva e CD43 negativa derivata dal trattamento con CHIR99021 è una popolazione eterogenea che comprende progenitori endoteliali nonché emangioblasti CD34 positivi, CD43 negativi, CD73 negativi e CD184 negativi; quando isolati mediante FACS, questi ultimi formeranno inizialmente un monostrato di cellule di tipo endoteliale che successivamente subisce una transizione da endoteliale a ematopoietica, generando cellule ematopoietiche rotonde, refrattili e non aderenti. Queste cellule ematopoietiche possono essere analizzate mediante citometria a flusso per l'espressione di CD34 e CD45.

I progenitori ematopoietici isolati dagli assay EHT possono essere utilizzati in assay al metilcellulosa e dare origine a unità formative di colonie eritroidi di grandi dimensioni, simili a esplosioni, a unità formative di colonie eritroidi di piccole dimensioni e a progenitori mieloidi. Queste analisi rappresentative mediante citometria a flusso del potenziale linfocitario T derivato da progenitori ematopoietici CD34 positivi, CD43 negativi, CD73 negativi, CD184 negativi ottenuti con CHIR99021 e da progenitori ematopoietici CD34 positivi, CD43 negativi ottenuti con IWP2 mostrano la presenza di una popolazione CD45 positiva, CD56 negativa, CD4 positiva, CD8 positiva nei progenitori derivati da CHIR, indicativa del potenziale ematopoietico all'interno della popolazione iniziale CD34 positiva. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come differenziare cellule staminali pluripotenti umane verso progenitori ematopoietici primitivi o definitivi.