Una fluorescenza a base di linfociti Assay Adatto per high-throughput screening di piccole molecole

L'obiettivo generale di questo test linfocitario basato sulla fluorescenza è quello di identificare nuovi immunomodulatori di piccole molecole. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'immunologia sul meccanismo di attivazione e inibizione dei linfociti. Il vantaggio principale di questa funzione fenotipica e di questo saggio, è che può essere adattato per la scoperta di farmaci.

A dimostrare la procedura sarà Ahmed Fouda, uno studente laureato del nostro laboratorio. Sotto un cappuccio da lavoro sterile, disinfettare il pelo di una femmina di topo Nurr77 GFP di sei-otto settimane con etanolo al 70% e posizionare l'animale sul lato destro. Successivamente, praticare un'incisione nella pelle e nei muscoli del quadrante addominale superiore sinistro e individuare e rimuovere la milza, posizionando il tessuto nel mezzo splenocita sul ghiaccio.

Quando tutte le milze sono state raccolte, trasferire i tessuti in una piastra di coltura cellulare quadrata di 10 centimetri contenente cinque millilitri di terreno splenocitario preriscaldato e utilizzare uno stantuffo a siringa sterile per schiacciare i tessuti fino a quando la soluzione non è torbida. Dopo un'estesa frantumazione in terreno di splenocito, filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 70 micron in una provetta da 50 millilitri per rimuovere eventuali detriti e centrifugare la sospensione a cellula singola risultante. Risospendere il pellet in due o tre millilitri di tampone di lisi dei globuli rossi, immergendo la reazione con cinque millilitri di RPMI, o un altro tampone adatto, dopo 20-30 secondi.

Quindi raccogliere le cellule con un'altra centrifugazione e risospendere il pellet in due millilitri di terreno splenocitario per la conta cellulare. Per isolare le cellule T, centrifugare nuovamente le cellule e risospendere il pellet in terreno RPMI libero dal siero a una concentrazione di una volta 10 per sette cellule per millilitro. Trasferire le cellule in una provetta di polistirene da cinque millilitri e mettere da parte un'aliquota di 100 microlitri di splenociti da utilizzare in seguito per la valutazione della purezza.

Quindi, aggiungere 50 microlitri per millilitro di siero di ratto normale alle cellule, seguito dall'aggiunta di 50 microlitri per millilitro di cocktail di anticorpi per l'isolamento delle cellule T con una miscelazione delicata. Dopo 10 minuti, incubare le cellule con perle magnetiche coniugate con streptavidina per due minuti e mezzo. Quindi, aggiungere il terreno privo di siero alle cellule per un volume finale di due millilitri e mezzo e posizionare la provetta in un magnete di isolamento cellulare per tre minuti.

Al termine dell'incubazione, tenendo il tubo nel magnete, versare il surnatante in un nuovo tubo di polistirene con una sola mossa. Le cellule T possono quindi essere contate. Seminare le cellule T in una piastra a fondo rotondo da 96 pozzetti a una concentrazione di 2,5 volte 10 fino alla quinta cellula per pozzetto contenente 200 microlitri di terreno di splenociti freschi per pozzetto.

Aggiungere l'interleuchina 7 ricombinante e le microsfere magnetiche CD3/CD28 nei pozzetti appropriati e posizionare la piastra in un incubatore per colture cellulari. 12 ore dopo, triturare delicatamente la sospensione cellulare in ciascun pozzetto per rompere eventuali aggregati di perline. Quindi trasferire le sospensioni cellulari da ciascun pozzetto in singole provette di polistirene da cinque millilitri.

Quando tutte le cellule sono state raccolte, posizionare ogni provetta di cellule nel magnete di separazione per cinque minuti alla volta e travasare i surnatanti quando il tubo è ancora all'interno del magnete, in nuove provette di polistirene alla fine di ogni incubazione. Quindi raccogliere le cellule mediante centrifugazione e risospendere i pellet in terreno di splenociti freschi a due volte le concentrazioni di 10-66 cellule per millilitro. Per lo screening ad alto rendimento di piccole molecole, piastra 40 microlitri di cellule per pozzetto in una piastra da 384 pozzetti e tratta i pozzetti appropriati con il farmaco o il veicolo di scelta per il periodo di trattamento desiderato nell'incubatore per colture cellulari.

30 minuti prima dell'analisi GFP, colorare le cellule con la concentrazione appropriata di soluzione di Hoechst, distribuendo accuratamente la macchia con un pipettaggio delicato. Quando tutti i pozzetti sono stati tinti, centrifugare le piastre per raccogliere le cellule sul fondo dei pozzetti e lasciare riposare le cellule per 15 minuti a temperatura ambiente. Caricare la piastra secondo le istruzioni del produttore.

Quindi, imposta l'obiettivo su 40X o superiore. Impostare il numero quattro della fotocamera per la lampada UV, quindi impostare il numero uno della fotocamera per il laser 488. Caricare la lastra sul sistema di vagliatura ad alto contenuto.

Successivamente, impostare il sistema di screening confocale automatizzato ad alto contenuto per leggere da sei a 10 campi per pozzetto con due letture sequenziali per campo, a 488 nanometri e luce UV. Le cellule T CD3 positive rappresentano circa il 30% di una data milza di topo, dimostrando un'espressione basale di GFP del 10%. In seguito alla stimolazione con perline del recettore delle cellule T CD3/CD28, si osserva un aumento da cinque a sei volte della percentuale di espressione di GFP.

Allo stesso modo, le cellule B CD19 positive rappresentano dal 50 al 55% degli splenociti totali con un'espressione basale di GFP simile a quella delle cellule T non attivate. È interessante notare che la stimolazione del recettore delle cellule B utilizzando IgG anti-topo, IgM e CD40L ricombinante, innesca solo un aumento banale dell'espressione di GFP. Dopo l'isolamento delle biglie magnetiche, come appena dimostrato, le cellule T CD3 positive isolate mostrano ancora un'espressione basale di GFP del 10%.

La stimolazione delle microsfere CD3/CD28, tuttavia, induce una significativa sovraregolazione della risposta GFP. Allo stesso modo, dopo l'isolamento delle microsfere magnetiche delle cellule B, le cellule B attivate purificate mostrano una maggiore espressione di GFP rispetto alle cellule B attivate negli splenociti. In questo esperimento rappresentativo, lo screening primario ad alto rendimento di 4398 composti ha rivelato diversi attivatori e inibitori dell'attivazione delle cellule T.

Ma l'espressione di GFP osservata delle cellule T stimolate, 20 volte superiore a quella misurata per le cellule T non stimolate. Consentendo la generazione di una finestra di zona d'azione in cui i composti inibitori della GFP potrebbero essere facilmente rilevati. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in 36-48 ore se eseguita correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di contare le cellule dopo ogni passaggio. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'ELISA o il western blotting per rispondere a qualsiasi altra domanda aggiuntiva. Questa tecnica aprirà la strada alla scoperta di farmaci per l'immunomodulazione nei roditori.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare e attivare le cellule T o B derivate dalle piastre di topo GFP Nurr77.