Name: Campo locale microscopia a fluorescenza: Imaging segnali cellulari nei cuori Intact (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Scopri la microscopia a fluorescenza a campo locale per misurare calcio intracellulare e potenziali di membrana in cuori intatti. Questa tecnica consente di studiare l'arresto cardiaco e l'ischemia preservando l'accoppiamento cellulare.

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Ringraziamo il Dott Alicia Mattiazzi per la discussione critica del lavoro presentato. Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione da NIH (R01 HL-084.487) per ALE.

Questo protocollo e tutto il trattamento i topi è stato approvato dal Institutional Animal Care e Usa Comitato UC Merced (n ° 2008-201). Esperimenti con parrocchetti sono stati condotti nel 1999 secondo le norme generali per uso animale stabilito dalla commissione scientifica dell&#39;Istituto venezuelano per la Ricerca Scientifica (IVIC). 1. Langendorff Set Up Preparazione <ol><li> Preparare la soluzione di Tyrode contenente le seguenti concentrazioni di soluto in mM: 140 NaCl, KCl 5,4, 2 CaCl 2, 1 MgCl 2, 0,33 Na 2 HPO 4, 10 glucosio, 10 HEPES. Regolare il pH della soluzione Tyrode a 7,4 con NaOH e filtrare la soluzione attraverso un filtro di 0,22 micron. </li><li> Caricare la soluzione Tyrode nei 60 ml siringhe e tutti i tubi del Langendorff orizzontale set-up 11, 12 illustrati nella figura 4. Assicurati di eliminare tutte le bolle d&#39;aria. </li><li><strong&gt; soluzione Equilibrare Tyrode con 100% O 2 utilizzando un &quot;pietra dell&#39;aria&quot; plastica sommerso come illustrato nella figura 4. <ol><li> Collegare tubazione di plastica ad un serbatoio di O 2. </li><li> Aggiungere un adattatore Tee plastica per abbassare un tubo 5 &quot;nella soluzione Tyrode in 60 mL siringa. </li><li> Attaccare una pietra dell&#39;aria plastica alla fine del tubo 5 &quot;così O 2 si bolla fuori nella soluzione Tyrode. </li></ol></li><li> Collocare una sutura chirurgica non assorbibile intorno un ago usato come cannula. L&#39;ago è accoppiato al collettore (vedi Figura 4) che permette retro-perfusione con soluzioni diverse. Infine, l&#39;aorta del cuore sarà incannulata nell&#39;ago. </li></ol> 2. Preparazione degli animali e di cuore Dissection <ol><li> Pesare e iniettare il mouse con eparina (es. Mouse di peso 20 g, iniettare con 20 unità o 200 mL) 15 minuti prima eutanasia da dislocazione cervicale. Anestetizzare parrocchetti secondo to le guide uso animale del vostro protocollo IACUC e poi procedere con la dislocazione cervicale. NOTA: utilizzare 8 settimane di età topi o 20 g di parrocchetti. </li><li> Rimuovere il cuore dalla cavità toracica dopo euthanization. Estrarre cuori parakeet esattamente nello stesso modo descritto per i topi. <ol><li> Pulire il petto del mouse con etanolo. </li><li> Utilizzando forbici dissezione, fare un&#39;incisione nel basso addome e poi tagliare i lati verso il collo. </li><li> Tirare indietro il tessuto tagliato e pin verso il basso. </li><li> Tagliare il diaframma. Fare attenzione quando si taglia il diaframma per evitare di danneggiare il cuore. </li><li> Rimuovere i polmoni e il tessuto circostante. </li><li> Utilizzare le pinzette per raccogliere il cuore senza schiacciarla. Tagliare l&#39;aorta a lungo possibile. </li></ol></li><li> Trasportare il cuore su una piccola barca pesare con circa 1 mL di soluzione Tyrode. </li><li> Utilizzando una sutura chirurgica non riassorbibile, legare l&#39;aorta sopra l&#39;apparato Langendorff orizzontale tramite unago. Legare l&#39;aorta cuore con l&#39;ausilio di due pinzette sottili. Iniziare retro-perfusione aprendo la valvola posta in serie con le siringhe 60 ml contenente soluzione Tyrode. </li><li> Lasciare che il cuore si stabilizzi per 10 min. Utilizzare questo tempo per pulire il sangue e il tessuto adiposo che circonda il cuore prima di caricare il colorante. Estrarre il tessuto adiposo vicino alla base del cuore con le pinzette e tagliato con piccole forbici dissezione. Essere sicuri di fare questo sotto la vista di un microscopio da dissezione. </li></ol> 3. Ca citosolico 2+ Misure: Preparing Dye Rhod-02:00 <ol><li> Aggiungere 20 ml di Pluronic 20% (un tensioattivo non ionico) in DMSO ad una speciale fiala di plastica confezionato fornito dal produttore tintura contenente 50 ug del colorante. </li><li> Mescolare pipettando su e giù, evitando le bolle. </li><li> Trasferire il DMSO miscelato con il tensioattivo non ionico e il colorante dalla speciale fiala di plastica confezionato in una fiala di vetro chiaro. Aggiungere 1 ml di Tyrode Soluzione al flaconcino di vetro trasparente. </li><li> Con ultrasuoni per 15-20 minuti in un bagno sonicatore. </li><li> Profumato il colorante usando pompe peristaltiche per 30 minuti a temperatura ambiente. <ol><li> Posizionare il colorante nella camera di tintura. </li><li> Utilizzare un morsetto meccanico per comprimere tutte le altre linee di tubi collegati al collettore. La pinza è disposto sopra il collettore. Questo impedirà qualsiasi riflusso nel tubo collegato ai 60 siringhe ml. </li><li> Accendere la pompa peristaltica perfusione per iniziare circola il colorante. Immediatamente chiudere la valvola a 3 vie al di sotto del 60 mL siringa. </li><li> Posizionare un piccolo tubo che è collegato all&#39;aspirazione della pompa peristaltica accanto al cuore per ricircolare il colorante che è stato perfuso nel cuore. </li></ol></li></ol> 4. Intra-SR Ca 2+ Misure: Preparing Dye Mag-Fluo4AM <ol><li> Preparare Mag-Fluo4AM nello stesso modo come Rhod-2 del mattino. Fare riferimento alla Sezione 3 per le istruzioni passo-saggio. </li><li> after caricare il colorante, aprire la valvola posta in serie con le siringhe 60 ml contenente soluzione Tyrode iniziare retro-perfusione. Assicurarsi di rimuovere la fascetta sopra il collettore. </li><li> Aggiungere la soluzione Tyrode alla camera orizzontale e riscaldare a 37 ° C. </li><li> Retro-nei profumi con la soluzione Tyrode per 45 minuti per rimuovere il colorante citosolico. </li></ol> 5. potenziale di membrana Misure: Preparing Dye Di-8-ANEPPS <ol><li> Aggiungere 5 ml di 99% di etanolo al flaconcino di colorante che contiene 5 mg del colorante. </li><li> Aliquota 10 ml in 500 singoli 1 fiale di plastica ml con una pipetta ripetitore. </li><li> Desiccate nel vuoto velocità e conservare a -20 ° C. </li><li> Aggiungere 20 ml di 20% Pluronic in DMSO ad una fiala di plastica con 10 ug del colorante essiccato. </li><li> Mescolare pipettando su e giù, evitando le bolle. </li><li> Trasferire la miscela contenente DMSO con Pluronic e colorante dalla fiala di plastica ad un cilindro graduato (10 mL). Aggiungere la soluzione Tyrode ad un vo finalelume di 5 ml. </li><li> Con ultrasuoni per 20-25 minuti in un bagno sonicatore. </li><li> Profumato nel cuore per 30 minuti utilizzando pompe peristaltiche. Fare riferimento alle istruzioni graduali nella Sezione 3.5. </li></ol> 6. La registrazione di segnali epicardici <ol><li> Dopo aver caricato il colorante, retro-defluire in cuore con soluzione Tyrode rimuovendo la pinza sopra il collettore. Aprire la valvola posta in serie al ml siringa da 60 contenente soluzione Tyrode. soluzione Tyrode Retro-nei profumi per 10 minuti per stabilizzare il cuore. </li><li> Riempire la camera orizzontale con soluzione Tyrode e accendere l&#39;unità Peltier per portare la temperatura del bagno a 37 ° C. </li><li> Posizionare la fibra ottica sulla superficie del cuore. <ol><li> Posizionare la fibra ottica all&#39;interno di una pipetta 2 ml e quindi collegare la pipetta ad un micromanipolatore. </li><li> Utilizzare il micromanipolatore per premere leggermente la fibra ottica contro la superficie del LV. </li></ol></li><li> Esternamente ritmo il heaRT con uno stimolatore controllato da un generatore di onde. <ol><li> Programmare il generatore di onde fornire un impulso quadrato con una larghezza di 1 ms. </li><li> Impostare lo stimolatore essere sincronizzato esternamente e collegare l&#39;ingresso esterno al generatore d&#39;onda. </li><li> Per ogni uscita dello stimolatore, collegare un filo con un ago da agopuntura saldato alla fine. </li><li> Posizionare entrambi aghi nel vertice del cuore circa 3 mm l&#39;uno dall&#39;altro. </li><li> Solo dopo gli aghi vengono inseriti nel tessuto, attivare l&#39;uscita dello stimolatore per evitare scosse elettriche. </li></ol></li><li> Nel software di acquisizione, regolare frequenza di acquisizione a 10 kHz. </li></ol> 7. La registrazione di segnali endocardici <ol><li> Fare riferimento al punto 6.1 e 6.2 per stabilizzare il cuore dopo aver caricato il colorante. </li><li> Utilizzando un punto 23Ga tagliente delle dimensioni della fibra ottica, fare un piccolo foro nella superficie del cuore nel LV vicino al setto. </li> &lt;li&gt; Inserire un adattatore chirurgia sclerotomie intravitreale per aiutare nel posizionamento della prima fibra ottica nella endocardio con un micromanipolatore. </li><li> Esternamente stimolare il cuore. Fare riferimento al punto 6.4. </li><li> Nel software di acquisizione, regolare frequenza di acquisizione a 10 kHz. </li></ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo documento è centrato nel descrivere le tecniche di campo fluorescenza locali per valutare la funzione dei miociti cardiaci ex vivo. Lo studio di queste cellule in un ambiente accoppiata non solo è più fisiologico, ma è anche molto appropriato per valutare patologie a livello di organo. Gli eventi cellulari sottostanti accoppiamento eccitazione-contrazione (ECC) possono essere valutati a livello organo complesso con l&#39;uso di sonde molecolari che controllano intracellulari Ca 2+ dinamiche (R...

Il cuore è l&#39;organo centrale del sistema cardiovascolare. Contrazione del cuore viene avviata da un aumento intracellulare [Ca 2+]. Il rapporto tra eccitabilità elettrica e cambiamenti in intracellulare Ca 2+ stampa è stato storicamente studiato in cellule dissociate enzimaticamente 1, 2. Tuttavia, le cellule cardiache sono elettricamente, metabolicamente e meccanicamente accoppiati 3, 4. Quando isolato, i miociti non sono solo fisicamente disaccoppiati, ma miociti da diversi strati si mescolano durante la dissociazione 5. Inoltre, nonostante gli enormi vantaggi emersi dallo studio delle cellule isolate in condizioni clamp tensione, 6, 7, 8, la natura intrinseca del cuore come un sincizio alwa elettricoys pone la questione di come funzionalmente differenti sono dissociate cellule da quelli presenti nel tessuto 3. In questo manoscritto, descriviamo i progressi conseguiti nella conoscenza della fisiologia cardiaca mediante l&#39;uso di tecniche di microscopia locale campo fluorescenza (LFFM) nel cuore intatto. LFFM utilizza indicatori fluorescenti per misurare più variabili fisiologiche come citosolico Ca 2+, intra sarcoplasmatico reticolo (SR) Ca 2+ e potenziale di membrana. Queste misure possono essere ottenuti simultaneamente e in collaborazione con la pressione del ventricolo 9, 10, elettrocardiogrammi 9, potenziali d&#39;azione elettrici (AP), le registrazioni corrente ionica e flash fotolisi di composti in gabbia 4, 11. Inoltre, queste misurazioni possono essere ottenute stimolazione cuore intatto a frequenze superiori closer per i tassi fisiologici. Sebbene numerosi articoli 9, 11, 12, 13, 14 sono stati pubblicati dal nostro gruppo utilizzando tecniche LFFM, la presunzione di complessità tecniche associate con questa tecnica ha impedito l&#39;uso massiccio nello studio ex vivo fenomeni fisiologici nel cuore e altri organi. La tecnica LFFM (Figura 1) è basata su misurazioni epifluorescenza ottenuti utilizzando una fibra ottica multimodale in contatto con il tessuto. Come qualsiasi tecnica di imaging contatto di fluorescenza, la risoluzione ottica dipende dal diametro e l&#39;apertura numerica (NA) della fibra. Un diametro maggiore NA e più piccola della fibra aumenta la risoluzione spaziale delle misurazioni. AN e diametri delle fibre può variare da 0.22 a 0,66 e da 50 micron a 1 mm rispettivamente. Incordonatura la NA migliorerà il rapporto segnale-rumore (S / N) accettando fotoni che arrivano da un angolo solido più ampio. Per agire come dispositivo epifluorescenza, il fascio di luce viene focalizzato nella fibra ottica con una lente asferica o un obiettivo epifluorescenza dove la NA della lente e la partita fibra. Questa corrispondenza massimizza il trasferimento di energia per l&#39;eccitazione e per raccogliere indietro i fotoni emessi dal fluoroforo. Per eccitare gli indicatori fluorescenti esogeni caricati nel tessuto, diverse fonti di luce e modalità di illuminazione possono essere utilizzati. I nostri studi pionieristici che utilizzano il pulsato campo locale microscopia a fluorescenza 3, 12 (PLFFM) impiegato un laser a basso costo picosecondi (Figura 1a, PLFFM). Questo tipo di sorgente luminosa ha l&#39;enorme vantaggio di eccitare una grande frazione di molecole fluoroforo sotto l&#39;area di illuminazione, senza candeggio sostanzialmente il colorante a causaper il breve impulso durate 12. Inoltre, l&#39;uso di impulsi ultracorti ha permesso di valutare la durata della fluorescenza del colorante 12. La durata della fluorescenza è una proprietà che può essere utilizzato per quantificare la frazione di molecole di colorante legate al Ca 2+. Purtroppo, il jitter temporale degli impulsi e le variazioni di ampiezza di impulso a impulso limitare l&#39;applicazione di questa strategia sperimentale ai casi in cui la variazione di fluorescenza prodotta dal legame al colorante legante è grande. Continuous Wave (CW) laser sono di solito usati come fonte di illuminazione principale di LFFM (figura 1b, CLFFM). Il raggio laser può illuminare continuamente il tessuto oppure può essere ferroelectrically modulata. La modulazione ferroelettrico del fascio permette la generazione di impulsi di luce microsecondi. Questa modulazione può essere controllato da hardware esterno. Questa procedura non solo riduce drasticamente tha jitter temporale degli impulsi di luce, ma permette anche fasci di diverse lunghezze d&#39;onda di miscelazione. La miscelazione di fasci avviene multiplazione raggi di laser diversi. Di conseguenza, diversi coloranti aventi differenti proprietà spettrali possono essere eccitati per effettuare misurazioni di una serie di variabili fisiologiche, per esempio, Rhod-2 per citosolico Ca 2+, MagFluo4 per intra-SR Ca 2+ e di-8-ANEPPS per potenziale di membrana. Sebbene laser presentano diversi vantaggi come la sorgente luminosa in LFFM, altri tipi di sorgenti di luce possono essere utilizzati compresi diodi emettitori di luce (LED). In questo caso, la sorgente di luce di eccitazione costituito da un LED InGaN (Figura 1c, PLEDFM). In LED, i fotoni vengono emessi spontaneamente quando elettroni dalla banda di conduzione si ricombinano con fori nella banda di valenza. La differenza con laser a stato solido è che l&#39;emissione non viene stimolato da altri fotoni. Ciò si traduce in un fascio non coerente euna emissione spettrale più ampia per i LED. Diversi tipi di LED ad alta potenza possono essere utilizzati. Per le registrazioni AP utilizzando Di-8-ANEPPS e Ca 2+ transitori registrati utilizzando Fluo-4 o Mag-Fluo-4, abbiamo utilizzato un LED che ha un&#39;emissione tipica picco a 485 nm (blu) e mezzo larghezza di 20 nm (Figura 1d). Per Ca 2+ transitori registrati con Rhod-2, il LED ha una emissione tipica picco a 540 nm (verde) e mezza la larghezza di 35 nm (Figura 1d). LED emettono in una lunghezza d&#39;onda di banda e quindi richiedono filtri per restringere la propria emissione spettrale. Inoltre, la luce pulsata può essere generata ad una velocità di 1,6 kHz con durata di 20 ms. I LED sono state pulsate con un transistore ad effetto di campo MOSFET di potenza veloce. registrazioni simultanee con differenti indicatori possono essere eseguite da time-multiplexing i LED. Sfortunatamente, la luce emessa dai LED è più difficile mettere a fuoco su una fibra ottica rispetto ad un fascio laser. Così, il principale svantaggio di noiing LED è che i loro profili di emissione hanno spostamenti angolari (± 15 °) rispetto all&#39;asse principale e un ottica ausiliaria devono essere utilizzati per correggerlo. In tutte le configurazioni ottiche precedentemente descritte, la luce di eccitazione viene riflessa con l&#39;aiuto di uno specchio dicroico. Il fascio viene successivamente focalizzata da una lente asferica e un obiettivo microscopio su una fibra ottica multimodale che è posizionato sul tessuto. Come in qualsiasi disposizione epifluorescenza, lo specchio dicroico serve anche per separare l&#39;eccitazione dalla luce emessa. Lo spettro della luce emessa viaggia indietro attraverso un filtro barriera per rimuovere ogni eccitazione riflessa. Infine, la luce emessa è focalizzato con un obiettivo su un fotorivelatore (Figura 1). La trasduzione dalla luce a corrente elettrica viene eseguita da fotodiodi a valanga silicio. Questi diodi hanno una risposta veloce e una sensibilità elevata che consente il rilevamento di scarsa luminosità. Ilfotocorrente prodotto dai fotodiodi a valanga può essere amplificato in due modi: un amplificatore di transimpedenza avente un elemento resistivo di retroazione (Figura 1e) o da un integratore per convertire la corrente in una tensione (Figura 1f). Utilizzando il primo approccio, la tensione di uscita è proporzionale alla fotocorrente e la resistenza di feedback. Un tipico esempio di rilevamento resistivo di impulsi laser picosecondi è illustrata nelle figure 2a, 2b e 2c. Pannello 2a illustra l&#39;uscita dell&#39;amplificatore transimpedenza e il pannello 2b mostra un&#39;espansione tempo dell&#39;intervallo indicato con un asterisco (*). Un algoritmo di picco di tracciamento è stato realizzato per rilevare il picco (rosso) e la base (verde) per le risposte fluorescenti 12. La misurazione della fluorescenza di base fornisce informazioni sia della corrente scura del fotodiodo a valanga e le interferenze introdotto da lig ambientHT e accoppiamento elettromagnetico. Una rappresentazione di picchi e basi è mostrato in figura 2c. Questa figura illustra la fluorescenza emessa dal colorante (Rhod-2) legato a Ca 2+ durante il ciclo cardiaco di un cuore che batte pappagallo. Nel secondo metodo, la tensione di uscita dell&#39;integratore è una funzione della retroazione di corrente e capacitivi (figure 2d, 2e, 2f e). Figura 2f mostra due cicli consecutivi di integrazione: la prima senza illuminazione esterna e la seconda con impulsi luminosi applicati da un LED pulsata. Una descrizione dettagliata è presentato nelle figure 2g e 2h. Questo approccio, sebbene più laboriosa, fornisce una grande S / N per l&#39;assenza di rumore termico nel condensatore di retroazione. Lo strumento comprende una fase di temporizzazione che genera tutto il controllo e multiplazione della luce di eccitazione e comanda l&#39;integrazione headstage e resperiodi et. Questo è di solito eseguita con un circuito di elaborazione del segnale digitale che svolge anche una differenziazione digitale del segnale di uscita integrato calcolando una regressione on-line dei dati. Nel caso di utilizzo di un risposte resistivo, qualsiasi scheda di acquisizione A / D può essere utilizzato. Infine, la nostra tecnica LFFM è estremamente versatile e può essere adattato per registrare da più di una regione. Aggiunta di un divisore di fascio nel percorso ottico consente di suddividere la luce in due fibre ottiche. Ciascuna fibra ottica può quindi essere posizionato su diverse regioni di un tessuto, in modo indipendente, eccitare ed emissione registrare da sonde fluorescenti esogeni. Questa modifica ci permette di valutare come anatomica differenze regionali influenzano variabili fisiologiche. La figura 3 mostra un divisore di fascio essendo impiegato per dividere la luce di eccitazione CW sono usati in modo tale che due fibre ottiche per misurare transmurale intracellulare elettrico o [Ca 2+] i livelli ingegnoh minore invasività. segnali transmurale possono essere registrati mettendo una fibra sul endocardio e l&#39;altra sullo strato epicardio della parete ventricolare. Pertanto, la tecnica LFFM ha la capacità di misurare l&#39;andamento temporale dei segnali cellulari in diverse regioni e può essere utilizzato per verificare se i cambiamenti regionali verificano in situazioni patologiche.

<table><tbody><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Sigma</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-glucosio</td><td>Sigma</td><td>50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Sigma</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>7365-45-9</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di sodio</td><td>Sigma</td><td>10049-21-5</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di cloruro di calcio</td><td>Sigma</td><td>10043-52-4</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di cloruro di magnesio</td><td>Sigma</td><td>7786-30-3</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di sodio</td><td>Sigma</td><td>S-8045</td><td></td></tr><tr><td>0,2 &mu; m filtro a membrana in nylon</td><td>Whatman</td><td>7402-004</td><td></td></tr><tr><td>Collettore MPP</td><td>Warner</td><td>64-0216&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>21G1.5 Ago di scorrimento di precisione</td><td>BD</td><td>305167</td><td></td></tr><tr><td>Nero Corda di seta intrecciata (sutura chirurgica non assorbibile)</td><td>AllMech Tech</td><td>LOOK-SP105</td><td></td></tr><tr><td>Iniezione di eparina sodica 1000USP/mL</td><td>AllMech Tech</td><td>NDC63323-540-11</td><td></td></tr><tr><td>DMSO D8779</td><td>Sigma</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>Blebbistatin</td><td>Sigma</td><td>856925-71-8</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127 soluzione al 20%</td><td>Biotium</td><td>59004</td><td></td></tr><tr><td>Materflex C/L pompa peristaltica</td><td>Cole-Parmer</td><td>77122-26</td><td></td></tr><tr><td>Stimolatore Isostim</td><td>World Precision Instruments</td><td>A320RC</td><td></td></tr><tr><td>Generatore di forme d'onda</td><td>Teledyne Lecroy</td><td>WaveStation 2012</td><td></td></tr><tr><td>Pulitore ad ultrasuoni FS20</td><td>Fisher Scientific</td><td>1533530</td><td></td></tr><tr><td>Tygon tubo ID: 1/32 "OD: 3/32" Parete 1/32 "</td><td>Fornitura componenti</td><td>TET-031A</td><td></td></tr><tr><td>Tygon tubo ID: 3/32" OD: 5/32" Parete 1/32 "</td><td>Fornitura componenti</td><td>TET-094A</td><td></td></tr><tr><td>Adattatore luer lock a valvola a 3 vie</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-31200-80</td><td></td></tr><tr><td>Adattatori a T e raccordi in plastica</td><td>Cole-Parmer</td><td>6365-90</td><td></td></tr><tr><td>Morsetto in plastica</td><td>WaterZoo</td><td>2465</td><td></td></tr><tr><td>Peltier</td><td>TE Technology</td><td>TE-127-2.0-2.5</td><td></td></tr><tr><td>Rhod-2AM</td><td>ThermoFisher Scientific R1245MP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Di-8-ANEPPS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D3167</td><td></td></tr><tr><td>Mag-Fluo-4AM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>M14206</td><td></td></tr><tr><td>Aghi per agopuntura</td><td>LHASA</td><td>TC1.20x13</td><td></td></tr><tr><td>Siringa BD da 60 mL con luer-lok</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-820-11</td><td></td></tr><tr><td>LabView</td><td>National Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Speed vacuum Eppendorf Vagufuge</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-748-13</td><td></td></tr><tr><td>Circuito di elaborazione del segnale digitale DSP TMS 320</td><td>Texas Instrument</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Specchio dicroico passa-lungo 567 nm</td><td>ThorLabs</td><td>DMLP567L</td><td></td></tr><tr><td>Obiettivo 10X NA 0.25 DIN AchromaticFinite Intl Standard Objective</td><td>Edmund Optics</td><td>Stock# 33-437</td><td></td></tr><tr><td>Obiettivo 20X NA 0.40 DIN Acromatico Finite Intl Standard Objective</td><td>Edmund Optics</td><td>Stock# 33-438</td><td></td></tr><tr><td>Filtro in vetro colorato passa-lungo 590 nm&nbsp;</td><td>ThorLabs</td><td>FGL590</td><td></td></tr><tr><td>Laser Nd-YAG verde 532 nm, 500 mW</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipolatore per laser</td><td>Siskiyou</td><td>MX130R</td><td></td></tr><tr><td>Multimodale fibra ottica 200 &; m NA 0.39</td><td>ThorLabs</td><td>FT200UMT</td><td></td></tr><tr><td>LED blu</td><td>Lumileds</td><td>L135-B475003500000</td><td></td></tr><tr><td>LED verde</td><td>Lumileds</td><td>L135-G525003500000</td><td></td></tr><tr><td>Divisore di fascio a cubo, non polarizzante</td><td>ThorLabs</td><td>BS007</td><td></td></tr><tr><td>36" Lunghezza, guida ottica a coda di rondine</td><td>Edmund Optics</td><td>54-402</td><td></td></tr><tr><td>2.5" Larghezza, supporto a coda di rondine</td><td>Edmund Optics</td><td>54-404</td><td></td></tr><tr><td>0,75" Corsa, stadio micrometrico</td><td>Edmund Optics</td><td>37-983</td><td></td></tr><tr><td>Guida ottica a coda di rondine 3"</td><td>ThorLabs</td><td>RLA075/M</td><td></td></tr><tr><td>Portarotaia a coda di rondine 1"</td><td>ThorLabs</td><td>RC1</td><td></td></tr><tr><td>Fotodiodo a valanga Helix 902</td><td>Digi-Key</td><td>HELIX-902-200</td><td></td></tr><tr><td>Supporto obiettivo XY Traduttore& nbsp;</td><td>ThorLabs</td><td>ST1XY-S</td><td></td></tr><tr><td>Breadboard in alluminio 6" x 6"</td><td>ThorLabs</td><td>MB6</td><td></td></tr><tr><td>Nexus tavolo ottico 4' x 6'ThorLabs</td><td></td> <td>T46HK</td><td></td></tr><tr><td>Viti a testa cilindrica in acciaio inossidabile</td><td>ThorLabs</td><td>HW-KIT5/M</td><td></td></tr><tr><td>Foglio acrilico</td><td>Home Depot/Lowes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sylgard Kit elastomero siliconico</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Gel epossidico</td><td>Walmart/Home Depot</td><td>2 parti 5 min clr 1oz</td><td></td></tr><tr><td>21G1.5 Ago di scorrimento di precisione</td><td>BD</td><td>305167</td><td></td></tr><tr><td>23G Ago di scorrimento di precisione</td><td>BD</td><td>305145</td><td></td></tr><tr><td>Base di montaggio, 25 mm x 75 mm x 10 mm</td><td>ThorLabs</td><td>BA1/M</td><td></td></tr><tr><td>Scaffalature in filo metallico 36"</td><td>Alera</td><td>AALESW59PO36SR</td><td></td></tr><tr><td>Ripiani in filo metallico</td><td>Alera</td><td>ALESW582424SR</td><td></td></tr><tr><td>Morsetto per perno e angolo</td><td>ThorLabs</td><td>SWC/M-P5</td><td></td></tr><tr><td>Siringa in vetro per camera di tintura</td><td>Wheaton</td><td>W851020</td><td></td></tr><tr><td>Tappo in gomma</td><td>Home Science Tools</td><td>CE-STOP01C</td><td></td></tr></tbody></table>

campo locale microscopia a fluorescenza: imaging segnali cellulari nei cuori intact

Local Field Fluorescence Microscopy: Imaging Cellular Signals in Intact Hearts

Nel cuore, studi di segnalazione molecolare sono di solito eseguite nei miociti isolati. Tuttavia, molte situazioni patologiche come ischemia e aritmie possono essere pienamente comprese solo a livello organo complesso. Qui, presentiamo la tecnica spettroscopica locale microscopia a campo a fluorescenza (LFFM) che permette la misurazione di segnali cellulari nel cuore intatto. La tecnica si basa sulla combinazione di un cuore perfuso Langendorff e fibre ottiche per registrare segnali fluorescenti. LFFM ha varie applicazioni nel campo della fisiologia cardiovascolare per studiare cuore in condizioni normali e patologiche. variabili cardiaci multipli possono essere monitorati utilizzando indicatori fluorescenti differenti. Questi includono citosolico [Ca 2+], intra-sarcoplasmatico reticolo [Ca 2+] e potenziali di membrana. Le sonde fluorescenti esogeni sono eccitati e la fluorescenza emessa rilevati con tre diverse disposizioni della tecnica LFFM epifluorescenzas presentato in questo articolo. Le differenze centrali tra queste tecniche sono il tipo di sorgente luminosa utilizzata per l&#39;eccitazione e il modo in cui la luce di eccitazione viene modulata. Il LFFM pulsata (PLFFM) utilizza impulsi di luce laser, mentre onda continua LFFM (CLFFM) utilizza la luce laser continuo per l&#39;eccitazione. Infine, diodi emettitori di luce (LED) sono stati usati come sorgente luminosa terzi. Questa disposizione non coerenti è chiamata ad impulsi microscopia a fluorescenza a LED (PLEDFM).

AP e Ca 2+ transitori in endocardio ed epicardio Per confrontare i segnali attraverso la parete ventricolare, una fibra ottica è posizionata nella endocardio e l&#39;altro nel epicardio. Confrontando la morfologia di un AP registrata dall&#39;endocardio con una dal epicardio è il modo migliore per valutare la funzione transmurale. La parete ventricolare è altamente ete...

Nel cuore, eventi molecolari coordinare le funzioni elettriche e contrattili dell&#39;organo. Un insieme di campo fluorescenza tecniche di microscopia locali qui presentati consente la registrazione di variabili cellulari nei cuori intatti. Identificare i meccanismi che definiscono la funzione cardiaca è fondamentale per capire come funziona il cuore in situazioni patologiche.

Campo locale microscopia a fluorescenza: Imaging segnali cellulari nei cuori Intact

In the heart, molecular signaling studies are usually performed in isolated myocytes. However, many pathological situations such as ischemia and ...

L'obiettivo generale di questa tecnica di imaging mediante microscopia a fluorescenza a campo locale è utilizzare sonde molecolari per misurare i livelli intracellulari di calcio o i potenziali di membrana da regioni cardiache di difficile accesso a livello dell'intero cuore. Questo metodo può aiutarci a rispondere a domande fondamentali nel campo cardiovascolare relative all'arresto cardiaco e all'ischemia. Il principale vantaggio di questa tecnica è che le proprietà cardiache vengono misurate a partire da eventi cellulari all'interno dell'organo integro, dove le cellule rimangono accoppiate elettricamente, meccanicamente e metabolicamente.Per prima cosa, preparare l'apparato orizzontale di Langendorff. Caricare la soluzione di Tyrode appena preparata nelle siringhe da 60 millilitri e collegare tutti i tubi associati al sistema. Una volta riempiti, eliminare tutte le bolle d'aria.Quindi, equilibrare la soluzione caricata con gas ossigeno puro fornito da un diffusore d'aria in plastica sommerso. Successivamente, posizionare un filo chirurgico non assorbibile intorno a un ago. Questo fungerà da cannula per la retroperfusione del cuore quando collegato all'apparato.Successivamente, r

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Questo articolo descrive una tecnica ad alta risoluzione temporale e spaziale a otticamente movimento immagine del potenziale d'azione sulla superficie del Langendorff-cuore perfuso di ratto utilizzando un colorante potenziometrica (di-8-ANEPPS).

Mappatura ottica di Langendorff-perfusi Hearts Rat

La microscopia confocale a scansione viene applicato per l'imaging eventi mitocondriali singoli in cuore perfuso o muscoli scheletrici in animale vivo. Monitoraggio in tempo reale dei processi mitocondriali singoli, come vampate di superossido e di membrana potenziali fluttuazioni consente la valutazione della funzione mitocondriale in un contesto fisiologicamente rilevanti e durante le perturbazioni patologiche.

Imaging confocale delle singole mitocondriali superossido illumina di cuore intatto o In Vivo

Descriviamo un protocollo per visualizzare volumetricamente cellule marcate con proteine fluorescenti in profondità all'interno di cuori embrionali e postnatali intatti. Utilizzando metodi di pulizia dei tessuti in combinazione con la colorazione dell'intera montatura, è possibile visualizzare in modo chiaro e accurato singole cellule marcate con proteine fluorescenti all'interno di un cuore embrionale o postnatale.

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Qui descriviamo un approccio microscopico a foglio leggero per visualizzare l'infiltrato cardiovascolare CD45 + in un modello murino di miocardite fulminante asettica, che è indotto dal trattamento tossicolare intracellulare di tenebre di topi CD11c.DTR.

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Questo studio utilizza una tecnica di microscopia (LSFM) foglio di luce di fluorescenza-retro illuminazione combinata con compensazione ottica per studiare il cuore murino.

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Qui introduciamo un metodo per utilizzare un catetere ottico intra-ventrico nei cuori perfusi per eseguire la spettroscopia di assorbimento attraverso la parete cardiaca. I dati ottenuti forniscono informazioni solide sulla tensione dell'ossigeno tissutale, nonché sull'utilizzo del substrato e sul potenziale della membrana contemporaneamente con misure di prestazione cardiaca in questa onnipresente preparazione.

Catetere leggero intra-cardiaco per il monitoraggio del metabolismo cellulare utilizzando la spettroscopia transmurale di riambente di cuori mammiferi perfusi

Presentiamo la metodologia per l'isolamento dei miociti murini e come ottenere tracce di tensione o calcio contemporaneamente con tracce di accorciamento sarcomero utilizzando la fotometria a fluorescenza con misurazioni simultanee della geometria cellulare digitale.

Imaging ottico di miociti Murine Ventricolari isolati

Qui descriviamo l'acquisizione ottica e la caratterizzazione di potenziali d'azione da cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte utilizzando un sistema di fotometria modulare ad alta velocità.

Misurazione del potenziale d'azione ottico a singola cellula in cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane

Riportiamo un metodo per la ricostruzione mesoscopica dell'intero cuore del topo combinando nuovi progressi nella trasformazione e colorazione dei tessuti con lo sviluppo di un microscopio a foglio di luce a scansione assiale.

Imaging ottico mesoscopico dell'intero cuore del topo

Il protocollo utilizza la microscopia avanzata a foglio di luce insieme a metodi di pulizia dei tessuti adattati per studiare strutture cardiache complesse nei cuori dei roditori, con un grande potenziale per la comprensione della morfogenesi e del rimodellamento cardiaco.

Imaging a foglio luminoso per rivelare la struttura cardiaca nei cuori dei roditori

La ricostruzione tridimensionale (3D) del danno cardiaco nell'infarto miocardico acuto riperfuso (repAMI) consente una quantificazione e una co-localizzazione fedeli dei modelli associati che influenzano la malattia. In questo caso, viene fornito un approccio automatizzabile di imaging guidato da foglio luminoso per la misurazione contemporanea del danno cardiaco, dell'area a rischio e della risposta delle cellule immunitarie.

Analisi 3D simultanea del danno cardiaco e della risposta immunitaria nell'infarto miocardico acuto riperfuso mediante microscopia a fluorescenza a foglio di luce

Scopri la microscopia a fluorescenza a campo locale per misurare calcio intracellulare e potenziali di membrana in cuori intatti. Questa tecnica consente di studiare l'arresto cardiaco e l'ischemia preservando l'accoppiamento cellulare.

Campo locale microscopia a fluorescenza: Imaging segnali cellulari nei cuori Intact

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