Name: Una fluorescenza a base di linfociti Assay Adatto per high-throughput screening di piccole molecole (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Scopri un saggio a fluorescenza su linfociti per lo screening ad alto rendimento di piccole molecole immunomodulatrici usando topi Nurr77 GFP. Questo metodo facilita la scoperta di nuovi farmaci.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Questo lavoro è stato sostenuto dai fondi Merck Frosst fase di avviamento concessi da Université de Montréal. Vorremmo ringraziare i dottori Jean Duchaine e Dominic Salois dalla piattaforma high-throughput presso l&#39;Istituto di Ricerca in Immunologia e il cancro per la loro discussione, commenti e feedback. Moutih Rafei detiene una Fonds de la Recherche en Santé du Québec Junior 1 premio.

Tutti i protocolli di animali sono stati approvati dal Comitato di cura degli animali della Université de Montréal. I topi sono stati sacrificati da un graduale inalazione di CO 2 fino a quando non segni vitali sono stati osservati seguiti da dislocazione cervicale. La procedura è stata effettuata da una persona certificata per garantire che gli animali sono stati sacrificati in modo umano e secondo le raccomandazioni del Consiglio canadese sulla cura degli animali. 1. Preparazione di splenocyte Medium e citometria a flusso Buffer <ol><li> Eseguire tutti i passaggi sotto una cappa biologica 70% di etanolo-pulito. </li><li> Rimuovere 70 ml di pre-riscaldato Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 1x medio (disponibile in commercio e fornito in filtrati 500 bottiglie sterili ml di volume) e posto in una provetta sterile. Il mezzo rimosso sarà utilizzato in seguito nel protocollo. </li><li> Supplemento per il restante 430 ml di RPMI 1640 1x con 50 ml inattivato siero fetale bovino (FBS), 5 ml di penicillina / streptomicina, 5mL HEPES, 5 ml aminoacidi non essenziali, 5 mL piruvato di sodio e 0,05 mL filtrati (1M) 2-mercaptoetanolo. NOTA: medio splenocyte Pre-caldo con un bagno d&#39;acqua a 37 ° C per evitare le cellule di calore scioccante. Questo è importante per evitare induzione di apoptosi cellulare. </li><li> Per preparare il buffer di citometria a flusso, aggiungere 2 ml di FBS al 98 ml di tampone fosfato salino (PBS) e conservare in frigorifero fino al momento dell&#39;uso (preferibilmente entro tre giorni). </li></ol> 2. Generazione di splenocyte cellulare sospensione da Nur77 GFP mouse milze <ol><li> Un septically isolare la milza da un 6-8 settimane di età femminile del mouse Nur77 GFP. <ol><li> Per raggiungere questo obiettivo, lavorare sotto cappa sterile. Mettere a bagno i sacrificati del mouse pelliccia, forbici e pinze in etanolo al 70%. </li><li> Posare il mouse sul lato destro, tagliare la pelle ed i muscoli nel quadrante in alto a sinistra addominale. Controllare l&#39;area di incisione per individuare visibilmente la milza poi tagliato fuori. Mantenere la milzain medium splenocyte in ghiaccio fino ad eseguire il passaggio successivo. </li></ol></li><li> Posizionare la milza (s) in 10 cm 2 cella cultura piatto Petri contenente 5 ml di terreno splenocyte pre-riscaldato. </li><li> Schiacciate la milza utilizzando uno stantuffo siringa sterile fino a quando la soluzione è torbida. Una matrice di collagene milza deve rimanere entro la fine della procedura. </li><li> In seguito a un&#39;ampia mashing in media splenocyte, raccogliere la sospensione cellulare e farla passare attraverso un colino cella di 70 micron posto su un tubo da 50 ml per filtrare-out eventuali detriti o coaguli. </li><li> Centrifugare a 500 g per 5 min. Dopo aver scartato il surnatante, risospendere il pellet cellulare in 2-3 ml di tampone di lisi di produzione interna o commerciale globuli rossi. A seguito di pipettaggio (2-3 volte) lasciare che il resto sospensione per 20-30 s. </li><li> Aggiungere 5 ml di PBS o un tampone adatto di scelta quindi centrifugare la sospensione cellulare per 5 minuti a 500 x g. </li><li> Rimuovere il surnatante (dovrebbe essere di colore rosso in quanto contiene lisati rosso bcellule Lood) e risospendere il pellet cellulare in 2 ml di terreno splenocyte. </li><li> Utilizzando un emocitometro, contare il numero di cellule colorate con trypan blu per distinguere tra le cellule necrotiche (vivi e morti). </li></ol> 3. Isolamento cellule T dalla cella di sospensione splenocyte <ol><li> Centrifugare la sospensione cellulare per 5 minuti a 500 x g. Risospendere le cellule in terreno RPMI privo di siero (50 ml dal punto 1.3) per ottenere una concentrazione cellulare di 10 x 10 6 cellule / ml. </li><li> Trasferire le cellule in una provetta da 5 polistirene ed annullare una un&#39;aliquota di 100 ml di splenociti di purezza valutazione / confronto alla fine della fase di purificazione. </li><li> Aggiungere siero normale topo per la sospensione cellulare a 50 microlitri / ml seguito da T anticorpi isolamento cellulare cocktail (50 microlitri / ml). </li><li> Mescolare la sospensione cellulare e lasciare riposare per 10 minuti. Questo passaggio consente il cocktail di anticorpi di legarsi tutte le cellule indesiderate. </li><li> Aggiungere le sfere rapidi streptavidina (magneteperline ic) per 2,5 min, quindi portare il volume a 2,5 ml utilizzando il mezzo privo di siero. </li><li> Posizionare il tubo in un magnete isolamento delle cellule per 3 min. </li><li> Trasferire la sospensione cellulare T in un nuovo tubo polistirene tenendo il magnete e versando la soluzione in un movimento. NOTA: La sospensione isolato contiene le cellule T purificate. Tutte le cellule indesiderate si svolgono sul lato del tubo legato alle perline streptavidina magnetiche. </li><li> Contare le cellule isolate T utilizzando trypan blu e un emocitometro. NOTA: A questo punto la purezza delle cellule T isolate può essere verificata (opzionale) analizzando la percentuale di CD3 + eventi prima e dopo l&#39;isolamento delle cellule T da citofluorimetria. 13 <ol><li> Brevemente, centrifuga 1 ml di sospensione cellulare splenocyte a 500 x g. Eliminare il supernatante e sospendere le cellule in tampone di flusso-citometria ad una concentrazione di 1 x 10 6 cellule / ml. </li><li> Aggiungere fluorescente-tag anti-mousanticorpi e CD3 ad una concentrazione di 1: 100. Incubare a 4 ° C per 30 min. Risciacquare una volta, centrifugare e risospendere in tampone di flusso-citometria (400 mL) per l&#39;analisi mediante citometria a flusso. </li></ol></li></ol> 4. L&#39;isolamento delle cellule B della cella sospensione splenocyte <ol><li> Seguire lo stesso protocollo descritto per le cellule T (passi 3,1-3,8), ma utilizzando un kit di isolamento B-cellule. Per la valutazione purezza, utilizzare l&#39;anticorpo CD19 invece che l&#39;anticorpo CD3. 13 <ol><li> Per la valutazione purezza (opzionale), utilizzare l&#39;anticorpo CD19 invece che l&#39;anticorpo CD3. Centrifugare 1 ml di sospensione cellulare splenocyte a 500 x g. Eliminare il supernatante e sospendere le cellule in tampone di flusso-citometria ad una concentrazione di 1 x 10 6 cellule / ml. </li><li> Aggiungere fluorescente etichettato antitopo-anticorpo CD19 ad una concentrazione di 1: 100 e incubare a 4 ° C per 30 min. Lavare una volta, centrifugare e risospendere in tampone citometria a flusso (400 ml) FOanalisi R da citofluorimetria. </li></ol></li></ol> 5. L&#39;attivazione delle cellule T e l&#39;induzione di espressione GFP <ol><li> Seme le cellule T, in sospensione, in una piastra a 96 pozzetti a fondo tondo a una concentrazione di 2,5 x 10 5 cellule / pozzetto. </li><li> Aggiungere interleuchina ricombinante (IL) -7 a / ml e CD3 / CD28 perline 2 ng magnetiche (25 ml / 10 6 celle). Mantenere una parte delle cellule T non trattate con perline per servire come controllo negativo per misurazioni successive che rappresentano le cellule T non attivati. </li><li> Dodici ore dopo, raccogliere le cellule T dalla piastra a 96 pozzetti pipettando delicatamente la sospensione cellulare in ciascun pozzetto su e giù per rompere le complesse tallone cellule / aggregati. Raccogliere la sospensione da tutti i pozzetti in una provetta di polistirolo 5 ml. </li><li> Posizionare il tubo contenente la sospensione all&#39;interno del magnete stesso isolamento cellulare precedentemente utilizzato per la purificazione delle cellule T o B e lasciare riposare per 5 min. </li><li> Trasferire la sospensione di cellule T intOA nuovo tubo di polistirene tenendo il magnete e versando la soluzione in una sola mossa. </li><li> Centrifugare le cellule a 500 xg per 5 min. Risospendere le cellule in terreno splenocyte fresca per ottenere una concentrazione di 2 x 10 6 cellule / ml. </li><li> Valutare GFP intensità di espressione da citofluorimetria (opzionale per il controllo di qualità) a 12 a 24 ore post-stimolazione in confronto con le cellule T non attivati. 12 NOTA: La fluorescenza GFP è intrinseca alle cellule Nur77 GFP T e si manifesta all&#39;attivazione successo del TCR. 12 </li><li> Per la valutazione della vitalità e attivazione (opzionale) mediante microscopia, macchiare le cellule attivate con Hoechst 30 minuti prima dell&#39;analisi ad una concentrazione di 0,2 mg / ml. Aggiungere adeguato volume di sospensione cellulare ad una diapositiva copertura o ad un pozzetto di una piastra a 384 pozzetti nero-sided a fondo piatto ed esaminare al microscopio a fluorescenza per valutare le cellule viventi. Le cellule morte non manterranno nuclearecolorazione. 14 </li></ol> 6. L&#39;attivazione delle cellule B e l&#39;induzione di espressione GFP <ol><li> Utilizzando un pallone di coltura T-25, risospendere le cellule B isolate a 1 x 10 6 cellule / ml. </li><li> Aggiungere anti-topo IgG / IgM (H + L) a 10 microlitri / ml e CD40L ricombinante ad una concentrazione di 200 ng / mL. Mantenere una parte delle cellule B non trattate per servire come controllo negativo per misurazioni successive (rappresentando cellule B non attivati). </li><li> Valutare GFP intensità di espressione da citofluorimetria a 12 o 24 ore post-stimolazione in confronto con le cellule non attivati ​​B. NOTA: La fluorescenza GFP è intrinseco alle cellule Nur77 GFP B e si manifesta all&#39;attivazione successo del BCR. 12 </li><li> Per la valutazione della vitalità e attivazione (opzionale) mediante microscopia, macchiare le cellule attivate con Hoechst 30 minuti prima dell&#39;analisi ad una concentrazione di 0,2 mg / mL. Aggiungere un adeguato volume di sospensione cellulare perun vetrino di copertura o per un pozzo di una piastra a 384 pozzetti nero-sided a fondo piatto ed esaminare al microscopio a fluorescenza per valutare le cellule viventi. Le cellule morte non mantengono la colorazione nucleare. 14 </li></ol> 7. High Throughput Screening di piccole molecole <ol><li> Preparare una sospensione di cellule a 2 x 10 6 cellule / ml delle cellule T o B attivate (sfere magnetiche o anticorpi / CD40L) o gruppi non attivati. </li><li> Piastra 75.000 cellule / pozzetto in una piastra da 384 pozzetti (volume di 40 mL). Utilizzare una piastra a 384 pozzetti nero-sided a fondo piatto o un vetrino da microscopio copertura per la vitalità e l&#39;attivazione di valutazione al microscopio a fluorescenza (fase di controllo della qualità opzionale prima di HTS) usando Hoechst macchia (vedere i passaggi 5.8 e 6.4 per i dettagli). 14 </li><li> Manualmente o tramite un sistema automatizzato, aggiungere i farmaci di scelta (disciolto in 0,5% DMSO) in ciascun pozzetto. </li><li> Aggiungere il veicolo (DMSO) a positivo (attivato) e negativo (non activato) pozzetti di controllo. Regolare la concentrazione DMSO ad un massimo dello 0,5%. </li><li> Incubare le piastre per 24 h (o l&#39;incubazione momento della scelta) a 37 ° C e 5% di CO 2. </li><li> Il giorno dello screening, diluire la soluzione 33342 macchia Hoechst (1:. 3.333; per esempio, aggiungere 10 microlitri di cellule in piastre da 384 pozzetti per generare un volume totale di 50 microlitri). Stain 30 min prima dell&#39;analisi GFP aggiungendo soluzione Hoechst per ottenere una concentrazione di 0,2 mg / mL. </li><li> Delicatamente pipetta le cellule su e giù per ottenere una distribuzione omogenea in ciascun pozzetto. NOTA: Questo passaggio è importante in caso di erogazione dei farmaci (passo 7.3) utilizzando un sistema automatico le cellule tendono ad accumularsi su un lato del pozzo, opposta alla direzione del flusso. </li><li> Spin le piastre a 45 xg per 3 min a temperatura ambiente. </li><li> Lasciare le piastre a riposo per 15 min a temperatura ambiente. </li><li> Eseguire piastra (s) read-out, utilizzando i confocale SCRE automatizzati ad alto contenutoSistema zare (HCS). 15 Caricare la lastra alla macchina. Impostare l&#39;obiettivo a 40X o superiore ingrandimento. Usa fotocamera # 4 per Hoechst (lampada UV) e fotocamera # 1 per GFP (laser 488). Impostare la macchina per leggere 6-10 campi per bene. Regolare la macchina per fare due letture sequenziali per campo a 488 nm (per leggere GFP) e ai raggi UV (per leggere Hoechst). Impostare l&#39;obiettivo a 40X o superiore ingrandimento. NOTA: Il sistema è un microscopio computerizzato che non richiede alcuna regolazione. La distanza focale, l&#39;intensità della luce incidente e il tempo di esposizione sono tutti configura automaticamente dalla macchina. </li></ol>

<ol><li>Swinney, D. C., Anthony, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+were+new+medicines+discovered%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">How were new medicines discovered.</a> Nat Rev Drug Discov. 10 (7), 507-519 (2011).</li>
<li>Macarron, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+high-throughput+screening+in+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Impact of high-throughput screening in biomedical research.</a> Nat Rev Drug Discov. 10 (3), 188-195 (2011).</li>
<li>Lokey, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward+chemical+genetics%3A+progress+and+obstacles+on+the+path+to+a+new+pharmacopoeia%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Forward chemical genetics: progress and obstacles on the path to a new pharmacopoeia.</a> Curr Opin Chem Biol. 7 (1), 91-96 (2003).</li>
<li>Hall, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoproteomics-driven+drug+discovery%3A+addressing+high+attrition+rates%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">Chemoproteomics-driven drug discovery: addressing high attrition rates.</a> Drug Discov Today. 11 (11-12), 495-502 (2006).</li>
<li>Pruss, R. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20942792">Phenotypic screening strategies for neurodegenerative diseases: a pathway to discover novel drug candidates and potential disease targets or mechanisms.</a> CNS Neurol Disord Drug Targets. 9 (6), 693-700 (2010).</li>
<li>St Onge, R., Schlecht, U., Scharfe, C., Evangelista, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward+chemical+genetics+in+yeast+for+discovery+of+chemical+probes+targeting+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Forward chemical genetics in yeast for discovery of chemical probes targeting metabolism.</a> Molecules. 17 (11), 13098-13115 (2012).</li>
<li>Houston, J. G., Banks, M. N., Binnie, A., Brenner, S., O'Connell, J., Petrillo, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Case+study%3A+impact+of+technology+investment+on+lead+discovery+at+Bristol-Myers+Squibb%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">Case study: impact of technology investment on lead discovery at Bristol-Myers Squibb.</a> Drug Discov Today. 13 (1-2), 44-51 (2008).</li>
<li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).</li>
<li>Walters, W. P., Namchuk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+screens%3A+how+to+make+your+hits+a+hit%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Designing screens: how to make your hits a hit.</a> Nat Rev Drug Discov. 2 (4), 259-266 (2003).</li>
<li>Zheng, W., Thorne, N., McKew, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+screens+as+a+renewed+approach+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">Phenotypic screens as a renewed approach for drug discovery.</a> Drug Discov Today. 18 (21-22), 1067-1073 (2013).</li>
<li>Malo, N., Hanley, J. A., Cerquozzi, S., Pelletier, J., Nadon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+practice+in+high-throughput+screening+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Statistical practice in high-throughput screening data analysis.</a> Nat Biotechnol. 24 (2), 167-175 (2006).</li>
<li>Moran, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor+signal+strength+in+Treg+and+iNKT+cell+development+demonstrated+by+a+novel+fluorescent+reporter+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">T cell receptor signal strength in Treg and iNKT cell development demonstrated by a novel fluorescent reporter mouse.</a> J Exp Med. 208 (6), 1279-1289 (2011).</li>
<li>Kovacic, N., Müthing, J., Marusic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistological+and+Flow+Cytometric+Analysis+of+Glycosphingolipid+Expression+in+Mouse+Lymphoid+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Immunohistological and Flow Cytometric Analysis of Glycosphingolipid Expression in Mouse Lymphoid Tissues.</a> J Histochem Cytochem. 48, 1677-1689 (2000).</li>
<li>Shapiro, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+estimation+of+DNA+and+RNA+content+in+intact+cells+stained+with+hoechst+33342+and+pyronin+Y%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric estimation of DNA and RNA content in intact cells stained with hoechst 33342 and pyronin Y.</a> Cytometry. 2, 143-150 (1981).</li>
<li>Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+content+screening%3A+seeing+is+believing%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">High content screening: seeing is believing.</a> Trends Biotechnol. 28 (5), 237-245 (2010).</li>
<li>An, W. F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19347618">Fluorescence-based assays.</a> Methods Mol Biol. 486, 97-107 (2009).</li>
<li>Kishimoto, H., Sprent, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strong+TCR+ligation+without+costimulation+causes+rapid+onset+of+Fas-dependent+apoptosis+of+naive+murine+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Strong TCR ligation without costimulation causes rapid onset of Fas-dependent apoptosis of naive murine CD4+ T cells.</a> J Immunol. 163 (4), 1817-1826 (1999).</li>
<li>Schluns, K. S., Kieper, W. C., Jameson, S. C., Lefrancois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-7+mediates+the+homeostasis+of+naive+and+memory+CD8+T+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Interleukin-7 mediates the homeostasis of naive and memory CD8 T cells in vivo.</a> Nat Immunol. 1 (5), 426-432 (2000).</li>
<li>Jiang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+of+IL-7%2C+a+key+lymphotrophin%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine+Growth+Factor+Rev%22%5BJournal%5D)">Cell biology of IL-7, a key lymphotrophin.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 16 (4-5), 513-533 (2005).</li>
<li>Koenen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutually+exclusive+regulation+of+T+cell+survival+by+IL-7R+and+antigen+receptor-induced+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Mutually exclusive regulation of T cell survival by IL-7R and antigen receptor-induced signals.</a> Nat Commun. 4, 1735(2013).</li>
<li>Vella, A., Teague, T. K., Ihle, J., Kappler, J., Marrack, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin+4+%28IL-4%29+or+IL-7+prevents+the+death+of+resting+T+cells%3A+stat6+is+probably+not+required+for+the+effect+of+IL-4%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Interleukin 4 (IL-4) or IL-7 prevents the death of resting T cells: stat6 is probably not required for the effect of IL-4.</a> J Exp Med. 186 (2), 325-330 (1997).</li>
<li>Hawkins, C. J., Vaux, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+Bcl-2+family+of+apoptosis+regulatory+proteins+in+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Immunol%22%5BJournal%5D)">The role of the Bcl-2 family of apoptosis regulatory proteins in the immune system.</a> Semin Immunol. 9 (1), 25-33 (1997).</li>
<li>Sumantran, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+chemosensitivity+assays%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cellular chemosensitivity assays: an overview.</a> Methods Mol Biol. 731, 219-236 (2011).</li>
<li>Huh, S., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18304834">A cell-based system for screening hair growth-promoting agents.</a> Arch Dermatol Res. 301 (5), 381-385 (2009).</li>
<li>Weiss, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TCR+signal+transduction%3A+opening+the+black+box%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">TCR signal transduction: opening the black box.</a> J Immunol. 183 (8), 4821-4827 (2009).</li>
<li>Noel, P. J., Boise, L. H., Green, J. M., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD28+costimulation+prevents+cell+death+during+primary+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD28 costimulation prevents cell death during primary T cell activation.</a> J Immunol. 157 (2), 636-642 (1996).</li>
<li>Michels, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-based+selection+of+small+molecules+to+alter+allele-specific+MHC+class+II+antigen+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Structure-based selection of small molecules to alter allele-specific MHC class II antigen presentation.</a> J Immunol. 187 (11), 5921-5930 (2011).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Diversi metodi read-out sono stati sfruttati per lo sviluppo di saggi HTS sensibili ed affidabili. Questi includono colorimetrica, luminescenti o metodi fluorescenti. Anche se i metodi colorimetrici sono semplici da set-up, che richiedono più aggiunte di sostanze chimiche, che possono interferire o disturbare le cellule in fase di sperimentazione. 23 Inoltre, essi non consentono valutazione dinamica di una risposta biologica come effetto farmacologico è valutata a un endpoint specifico. Inoltre, ...

screening ad alto rendimento (HTS) è una strategia collaudata ampiamente adottata per l&#39;identificazione di nuove molecole terapeutiche o per il riposizionamento dei farmaci approvati dalla FDA a nuove indicazioni mediche. 1 Finora, il successo ottenuto HTS può essere misurata dalla pletora di farmaci precedentemente scoperto. Per esempio, l&#39;inibitore lapatinib tirosina chinasi utilizzato per il trattamento del cancro al seno, sitagliptin; un inibitore della dipeptidil peptidasi-4 (DPP-4) inibitore utilizzato come un farmaco anti-iperglicemici, e la Bcr-Abl dasatinib inibitore della tirosin-chinasi orale, usati per il trattamento della leucemia mieloide cronica rappresentano alcuni esempi di una lunga lista di farmaci approvati originariamente scoperti da HTS. 2 Sebbene la produttività dell&#39;industria farmaceutica ha recentemente sofferto di una mancanza nella scoperta di nuove entità chimiche, la probabilità di scoperta di farmaci successo può essere migliorata attraverso un aumento del numero di candida pre-clinicates visualizzazione modulatori proprietà biologiche / biochimiche. Di conseguenza, lo sviluppo di nuovi test HTS adatti per lo screening fenotipico potrebbe offrire il potenziale per fornire importanti strumenti farmacologici per la scoperta di nuovi successi di droga. 3, 4, 5, 6, inoltre, HTS possono ora essere eseguiti a un ritmo più veloce a causa di significative trasformazioni tecnologiche degli ultimi anni inclusi gli impianti progettati su misura flessibili robot, tecnologie di read-out nuovi e ampie miniaturizzazione. 2, 7 Tra i fattori che contribuiscono al crescente interesse per l&#39;uso dello screening fenotipico (aka avanti farmacologia) è la percezione che concentrarsi sugli effetti funzionali, piuttosto che ipotesi riduzioniste semplificate in materia di bersagli molecolari (di screening / reazioni biochimiche di obiettivi) è più probabile per sho<html> w efficacia clinica. Così, lo screening fenotipico mantiene la promessa per scoprire nuovi composti potenzialmente terapeutici e meccanismi molecolari di malattie attualmente incurabili. 2 Per identificare correttamente inibitori o attivatori di un determinato bersaglio molecolare o la funzione cellulare, un saggio altamente sensibile e affidabile è necessario al fine di differenziare tra i colpi in buona fede e falsi positivi. Quindi, ciò che rende un buon test? La qualità di un determinato dosaggio deve essere dapprima giudicato dal rapporto segnale-rumore (riflessa attraverso un fattore Z). 8 In secondo luogo, l&#39;effetto mirato o l&#39;obiettivo dello schermo devono essere chiaramente stabiliti. Ad esempio, gli approcci basati su cellule funzionali in grado di offrire vantaggi significativi per lo screening dei recettori in contrapposizione a un test specificamente progettato per valutare ligando-recettore vincolante. La ragione di questo è che quest&#39;ultimo approccio non può distinguere tra agonisti e antagonisti ligandi.ss = &quot;xref&quot;&gt; 9 Al contrario, un approccio a base di cellule è probabilmente più efficace in funzione del recettore può essere valutata direttamente in un fenotipo biologica (proliferazione, arresto del ciclo cellulare, apoptosi, e / o differenziazione). Tuttavia, si deve notare che saggi biochimici possono fornire vantaggi significativi rispetto saggi fenotipici poiché violano su uno specifico bersaglio intracellulare. Un test biochimico ben ottimizzato in genere hanno meno dispersione dei dati di uno screening fenotipico, semplificando dopo indagini connesse con il meccanismo molecolare della droga di azione. Tuttavia, il grave inconveniente di saggi di obiettivi o biochimica è la possibilità di amplificare il tasso di risultati falsi positivi che possono influenzare obiettivi non specifici quando testato in un sistema biologico (perdita della specificità originariamente studiato nel saggio biochimico). 10 Anche se un punto di cut-off ormai consolidata tra i colpi negativi e positivi può ridurre al minimo il numero di falsi positivi in screening preliminare, l&#39;uso di un sistema fisiologicamente rilevanti mimando l&#39;ambiente cellulare nativo come le cellule intatte, tessuti interi o intero animale rimane il nucleo del pendolo disegno dosaggio. Pertanto, lo screening fenotipico consente scoperta vantaggio con effetti fenotipici biologici / desiderabili per le malattie senza bersagli farmacologici identificati senza avere una conoscenza preventiva di attività o modalità di azione del composto. 11 Lo studio qui riguarda lo sviluppo e la sperimentazione di uno screening fenotipico ottimizzato e riproducibili sulla base di due componenti importanti: un modello di topo disponibile in commercio e un cluster sotto-famiglia di composti chimici. Rispetto al modello animale, il saggio si basa sull&#39;impiego di linfociti derivati da un ceppo di topi (Nur77 GFP) ospitare un cromosoma artificiale batterico contenente una cassetta in cui l&#39;espressione della proteina fluorescente verde (GFP) è azionato da the Nur77 promotore. 12 La caratteristica di questa stimolazione è basata sul fatto che Nur77 è immediatamente gene precoce up-regolata seguente recettore delle cellule T (TCR) o stimolazione del recettore delle cellule B (BCR). 12 Per quanto riguarda il metodo di screening per sé, un approccio è stato utilizzato per contribuire ad evitare la proiezione di analoghi banali riducendo al minimo il tempo necessario per valutare una grande libreria chimica (&gt; 10 5 composti). Per fare ciò, una banca dati di composti chimici selezionati dai chimici medicinali che utilizzano strumenti di screening virtuali è stata sfruttata per identificare i composti topologicamente simili utilizzando note strutture di semi attivi come riferimenti. Questo approccio ci ha permesso di selezioniamo 4.398 composti che rappresentano una libreria complessiva di oltre 136.000 entità chimiche.

<table><tbody><tr><td>Topi Nur77GFP</td><td>Il</td><td>ceppo di topo Jackson Laboratory n. 016617</td><td>Una colonia interna è stata stabilita presso la nostra struttura per animali&nbsp;</td></tr><tr><td>piastre di coltura a 96 pozzetti-U, sterili</td><td>VWR International</td><td>10062-902</td><td>Attivazione delle cellule T utilizzando le microsfere magnetiche</td></tr><tr><td>70 &; filtro per cellule m, sterile</td><td>Corning Inc.</td><td>352350</td><td>Generazione di splenociti sospensione cellulare</td></tr><tr><td>5 ml di polistirene a fondo tondo, sterile</td><td>Corning Inc.</td><td>352058</td><td>Generazione di splenociti in sospensione cellulare</td></tr><tr><td>50 ml in polipropilene a fondo conico, sterili</td><td>VWR International</td><td>89039-656&nbsp;</td><td>Generazione di sospensione cellulare di splenociti</td></tr><tr><td>Siringa da 10 ml senza ago, sterile</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>305482</td><td>Per schiacciare la milza</td></tr><tr><td>Pallone di coltura T-25</td><td>Greiner Bio-One</td><td>690 175</td><td>Per incudabte le cellule B durante l'attivazione</td></tr><tr><td>Piatto di coltura cellulare da 5 ml, sterile</td><td>Greiner Bio-One</td><td>627 160</td><td>Per schiacciare la milza</td></tr><tr><td>Penicillina- Streptomicina (10.000 U/mL)</td><td>WISENT Inc.</td><td>450-200-EL&nbsp; &nbsp;</td><td>Componente del mezzo splenocitario</td></tr><tr><td>RPMI 1600 con bicarbonato di sodio e L-glutammina</td><td>WISENT Inc.</td><td>350-002-CL&nbsp;</td><td>Componente del mezzo splenocitario</td></tr><tr><td>Aminoacidi non essenziali MEM</td><td>WISENT Inc.</td><td>321-010-EL&nbsp;</td><td>Componente del mezzo splenocitario</td></tr><tr><td>HEPES acido libero 1 M</td><td>WISENT Inc.</td><td>330-050-EL&nbsp;</td><td>Componente del mezzo splenocitario</td></tr><tr><td>Soluzione di piruvato di sodio (100mM)</td><td>WISENT Inc.</td><td>600-110-EL&nbsp;</td><td>Componente del mezzo splenocitario</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)&nbsp;</td><td>WISENT Inc.</td><td>080-910&nbsp;</td><td>Componente del terreno splenocitario e tampone per citometria a flusso</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>WISENT Inc.</td><td>311-010-CL</td><td>Componente del tampone per citometria a flusso</td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanolo (55 mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21985-023</td><td>Componente del terreno splenocitico Kit di</td></tr><tr><td>isolamento delle cellule</td><td>T Stemcell Technologies</td><td>19851</td><td>Per isolare le cellule T</td></tr><tr><td>Kit di isolamento delle cellule B</td><td>Stemcell Technologies</td><td>19854</td><td>Per isolare le cellule B</td></tr><tr><td>Attivatore T di topo CD3/CD28 superparamagnetico perline</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11452D</td><td>Per attivare le cellule T&nbsp;</td></tr><tr><td>Magnete di isolamento cellulare</td><td>Stemcell Technologies</td><td>18000</td><td>Per isolare le cellule T e rimuovere le perle magnetiche&nbsp;</td></tr><tr><td>AffiniPure F(ab')2 Frammento di capra Anti-topo IgG + IgM (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.</td><td>115-006-068</td><td>Per stimolare le cellule B</td></tr><tr><td>Ricombinante Murina IL-7</td><td>Peprotech</td><td>217-17&nbsp;</td><td>Per supportare la sopravvivenza delle cellule T durante l'attivazione</td></tr><tr><td>CD40L R& Ricombinante</td><td> D Systems</td><td>8230-CL/CF</td><td>Per stimolare le cellule B</td></tr><tr><td>Anticorpo CD3 anti-topo</td><td>BD Pharmingen</td><td>561799</td><td>Per colorare le cellule T per citometria a flusso</td></tr><tr><td>Anticorpo CD19 anti-topo</td><td>BD Pharmingen</td><td>553786</td><td>Per colorare le cellule B per la citometria a flusso</td></tr><tr><td>Biomek FXp</td><td>PerkinElmer Inc.</td><td>A31842</td><td>Per risospendere le cellule dopo 24 ore di incubazione</td></tr><tr><td>Opera Phenix High Content Screening System</td><td>PerkinElmer Inc.</td><td>HH14000000</td><td>Per analizzare il segnale GFP/Hoechst</td></tr></tbody></table>

una fluorescenza a base di linfociti assay adatto per high-throughput screening di piccole molecole

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

lo screening high-throughput (HTS) è attualmente il pilastro per l&#39;identificazione delle entità chimiche in grado di modulare le reazioni biochimiche o processi cellulari. Con l&#39;avanzamento delle biotecnologie e l&#39;alto potenziale traslazionale di piccole molecole, un certo numero di approcci innovativi nella scoperta di nuovi farmaci si sono evoluti, il che spiega il rinnovato interesse per l&#39;uso di HTS. Il campo oncologico è attualmente l&#39;area di ricerca più attive per lo screening di stupefacenti, senza alcun importante passo avanti fatto per l&#39;identificazione di nuovi composti immunomodulanti di targeting complicazioni trapianto legati o disturbi autoimmuni. Qui, vi presentiamo un romanzo in test di linfociti fluorescente a base murino vitro facilmente adattato per l&#39;identificazione di nuovi composti immunomodulatori. Questo saggio utilizza cellule T o B derivati ​​da un topo transgenico, in cui il promotore Nur77 spinge espressione GFP upon T- o stimolazione del recettore B-cellule. Poiché l&#39;intensità GFP riflette laAttivazione / attività trascrizionale della cellula bersaglio, il nostro saggio definisce un nuovo strumento per studiare l&#39;effetto di dato composto (s) in risposte cellulari / biologiche. Per esempio, uno screening primario è stato eseguito utilizzando 4.398 composti in assenza di un &quot;ipotesi target&quot;, che ha portato all&#39;identificazione di 160 potenziali risultati che mostrano attività immunomodulante. Pertanto, l&#39;uso di questo dosaggio è adatto per i programmi di scoperta di nuovi farmaci che esplorano grandi librerie chimiche prima di proseguire in vitro che in vivo studi / validazione.

Progettazione del saggio HTS Due fattori importanti sono stati presi in considerazione quando si progetta il test qui fluorescente. In primo luogo, abbiamo bisogno di replicare una condizione fisiologica in cui l&#39;attivazione delle cellule T o B rappresenterebbe una malattia (ad esempio la malattia del trapianto contro l&#39;ospite). In secondo luogo, la valutazione di attivazione cellulare deve essere effettuata util...

Presentiamo in questo studio un test basato sulla fluorescenza romanzo utilizzando linfociti derivati ​​da un topo transgenico. Questo test è adatto per high-throughput screening (HTS) di piccole molecole dotate di capacità di una inibizione o la promozione di attivazione dei linfociti.

Una fluorescenza a base di linfociti Assay Adatto per high-throughput screening di piccole molecole

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

L'obiettivo generale di questo saggio linfocitario basato sulla fluorescenza è identificare nuovi immunomodulatori di piccole molecole. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'immunologia riguardo i meccanismi di attivazione e inibizione dei linfociti. Il principale vantaggio di questo saggio funzionale fenotipico è che può essere adattato alla scoperta di farmaci.La procedura sarà dimostrata da Ahmed Fouda, uno studente laureato del nostro laboratorio. Sotto una cappa a flusso laminare sterile, disinfettare il pelo di un topo femmina Nurr77 GFP di età compresa tra sei e otto settimane con etanolo al 70%, quindi posizionare l'animale sul fianco destro. Successivamente, praticare un'incisione nella cute e nei muscoli del quadrante addominale superiore sinistro, individuare la milza ed estrarla, ponendo il tessuto in un mezzo per splenociti posto sul ghiaccio.Dopo aver raccolto tutte le milze, trasferire i tessuti in una piastra per colture cellulari da 10 centimetri quadrati contenente cinque millilitri di mezzo per splenociti preriscaldato ed utilizzare lo stantuffo di una siringa sterile per macerare i tessuti fino a quando la soluzione div

a-fluorescence-based-lymphocyte-assay-suitable-for-high-throughput

Research

Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

In questo video, descriviamo un metodo che evidenzia l'utilità del saggio di bioluminescenza per lo screening sensibile e rapido dei farmaci. Questi farmaci possono essere testati da soli o in combinazione per valutare il sinergismo nel loro meccanismo d'azione.

Saggio basato sulla bioluminescenza cellulare: un metodo ad alto rendimento per lo screening combinatorio di farmaci

Questo video dimostra lo screening di composti immunomodulatori tramite test basati sulla fluorescenza. I linfociti T transgenici derivati da topi con cassette di espressione proteica fluorescente verde sono trattati con questi composti. I segnali GFP potenziati e ridotti consentono l'identificazione degli effetti stimolatori e inibitori dei composti, rispettivamente.

Un test basato sulla fluorescenza che utilizza linfociti ingegnerizzati per lo screening di composti immunomodulatori

Vi presentiamo un metodo di screening rapido e poco costoso per identificare regolatori trascrizionali utilizzando high-throughput transfezioni robotici e un dual-bagliore saggio di luciferasi in casa. Questo protocollo genera rapidamente dati scalo side-by-side funzionali per migliaia di geni ed è facilmente modificabile per indirizzare qualsiasi gene di interesse.

High-throughput screening funzionale utilizzando una casalinga Dual-glow Luciferase Assay

Il raggiungimento di un livello di sistemi di comprensione dei processi cellulari è un obiettivo di biologia cellulare moderna. Descriviamo qui le strategie per multiplazione reporter luciferasi di varia funzione cellulare end-point per interrogare la funzione del gene utilizzando genoma scala librerie di RNAi.

Una piattaforma di screening Luciferase basata multiplex per interrogare il cancro-associata trasduzione del segnale in cellule in coltura

Qui descriviamo un saggio genetico reporter basato su cellule come uno strumento prezioso per lo screening di librerie chimiche per composti che modulano i meccanismi di controllo post-trascrizionale esercitati attraverso 3' UTR.

Screening ad alto rendimento per i modulatori chimici di Genes post-trascrizionale regolamentati

È stato sviluppato un test in tempo reale ad alta produttività per identificare contemporaneamente (1) antimicrobici penetranti nelle cellule eucariotiche che prendono di mira un patogeno batterico intracellulare e (2) valutare la citotossicità delle cellule eucariotiche. Una variante della stessa tecnologia è stata successivamente combinata con la tecnologia di dispensazione digitale per consentire studi di sinergia facili, ad alta risoluzione, dose-risposta e bidimensionali e tridimensionali.

High Throughput, in tempo reale, Dual-lettura Prove di intracellulare antimicrobica attività e eucariotica citotossicità cellulare

Abbiamo sviluppato un sistema di screening ad alto rendimento modulare per scoprire nuovi composti contro Mycobacterium tuberculosis, il targeting intracellulare e in brodo coltura di batteri e citotossicità contro la cellula ospite di mammifero.

Sistema per l&#39;efficacia e la citotossicità Proiezione di inibitori di targeting intracellulare<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Questo documento utilizza un flusso cytometry-test per librerie di schermo di inibitori chimici per l'identificazione di inibitori e ai loro obiettivi che influenzano la segnalazione del ricevitore della T-cellula. I metodi descritti qui possono essere espanso per high throughput screening.

Identificazione dei mediatori del T-cell Receptor segnalazione tramite lo Screening di librerie chimiche inibitore

Le DNA metiltransferasi sono potenziali bersagli di farmaci antitumorali. Qui, viene presentato un protocollo per valutare piccole molecole per l'inibizione della DNA metiltransferasi. Questo test utilizza un'endonucleasi per accoppiare la metilazione del DNA alla generazione di fluorescenza e consente di monitorare l'attività enzimatica in tempo reale.

Saggio di metilazione del DNA accoppiato a endonucleasi a fluorescenza continua per lo screening degli inibitori della DNA metiltransferasi

Questo studio ha sviluppato un test per lo screening ad alto rendimento contro Mycobacterium abscessus con un ceppo doppio reporter di recente creazione, utilizzando la fluorescenza e la luminescenza per valutare rapidamente la vitalità batterica. Questo protocollo sarà rilevante per i ricercatori che mirano a selezionare nuovi farmaci contro questo batterio resistente ai farmaci.

Sviluppo di saggi per lo screening di farmaci ad alto rendimento contro i micobatteri

Questo rapporto descrive un protocollo automatizzato per saggi di immunofluorescenza multiplex (mIF) su un coloratore automatico per vetrini. Dimostra l'elevata riproducibilità della proteomica spaziale su autocoloratori tissutali standard ad alto rendimento e imager a fluorescenza su vetrini interi, ideale per saggi mIF personalizzati su un gran numero di vetrini tissutali nella ricerca traslazionale.

Saggi automatizzati di immunofluorescenza multiplex ad alto rendimento per la ricerca traslazionale

Scopri un saggio a fluorescenza su linfociti per lo screening ad alto rendimento di piccole molecole immunomodulatrici usando topi Nurr77 GFP. Questo metodo facilita la scoperta di nuovi farmaci.

Una fluorescenza a base di linfociti Assay Adatto per high-throughput screening di piccole molecole

Esplora altri video