Campo locale microscopia a fluorescenza: Imaging segnali cellulari nei cuori Intact
8 marzo 2017
Nel cuore, eventi molecolari coordinare le funzioni elettriche e contrattili dell'organo. Un insieme di campo fluorescenza tecniche di microscopia locali qui presentati consente la registrazione di variabili cellulari nei cuori intatti. Identificare i meccanismi che definiscono la funzione cardiaca è fondamentale per capire come funziona il cuore in situazioni patologiche.
L'obiettivo generale di questa tecnica di imaging al microscopio a fluorescenza a campo locale è quello di utilizzare sonde molecolari per misurare i livelli intracellulari di calcio o i potenziali di membrana provenienti da regioni cardiache di difficile accesso a livello dell'intero cuore. Questo metodo può aiutarci a rispondere a domande cardiovascolari chiave relative all'arresto cardiaco e all'ischemia. Il vantaggio principale di questa tecnica è che le proprietà cardiache vengono misurate dagli eventi cellulari nell'organo intatto in cui le cellule continuano ad essere accoppiate elettricamente, meccanicamente e metabolicamente.
Per prima cosa, preparare l'apparecchio orizzontale di Langendorff. Caricare la soluzione di Tyrode appena preparata nelle siringhe da 60 millilitri e aggiungere tutti i tubi associati alla configurazione. Una volta riempito, eliminare tutte le bolle d'aria.
Quindi, equilibrare la soluzione caricata con ossigeno gassoso puro erogato da una pietra porosa di plastica sommersa. Quindi, posiziona una sutura chirurgica non assorbibile attorno a un ago. Questo servirà come cannula per retroperfondere il cuore quando è collegato all'apparato.
Successivamente, raccogli il cuore dopo aver iniettato eparina e soppresso l'animale. Per prima cosa, pulisci il torace con etanolo. La dimostrazione è con un topo, ma la stessa procedura funziona per la raccolta del cuore di parrocchetto.
Successivamente, usando le forbici da dissezione, praticare un'incisione nell'addome inferiore e poi tagliare i lati verso il collo. Quindi, tagliare con cura il diaframma, evitando il cuore. Ora, tira indietro il fazzoletto tagliato e fissalo.
Quindi, rimuovi i polmoni e i tessuti circostanti per esporre il cuore. Una volta esposto, usa una pinzetta per estrarre il cuore senza schiacciarlo. Staccalo dall'animale tagliando l'aorta e lascia quanta più aorta possibile attaccata al cuore.
Quindi, caricare il cuore in una piccola barca di pesatura con un millilitro di soluzione di Tyrode. Sotto un microscopio da dissezione, rimuovere rapidamente il sangue e il tessuto adiposo che circonda il cuore usando una pinzetta e le forbici. Utilizzando una sutura chirurgica non assorbibile e un ago, collegare l'aorta alla connessione orizzontale dell'apparecchio di Langendorff.
Fissare il nodo con due pinzette sottili. Quindi, iniziare la retroperfusione aprendo la valvola per rilasciare la soluzione di Tyrode. Pulisci il tessuto circostante e aspira i detriti per mantenere pulita la camera orizzontale mentre il cuore si stabilizza per 10 minuti.
Rendi la tintura fresca. Per Rhod-2 AM, aggiungere 20 microlitri di 20% Pluronic e DMSO alla confezione da 50 microgrammi di colorante del produttore. Miscelare pipettando, evitando la formazione di bolle.
Quindi, trasferire il colorante liquefatto in una fiala di vetro trasparente e aggiungere un millilitro di soluzione di Tyrode. Sciogliere accuratamente il colorante in questa miscela utilizzando da 15 a 20 minuti di sonicazione. Successivamente, perfondere il colorante preparato utilizzando una pompa peristaltica a temperatura ambiente.
Innanzitutto, caricare il colorante nella camera del colorante, quindi bloccare tutte le linee di tubi collegate al collettore e mantenere i morsetti sopra il collettore per evitare il riflusso. Quindi, accendere la pompa e chiudere immediatamente la valvola a tre vie sotto la siringa da 60 millilitri. Posizionare il tubicino attaccato all'estremità di aspirazione della pompa vicino al cuore per far ricircolare il colorante dopo che è stato perfuso.
Prendi un ago di piccolo calibro e pizzeggialo attraverso l'apice per alleviare la pressione. Quindi, lascia che il cuore si perfondi con il colorante per 30 minuti. Durante questo periodo, è molto importante valutare il livello del colorante in modo che le bolle non entrino nel tessuto, causando ischemia e danni ai tessuti.
Dopo aver perfuso il colorante, retroperfondere il cuore con la soluzione di Tyrode. Rimuovere la fascetta sopra il collettore. Aprire la valvola, quindi lasciare che il cuore si stabilizzi per 10 minuti.
Durante la retroperfusione, riempire la camera orizzontale con la soluzione di Tyrode e accendere l'unità Peltier per portare la temperatura del bagno a 37 gradi Celsius. Per preparare la fibra ottica per l'esperimento, posizionare prima la fibra ottica all'interno di una pipetta da due millilitri. E poi collegare la pipetta a un micromanipolatore.
Utilizzare il micromanipolatore per premere leggermente la fibra ottica contro la superficie del ventricolo laterale. Successivamente, programmare un generatore di onde per fornire un impulso quadrato con una larghezza di un millisecondo. E imposta uno stimolatore cardiaco da sincronizzare esternamente e collegare al generatore di onde.
A ciascuna delle due uscite dello stimolatore, collegare un filo con un ago per agopuntura saldato all'estremità. Attacca due aghi per agopuntura all'apice del cuore, a circa tre millimetri di distanza. Solo una volta posizionati gli aghi, avviare lo stimolatore, evitando così urti accidentali.
Ora, per registrare il segnale epicardico, regolare la frequenza di acquisizione nel software a 10 kilohertz. Per raccogliere il segnale endocardico, seguire la stessa procedura, ma utilizzare un ago calibro 23 per praticare un foro nel ventricolo laterale vicino al setto. E poi, usando un micromanipolatore, posizionare la seconda fibra ottica nell'endocardio.
Per accedere alla funzione transmurale, è stata confrontata la morfologia dei potenziali d'azione registrati dall'endocardio e dall'epicardio. Le registrazioni della fluorescenza sono state effettuate dopo aver trattato il cuore con di-8-ANEPPS utilizzando la tecnica CLFFM. Il potenziale d'azione era più lento nell'endocardio, in particolare nella fase uno.
La durata del potenziale d'azione è stata descritta come il tempo necessario al potenziale d'azione per ripolarizzarsi in una certa misura. Quando le durate sono state normalizzate e spostate in modo da sovrapporsi alla fase zero, è stato possibile confrontarle. C'è stata effettivamente una differenza significativa durante la prima fase.
Successivamente, Rhod-2 AM è stato utilizzato per monitorare il calcio intracellulare. Al fine di confrontare le differenze regionali nel calcio intracellulare, è stata valutata la cinetica della transitorietà del calcio. In confronto, il tempo per il picco della transitorietà era di circa due millisecondi più lungo nell'endocardio.
Nel complesso, la transitorietà del calcio dall'endocardio aveva una cinetica significativamente più lenta rispetto all'epicardio. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere utilizzata per registrare la transitorietà intracellulare del calcio e i potenziali d'azione in regioni di difficile accesso nel cuore. La parte di Langendorff della configurazione rende molto pratico perfondere diverse sostanze chimiche nel cuore e valutare gli effetti sulle proprietà cardiache.
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Panoramica
Questo articolo presenta una tecnica di microscopia a fluorescenza a campo locale per misurare i livelli intracellulari di calcio e i potenziali di membrana nel cuore. Questo metodo consente lo studio della funzione cardiaca in organi integri, fondamentale per comprendere condizioni come l'arresto cardiaco e l'ischemia.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Fisiologia cardiovascolare
- Microscopia a fluorescenza
- Tecniche di imaging cellulare
Sfondo
- Comprendere la funzione cardiaca è essenziale per affrontare le malattie del cuore.
- I metodi tradizionali potrebbero non raggiungere efficacemente tutte le regioni cardiache.
- La microscopia a fluorescenza del campo locale offre un approccio innovativo per lo studio delle cellule cardiache.
- Questa tecnica mantiene l'integrità del coupling cellulare nel cuore.
Scopo dello studio
- Misurare il calcio intracellulare e i potenziali di membrana nel cuore.
- Esplorare i meccanismi della funzione cardiaca in condizioni patologiche.
- Fornire informazioni sugli eventi cardiovascolari come l'arresto cardiaco e l'ischemia.
Metodi Utilizzati
- Preparazione dell'apparato di Langendorff orizzontale.
- Caricamento della soluzione di Tyrode nelle siringhe.
- Eliminazione delle bolle d'aria dal sistema.
- Utilizzo di sonde molecolari per le misurazioni.
Risultati principali
- Misurazione riuscita di variabili cellulari in cuori integri.
- Dimostrazione dell'efficacia della tecnica nell'accedere a regioni difficili.
- Informazioni ottenute sulle proprietà elettriche e meccaniche delle cellule cardiache.
- Applicazioni potenziali nella comprensione delle patologie cardiache.
Conclusioni
- La tecnica di microscopia a fluorescenza del campo locale è preziosa per la ricerca cardiaca.
- Questo metodo migliora la nostra comprensione del funzionamento del cuore in condizioni fisiologiche e patologiche.
- Studi futuri potranno sfruttare questa tecnica per ottenere approfondimenti più dettagliati sulla salute cardiovascolare.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Contenuto
La microscopia a fluorescenza con campo locale consente la misurazione del calcio intracellulare e dei potenziali di membrana in cuori integri, preservando il coupling cellulare fondamentale per comprendere l'ischemia e le aritmie. Questo approccio supporta la validazione degli obiettivi fornendo dati fisiologicamente rilevanti da tessuti elettricamente e meccanicamente accoppiati, migliorando la fiducia predittiva nei modelli preclinici. La tecnica facilita la riduzione del rischio meccanicistico collegando i segnali molecolari alla funzione dell'intero organo nella ricerca sulle malattie cardiovascolari.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Convalida del Target
- Valore scientifico: Verifica ipotesi terapeutiche misurando i transitori di calcio e i potenziali d'azione nel miocardio integro in condizioni di accoppiamento fisiologico.
- Valore operativo: Permette la validazione funzionale di bersagli in sistemi rilevanti per la malattia, dove i modelli di cellule isolate non riescono a riprodurre la dinamica a livello tissutale.
- Valore predittivo: Supporta la selezione di portafoglio identificando composti in grado di normalizzare la cinetica intracellulare del calcio nelle regioni endocardiche ed epicardiche.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Prepara sistemi biologici validati per analisi successive, stabilendo segnali di fluorescenza di base in cuori perfusi.
- Output quantitativo: Genera misurazioni riproducibili della cinetica dei transitori di calcio e della durata del potenziale d'azione per la valutazione dell'effetto dei composti.
- Riutilizzo della piattaforma: Consente la scalabilità su modelli di roditori mediante perfusione Langendorff, permettendo un'acquisizione costante dei segnali nei flussi di screening cardiovascolare.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per la malattia: Modella i meccanismi di ischemia e aritmia monitorando le differenze regionali nel controllo del calcio e nella ripolarizzazione nei cuori integri.
- Continuità traslazionale: Collega la scoperta alla validazione preclinica mantenendo l'accoppiamento elettrotonico e metabolico durante l'intervento farmacologico.
- Decisioni basate sul rischio: Guida i criteri di avanzamento attraverso cambiamenti quantificabili nella morfologia del potenziale d'azione e nella transitorietà del calcio nei tessuti malati rispetto a quelli trattati.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nei flussi di lavoro della ricerca cardiovascolare, dall'analisi iniziale del bersaglio fino alla validazione preclinica, supportando l'identificazione dei composti promettenti fornendo dati sui segnali contestualizzati dal punto di vista fisiologico.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi misurando il calcio in compartimenti specifici (citoplasmatico rispetto al reticolo sarcoplasmatico) e il potenziale di membrana in tessuto integro.
- Screening: Fornisce preparazioni pronte per i saggi con letture fluorescenti stabili per valutare gli effetti dei composti sull'elettrofisiologia cardiaca e sulla gestione del calcio.
- Analisi: Fornisce variabili quantitative dipendenti, tra cui il tempo di picco della transitorietà del calcio, la durata del potenziale d'azione e parametri di ripolarizzazione specifici per fase, utili per il confronto tra gruppi.
- Ricerca traslazionale: Collega le misurazioni molecolari alla funzione dell'organo intero, consentendo l'allineamento di biomarcatori in modelli preclinici di disfunzione cardiaca.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per la valutazione del rischio cardiovascolare in diversi settori terapeutici mediante rilevamento fluorescente standardizzato basato sul metodo Langendorff.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica correlando i segnali subcellulari con la fisiologia d'organo integra in modelli di malattia cardiovascolare.
- Valore operativo: Garantisce la riproducibilità mediante un caricamento standardizzato del colorante, della perfusione e del posizionamento della fibra ottica nel sistema Langendorff.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione dello sviluppo identificando precocemente alterazioni elettrofisiologiche e nel metabolismo del calcio prima di costosi fallimenti in fasi avanzate.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione di composti in base a rischio, basata su cinetiche normalizzate del potenziale d'azione e dei transitori di calcio in cuori malati rispetto a cuori recuperati.
Considerazioni relative all'implementazione
- Richiede competenze nella dissezione cardiaca, nella perfusione Langendorff e nella preparazione di coloranti fluorescenti (ad esempio, Rhod-2 AM, di-8-ANEPPS).
- È dipendente da un sistema di microscopia a fibra ottica, da generatori d'onda per la stimolazione e da sistemi di acquisizione ad alta frequenza (10 kHz).
- Necessita di una standardizzazione interfunzionale tra i team di fisiologia, imaging e farmacologia per garantire la coerenza del segnale.
- Richiede considerazioni di adattamento per diverse specie (topo, parrocchetto) e regioni ventricolari (epicardio, endocardio) durante la misurazione dei gradienti transmurale.
- È limitato dall'efficienza del caricamento del colorante e dagli artefatti di movimento durante la perfusione, che devono essere controllati per evitare ischemia o alterazioni del segnale.
