Modelli acuti e cronici di iperglicemia in Zebrafish: un metodo per valutare l'impatto dell'iperglicemia sulla neurogenesi e la biodistribuzione delle molecole radiomarcate

L'obiettivo generale della seguente procedura è valutare il rimodellamento cerebrale in condizioni iperglicemiche e seguire le molecole radio-marcate nel pesce zebra. L'iperglicemia è caratterizzata da un'eccessiva concentrazione di glucosio nel sangue. L'iperglicemia cronica può essere dovuta a condizioni diabetiche e causa diverse disfunzioni vascolari, che a loro volta possono innescare complicanze cliniche, come infarto del miocardio, ictus o ulcere del piede diabetico.

Inoltre, l'iperglicemia acuta dovuta allo stress può favorire complicanze emorragiche nell'ictus ischemico. Il pesce zebra è un modello interessante per comprendere le malattie umane e il loro impatto sul sistema nervoso centrale. È particolarmente vero, dato che il cervello dei pesci adulti mostra un'intensa capacità neurogena e un'eccezionale capacità di meccanismi di riparazione cerebrale, rispetto ai mammiferi, quindi, il pesce zebra rappresenta un buon modello per studiare il rimodellamento cerebrale, a seguito di stress in condizioni acute e iperglicemiche.

Consente inoltre di studiare la biodistribuzione di molecole radiomarcate e potenziali agenti terapeutici. Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con le linee guida della Comunità francese ed europea per l'uso degli animali nella ricerca e approvati dal comitato etico locale per la sperimentazione animale. Cattura un pesce delicatamente con una rete da pesca.

Mettere il pesce in un piccolo volume di anestetico tricaina, diluito ad una concentrazione finale dello 0,02% nell'acqua. Aspetta che il pesce smetta di muoversi. Togliete il pesce, utilizzando una pipetta tagliata, e adagiatelo delicatamente su carta velina assorbente per eliminare al massimo l'acqua.

Pesare il pesce in modo da preparare una siringa di d-glucosio iniettabile, da 50 microlitri da 2,5 grammi per chilo di peso corporeo. Ad esempio, un pesce di 0,6 grammi riceverà 50 microlitri di una soluzione di PBS al 3% di glucosio d. Metti il pesce sul dorso e tienilo con una mano.

Con l'altra mano, inserire l'ago della siringa nella cavità intraperitoneale e iniettare lentamente la soluzione di d-glucosio PBS. Rimuovi l'ago e rimetti il pesce nell'acqua del pesce. Controllare il pesce fino a quando non si riprende completamente.

I loro livelli di glucosio nel sangue vengono solitamente misurati dopo 1 ora e mezza. Per imitare l'iperglicemia cronica, preparare una tanica da due litri di d-glucosio, alla concentrazione finale di 111 millimolari. Per questo, pesare 40 grammi di d-glucosio e metterlo in un serbatoio vuoto.

Riempi l'acquario con due litri di acqua per pesci e mettici dentro fino a sette pesci. Cambiare la soluzione di glucosio ogni due giorni, al fine di evitare la crescita di batteri o altri microrganismi. L'iperglicemia cronica si ottiene con un trattamento di 14 giorni con d-glucosio.

Cattura un pesce con una rete da pesca e mettilo sul ghiaccio. Coprite il pesce con ghiaccio per una rapida eutanasia. Prendete il pesce e asciugatelo, in modo da eliminare eventuali gocce d'acqua che potrebbero diluire i campioni di sangue.

Rimuovere un occhio con una pinza da dissezione e attendere che la cavità oculare si riempia di sangue. Metti una striscia reattiva sul glucometro e inserisci la striscia nella cavità oculare. Annotare il valore della concentrazione di glucosio nel sangue.

Per l'iperglicemia acuta, un'iniezione intraperitoneale di d-glucosio induce un aumento significativo dei livelli di glucosio nel sangue, come mostrato, 1 ora e mezza dopo l'iniezione. Per l'iperglicemia cronica, l'immersione del pesce in una soluzione di d-glucosio provoca un aumento significativo dei livelli di glucosio nel sangue, come dimostrato dopo 14 giorni di trattamento. Al termine della procedura, separare il corpo dalla testa con delle forbici da dissezione, e immergere la testa nel 4% di paraformaldeide, diluita in PBS per esperimenti di immunoistochimica.

Incubare per una notte a quattro gradi Celsius. In alternativa, il cervello può essere estratto direttamente e congelato per altri esperimenti, come l'estrazione dell'mRNA. Il giorno successivo, le testine fisse vengono risciacquate con PBS e mantenute con un ago al microscopio da dissezione.

L'occhio rimanente viene rimosso e la parte superiore del cranio viene aperta delicatamente con una pinza. Il cervello viene quindi estratto con cura e posto in 1x PBS. I cervelli fissi vengono disidratati gradualmente, in una serie di concentrazioni crescenti di etanolo, seguiti da due bagni di toluene della durata di 30 minuti.

I cervelli vengono quindi posti in una cassetta di inclusione e il coperchio viene accuratamente chiuso. Metti la cassetta nella paraffina fusa, a 58-60 gradi Celsius. Durante l'incorporazione del cervello con paraffina, accendi la pinza di inclusione riscaldante.

Immergere la cassetta in un bagno di paraffina pulito. Al termine dei bagni di paraffina, estrarre la cassetta. Versare un po' di paraffina liquida in uno stampo.

Apri la cassetta e posiziona il cervello all'interno della paraffina fusa nello stampo. Orienta il cervello con la pinza di inclusione riscaldante. Riempi lo stampo con paraffina fusa e lascialo indurire sulla parte di raffreddamento della macchina per l'inclusione.

Per motivi tecnici, il cervello deve essere posizionato secondo un asse antero-posteriore. Dopo aver sformato il blocco di paraffina, ritagliarlo e fissarlo su una cassetta con paraffina fusa, con il giusto orientamento per consentire il sezionamento trasversale. Inserire il blocco di paraffina nel braccio di un microtomo e tagliare sezioni di 50 micrometri, fino a raggiungere il livello del campione di cervello.

Quindi, tagliare il blocco di paraffina per ottenere un trapezio e regolare lo spessore di sezionamento a sette micrometri. Raccogli i nastri di paraffina con un pennello fine e mettili su un foglio di carta nera. Taglia i nastri di paraffina ogni tre o quattro sezioni.

Metti uno scivolo su una piastra riscaldante e coprilo con acqua distillata. Posizionare delicatamente le sezioni sull'acqua sullo scivolo e riscaldare fino a 40 gradi Celsius. Quando i nastri di paraffina sono sufficientemente sparsi, rimuovere l'acqua con un panno assorbente.

Le ultime gocce vengono rimosse meccanicamente, come mostrato. Lasciare asciugare il vetrino almeno due ore prima di eseguire la procedura di immunoistochimica descritta nel protocollo. Dopo l'immunoistochimica, i vetrini vengono analizzati sotto un'epifluorescenza, o un microscopio confocale, per studiare l'impatto dell'iperglicemia sulla proliferazione delle cellule cerebrali.

La quantificazione delle cellule cerebrali viene effettuata su almeno tre sezioni successive o su una regione di interesse. Qui, le cellule proliferative corrispondenti alle cellule PCNA positive appaiono in verde. Come si può notare, l'iperglicemia cronica induce una diminuzione del numero di cellule proliferative, etichettate in verde con l'anticorpo PCNA, nel telencefalo ventrale, nel telencefalo dorsale e nell'ipotalamo caudale, intorno al recesso laterale e posteriore.

In alternativa, per studiare gli effetti dell'iperglicemia sulla neurogenesi indotta da lesione, è possibile eseguire una ferita da taglio del telencefalo durante il trattamento iperglicemico cronico. Per questo, anestetizzare un pesce trattato sette giorni e metterlo sotto un microscopio da dissezione. Spingere una siringa da 30 gauge verticalmente attraverso il cranio, al centro dell'emisfero telencefalico destro.

Dopo questa procedura, il pesce deve essere rimesso nella sua vasca per il tempo richiesto. Qui, il pesce è stato lasciato sopravvivere sette giorni in acqua di d-glucosio, prima di essere sacrificato. La ferita da taglio del telencefalo sovraregola fortemente la proliferazione nell'emisfero danneggiato, sette giorni dopo la lesione.

I nostri dati mostrano che l'iperglicemia cronica induce una significativa diminuzione dei processi di guarigione cerebrale, diminuendo la proliferazione cellulare dopo la ferita da taglio del telencefalo. Il pesce zebra può essere utilizzato anche per studiare la biodistribuzione di molecole radiomarcate. Qui, abbiamo deciso di studiare il metabolismo del glucosio nell'organismo del pesce zebra.

Il pesce deve essere prima anestetizzato e posto su un fazzoletto imbevuto di anestetici. Il pesce viene poi posizionato dietro una finestra di protezione radio. Viene preparata la siringa contenente 50 microlitri di fluorodesossiglucosio.

Il pesce viene posizionato sul dorso e iniettato per via intraperitoneale con 50 microlitri di FDG a 20 megabecquerel. Il pesce viene quindi posizionato su un altro tessuto imbevuto di anestetici. Viene avvolto delicatamente e posizionato sul braccio di un imager per scansione PET.

Il braccio viene inserito nella scansione PET e viene eseguita la procedura di imaging. Qui si può notare che l'FDG non viene rilevato solo nel sito di iniezione, ma anche nella testa del pesce, in particolare nel cervello e lungo tutto il midollo spinale. In questo studio, forniamo due diversi metodi per stabilire l'iperglicemia acuta e cronica nel pesce zebra e dimostriamo che l'iperglicemia compromette la proliferazione delle cellule cerebrali in condizioni normali e indotte da lesioni.

In conclusione, il pesce zebra può essere utilizzato come modello rilevante per studiare gli effetti deleteri dell'iperglicemia nel sistema nervoso centrale. Consente inoltre di valutare la biodistribuzione di molecole radiomarcate mediante scansione PET.