Name: Tampone Metodo di campionamento per la rilevazione di Norovirus umana sulle superfici (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-06T10:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: Impara il metodo di campionamento con tampone macrofoam per rilevare il norovirus sulle superfici ambientali. Questo protocollo migliora l'indagine sulle epidemie e il monitoraggio della contaminazione.

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1. Tampone campionamento nel campo <ol><li> Indossare un paio di guanti puliti. </li><li> Misurare le dimensioni della zona di campionamento senza toccare la superficie con un nastro di misurazione o un righello. Cercare di stimare l&#39;area nel modo più accurato possibile e compilare un modulo di rapporto (Tabella supplementare 1). </li><li> Controllare il kit tampone per eventuali perdite e borse trasporto del campione etichetta e kit tamponi. </li><li> Spostare il tampone attraverso l&#39;area di campionamento come segue: un colpo in direzione orizzontale, un colpo in direzione verticale, ed un colpo in diagonale. Non tamponare una superficie maggiore di 700 cm 2. </li><li> Posizionare ogni tampone in una provetta e stringere il tappo saldamente. </li></ol> 2. il deposito e trasporto tamponi al Laboratorio <ol><li> Mantenere tamponi a 4 ° C per un massimo di 48 ore. Per una conservazione per periodi più lunghi, conservare i tamponi a -20 ° C (o -70 ° C). </li><li> Conservare le provette a 0-4 ° C (vale a dire. , Usare impacchi freddi) in un contenitore isolato durante il trasporto al laboratorio e nave entro 24-48 ore di raccolta. </li></ol> 3. Virus Concentrazione, virale RNA estrazione e purificazione NOTA: Tutte le fasi di centrifugazione utilizzare una centrifuga da tavolo a 5.000 xg per 5 minuti a temperatura ambiente, se non diversamente indicato. Prestare la massima attenzione quando si lavora con il tampone universale estrazione degli acidi nucleici (UNEX). Indossare occhiali o visiera. <ol><li> Etichettare una provetta 15 ml e una colonna RNA Midi per ogni campione. Includere un controllo di estrazione negativo in ogni esperimento. </li><li> Per preparare la soluzione di lisi per 10 tamponi, miscelare 25 ml di tampone UNEX con 25 mL di PBST (PBS pH 7,2 contenente 0,02% Tween-80). </li><li> Aggiungere 50 ml di sospensione colifago MS2 (10 6 PFU / ml) a 50 ml di soluzione di lisi. </li><li> Posizionare un tampone in una provetta da 15 ml e aggiungere 5 ml di soluzione di lisi. Mescolare e incubare per 10 min a temperatura ambiente. </li><li>Aggiungere 5 ml di etanolo al 100% in ogni provetta e vortex per 10 s. </li><li> Rimuovere con cautela il bastoncino del tubo da 15 ml (contiene tampone UNEX) premendo delicatamente contro la parete della provetta per rimuovere il liquido in eccesso e poi scarta il tampone. I restanti volumi dovrebbero essere tra 9-10 ml. </li></ol> 4. Midi Colonna virale Nucleic Acid Extraction <ol><li> Trasferire accuratamente 4,5 mL UNEX miscela / etanolo a partire dal punto 3.6 su una colonna midi, centrifugare e scartare il filtrato. </li><li> Caricare altri 4,5 ml della stessa miscela sulla stessa colonna, centrifuga, e scartare il filtrato. </li><li> Per il primo lavaggio, aggiungere 3,5 ml di etanolo al 70% sul Mezzogiorno della colonna, centrifugare e scartare il filtrato. </li><li> Per il secondo lavaggio, aggiungere altri 3,5 ml di etanolo al 70% nella colonna Midi. Centrifuga e scartare il filtrato. </li><li> Per la secca-spin, centrifugare le colonne Midi per eliminare ogni traccia di etanolo (che possono influenzare negativamente il recupero RNA virale). </li><li>Porre la colonna Midi a un nuovo 15 ml provetta da centrifuga. Aggiungere 250 microlitri tampone di eluizione sulla colonna Mezzogiorno; attendere 1 minuto prima centrifugazione per ottenere il massimo recupero di RNA virale. </li><li> Conservare l&#39;acido nucleico estratto a -70 ° C o procedere immediatamente al punto 5. </li></ol> 5. La concentrazione di acido nucleico virale Utilizzando RNA Clean and Concentrator Kit <ol><li> Aggiungere 500 ml di RNA Binding Buffer a 250 ml di RNA eluizione al punto 4.7 e vortex per 10 s. </li><li> Aggiungere 750 microlitri di 100% di etanolo e vortex per 10 s. </li><li> Etichettare una colonna di spin per ogni campione. Caricare il campione di 750 microlitri su una colonna di spin. </li><li> Centrifugare le colonne di rotazione a 12.000 xg per 1 min. Gettare il flow-through. </li><li> Caricare i restanti 750 ml su una colonna di spin e centrifugare a 12.000 xg per 1 min. </li><li> Per il prelavaggio, aggiungere 400 microlitri di RNA Prep buffer per ogni colonna di spin e centrifugare a 12.000 xg per 1 min. Gettare il flow-through. </li><li> Per il primo lavaggio, aggiungere 800 microlitri di RNA tampone di lavaggio in ogni colonna di spin e centrifugare a 12.000 xg per 1 min. Gettare il flow-through. </li><li> Per il secondo lavaggio, aggiungere 400 microlitri di RNA tampone di lavaggio a girare colonna e centrifugare a 12.000 xg per 1 min. Gettare il flow-through. </li><li> Per la secca-spin, centrifugare la colonna di selezione per eliminare ogni traccia di tampone di lavaggio a 12.000 xg per 2 minuti. </li><li> Trasferire accuratamente colonna di selezione per un 1,5 ml provetta pulita. </li><li> Aggiungere 25 microlitri tampone di eluizione su colonna di spin e incubare per 1 min a temperatura ambiente. Ciò aumenterà il recupero di RNA virale dalla colonna. </li><li> Raccogliere RNA mediante centrifugazione la colonna di spin a 10.000 xg per 1 min. </li><li> O procedere direttamente alla RT-qPCR (fase 6) o un negozio di RNA a -70 ° C. </li></ol> 6. Mutiplex RT-qPCR Rilevazione di genogruppo I e II Norovirus, e colifago MS 2 (tabella integrativa 2) <ol><li> le superfici di lavoro pulito, pipettES, e centrifughe con la soluzione di decontaminazione RNase per ridurre possibili contaminazioni. </li><li> Scongelare reagenti RT-qPCR sul ghiaccio. RNA disgelo sul ghiaccio (in una zona / camera separata). </li><li> Determinare il numero di reazioni e aggiungere almeno il 10% più di essi (ad esempio se sono necessari 10 reazioni, fare miscela master per 11). </li><li> Vortex singoli componenti Master Mix, ad eccezione di 25x RT-qPCR enzima, per 5 s. Mescolare accuratamente l&#39;enzima muovendo il tubo con un dito. </li><li> Brevemente componenti mix di master centrifuga per 5 s. </li><li> Preparare la miscela master per il tempo reale di rilevamento RT-PCR di GI norovirus e GII secondo le istruzioni del kit e aggiungere primer e sonde oligonucleotidiche specifiche per norovirus in 1,5 ml provetta (Tabella supplementare 3). </li><li> Mescolare il master mix pipettando 5-10 volte su e giù (vortex non è raccomandata). Aliquota 22 ml di master mix in ciascun pozzetto della real time PCR piastra da 96 pozzetti. </li><li> Vortex RNA campioneper 5 secondi, e raccogliere da brevi (5 s) centrifugazione. </li><li> Aggiungere 3 ml di RNA campione e GI e GII controlli positivi alla piastra RT-qPCR (seguire modello dalla tabella 2). Aggiungere 3 ml di nucleasi-Freewater nei pozzetti non-modello-controllo (NTC). </li><li> Sigillare la piastra in tempo reale con pellicola adesiva ottica. </li><li> centrifugare delicatamente la piastra in tempo reale a 1.300 xg per 1 min per rimuovere eventuali bolle d&#39;aria o gocce di liquido che possono essere presenti nei pozzetti. </li><li> Impostare un real-time PCR e strumento di set-up le seguenti condizioni termocicli: 1) step RT per 10 min. a 45 ° C (2) attivazione di Taq polimerasi, 10 min. a 95 ° C e (3) 45 cicli di 15 s a 95 ° C e 60 s a 60 ° C. </li></ol> 7. La quantificazione di Norovirus in tampone campioni <ol><li> Verificare i risultati dei controlli positivi e negativi per convalidare i risultati RT-qPCR (Tabella supplementare 3). </li><li> Determinare se ogni curva standard incontra ilvalori accettabili riportati nella tabella integrativa 2 e calcolare la deviazione standard generale per la curva standard utilizzando Equazione 1. (Equazione 1)% di efficienza = 100 x 10 (media Ct Values-Intercept) / Slope. </li><li> Se il software termociclatore PCR non calcola la pendenza per ogni curva standard, determinare pendenza e R 2 valori di regressione utilizzando un software statistico (per esempio Excel, SPSS o SAS). Inoltre, calcolare l&#39;efficienza% per curve standard seguenti equazione I </li><li> Registrare il numero di RNA copie calcolato dal software termociclatore per tutti i campioni di prova basati su curve standard che soddisfano i criteri specificati nella tabella supplementare 4. Eseguire nuovamente tutti i campioni con le curve standard t cappello non soddisfano i criteri o hanno controlli falsi-positivi. Controllare i valori Ct di colifago MS2, che è stato aggiunto come controllo interno per monitorare l&#39;inibizione della PCR. </li><li> Determinare il numero totale di RNA copie per campione dallo moltiplicando il numero RNA copia calcolata al punto 7.2 dal rapporto tra il volume (25 a 50 mL) del totale eluente RNA a quella del RNA (da 3 a 5 mL) usato per la reazione RT-qPCR. In alternativa, calcolare la densità RNA dividendo il numero totale RNA copia per la superficie dell&#39;oggetto (cm 2) analizzato. </li></ol> 8. genotipizzazione di campioni in tempo reale RT-PCR positiva per Hemi annidata convenzionale PCR Amplification <ol><li> Preparare il primo turno di master mix per ogni set di primer del saggio RT-PCR (Tabelle integrativa 2 e 5). </li><li> Aggiungere 5 ml di norovirus RNA positivo per 20 ml di master mix. </li><li> Eseguire il RT-PCR con le seguenti condizioni: (1) RT passo per 30 minuti a 42 ° C (2) attivazione di Taq polimerasi, 15 min a 95 ° C, e (3) 40 cicli di 30 s a 95 ° C , 30 s a 50 ° C e 60 secondi a 72 ° C. Dopo 40 cicli, incubare per altri 10 min a 72 ° C. </li><li>Preparare il secondo turno di mix mater per ogni set di primer del saggio RT-PCR (Tabelle integrativa 2 e 5). </li><li> Aggiungere 23 ml master mix e aggiungere 2 ml di primo turno di RT-PCR prodotti (dal primo turno) ad ogni provetta (idealmente il prodotto primo turno deve essere diluito 1/10 in acqua RNase-free). </li><li> Ripetere il punto 8.3. </li><li> Preparare un gel di agarosio al 2% in EDTA 100 ml 1x Tris-acetato (40 mM Tris, 20 mM di acido acetico, e 1 mM EDTA, pH 8,3). Dopo dissoluzione agarosio riscaldando la miscela in un forno a microonde, aggiungere 10 ml di acido macchia nucleico per 100 ml di gel preparata dopo raffreddamento la miscela a 60-70 ° C, versare il gel e inserire i pettini. Lasciate che il gel accontentarsi di almeno 30 minuti. </li><li> Mescolare 15 ml di ciascun prodotto RT-PCR con 3 ml di colorante di caricamento 6x. Carico 15 microlitri di ciascun campione e elettroforesi il gel di agarosio a 100 V per 1 ora. </li><li> frammenti bersaglio Excise RT-PCR di dimensioni adeguate (330 bp per GI e 341 bp per GII) dal geld purificare RNA utilizzando un kit di estrazione del gel commerciale. Il prodotto di PCR purificato può essere utilizzato per Sanger sequenziamento. </li></ol>

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Gli autori non hanno interessi in conflitto. I risultati e le conclusioni di questo rapporto sono quelli degli autori e non rappresentano necessariamente la posizione ufficiale dei Centers for Disease Control and Prevention.

Norovirus hanno una dose infettiva umana del 50% tra i 18 ei 10 3 20 particelle virali. Pertanto, anche la contaminazione di basso livello di superfici può costituire un rischio per la salute pubblica. Diversi aspetti del protocollo di campionamento tampone sono stati valutati tra cui: 1) diversi materiali tampone, 2) condizioni di conservazione tamponi durante il trasporto, 3) la concentrazione di RNA virale, e 4) colifago MS2 il controllo di estrazione interna. <p class="jove_con...

<html> Norovirus umani sono una delle principali cause di un&#39;epidemia e sporadici gastroenterite acuta in tutto il mondo 1, 2, 3. Il virus è estremamente contagiosa e la trasmissione avviene attraverso persona diretta all&#39;interazione persona o indirettamente attraverso il contatto con alimenti contaminati, acqua o superfici ambientali. Norovirus può essere versato per lunghi periodi e prolungato la sopravvivenza del virus sulle superfici ambientali è stata documentata 1, 2, 3. Durante spargimento di picco, miliardi di particelle virali vengono rilasciati per grammo di feci e vomito contiene anche un numero sufficiente di particelle virali di causare infezioni 4, 5, 6, 7, 8,ef &quot;&gt; 9, 10. Inoltre, il trasferimento del virus tra le superfici inanimate e la pelle umana può facilmente verificarsi 2, 11, 12. Quindi, il monitoraggio della contaminazione ambientale può aiutare a indagini sui focolai e nel valutare l&#39;efficacia di clean-up e procedure di disinfezione. Diversi protocolli di campionamento ambientali sono stati descritti per la rilevazione di rotavirus, colifago MS2, calicivirus felino (FCV), e batteriofago P22 13, 14, 15, 16. Tuttavia, le condizioni di validazione descritti in questi studi, tra cui essiccazione veloce (&lt;1 ora) e piccole superfici (25 x 100 cm 2), potrebbero non rappresentare adeguatamente le impostazioni del campo. Inoltre, il basso livello di contaminazione di enviro previstosuperfici nmental richiedono protocolli che sono in grado di rilevare pochissime particelle virali. Abbiamo sviluppato un metodo di campionamento di superficie macrofoam-based per il rilevamento e la tipizzazione di norovirus. Questo metodo è stato validato nel corso di diversi focolai di norovirus. Il protocollo comprende 1) come raccogliere campioni di tampone da superfici ambientali (2) come mantenere meglio l&#39;integrità dei campioni durante la raccolta e il trasporto al laboratorio, e 3) prove di laboratorio e la tipizzazione di norovirus.

<table><tbody><tr><td>Nome generico per kit</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Macrofoam swab</td><td>Kit tampone EnviroMax preumidificato&nbsp;</td><td>Puritano</td><td>2588060PFUW</td></tr><tr><td>RNA Tampone di lisi&nbsp; </td><td>CDC Tampone UNEX</td><td>Microbiologics</td><td>Cat No MR0501</td></tr><tr><td>Colonna di spin per l'estrazione dell'RNA</td><td>Colonna Midi</td><td>Omega Biotek</td><td>Cat No R6664-02</td></tr><tr><td>Colonna di centrifuga per la purificazione dell'RNAKit di</td> <td>pulizia e concentratore dell'RNA Zymol&nbsp;</td><td>Zymo Research</td><td>Cat No R1016</td></tr><tr><td>Kit RT-PCR in tempo reale</td><td>AgKit AgPath Kit RT-PCR in un solo passaggio</td><td>Life Technologies</td><td>Cat No 4387391</td></tr><tr><td>Kit RT-PCR convenzionale</td><td>Qiagen kit RT-PCR in un solo passaggio</td> Kit <td>Qiagen</td><td>Cat No 210212</td></tr><tr><td>Kit di estrazione del gel</td><td>Qiagen QIAkit di estrazione rapida del gel</td> Kit <td>Qiagen</td><td>Cat No 28704 o 28706</td></tr><tr><td></td><td>Coliphage MS2</td><td>ATCC</td><td>Cat No 15597-B1</td></tr><tr><td></td><td>Trascrizioni</td><td></td><td></td>del run-off dell'RNA</tr><tr><td>Piattaforma PCR in tempo reale</td><td>Applied Biosystems</td><td>Modello ABI 7500</td>Piastra di reazione ottica a 96 pozzetti Thermo Scientific Cat No 4316813<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td><a href="http://www.thermofisher.com/order/catalog/en/US/adirect/%20https:/www.thermofisher.com/order/catalog/en/US/adirect/lt?cmd=catProductDetail&amp; showAddButton=vero& productID=4306311&&_bcs_=H4sIAAAAAAAAAAI1RTWvDMAz9Nb4srDg2yXpNW3rZVyHbuRhHSQx2HWwnJf9%2BUkO6scMYGEmWnqX3%0A5Mec8e0p%2BGbUKWZMlFkNYTIa4h%2F5PqWByYqJI57r9bpJPQTnWxPRb7R3mB4jGrig6b0DdD40WOyT%0As9iBCUmHb1MYge78iYi06ZznPEddPEd10exacF6LkD5h%2BNTr4yg1II0DH5C6rmh6imSA7GuuInsIq5TUy%0AjD6Yf%2FKU1Zav3NBrlZT13cr8s0ajGhNAJ4xsYvKoXcPkAYEHEwer5jrNFuWVdF1ieajNpbPwAhPY%0AvUrQ%2BTAjAt88w4zlm8Ly%2FYRha2yiyeUSUJM35ajHt%2BZiUS0KuWNityrHkLSjuyHUDbkgfuxgbfwx% 0AD9Q0vydo9rrs4te675%2FTKhvpd74AhB0C9yUCAAA%3D& returnURL=http%3A%2F%2Fwww.thermofisher.com%3A80%2Forder%2Fcatalog%2Fen%2FUS%2Fadirect%2Flt%3Fcmd%3DcatDisplayStyle%26catKey%3D101%26filterType%3D1%26OP%3Dfilter%26filter%3Dft_1101%252Ff_2005260*">MicroAmp Pellicola adesiva trasparente&nbsp; </a></td><td>Thermo Scientific</td><td>Cat No 4306311</td></tr></tbody></table>

tampone metodo di campionamento per la rilevazione di norovirus umana sulle superfici

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

norovirus umani sono una delle principali cause di un&#39;epidemia di gastroenterite e sporadici in tutto il mondo. Poiché la maggior parte delle infezioni sono o diffondono direttamente per via da persona a persona o indirettamente tramite superfici ambientali o cibo, fomiti contaminati e superfici inanimate sono veicoli importanti per la diffusione del virus durante focolai di norovirus. Abbiamo sviluppato e valutato un protocollo utilizzando tamponi macrofoam per il rilevamento e la tipizzazione dei norovirus umani provenienti da superfici dure. Rispetto ai tamponi in fibra con punta o salviette antistatiche, tamponi macrofoam consentire il recupero virus (range 1,2-33,6%) dalle superfici dei sedili wc fino a 700 cm 2. Il protocollo include i passaggi per l&#39;estrazione del virus dalle tamponi e ulteriore concentrazione dell&#39;RNA virale utilizzando colonne di rotazione. In totale, 127 (58,5%) dei 217 campioni di tamponi che erano stati raccolti da superfici in navi da crociera e le strutture di assistenza a lungo termine in cui norovirus gastroenterite era statosegnalati risultati positivi per GII norovirus mediante RT-qPCR. Di questi 29 (22,8%) potrebbe essere genotipizzati con successo. In conclusione, l&#39;individuazione di norovirus sulle superfici ambientali che utilizzano il protocollo che abbiamo sviluppato può aiutare a determinare il livello di contaminazione ambientale durante le epidemie, così come il rilevamento del virus quando i campioni clinici non sono disponibili; può anche facilitare il monitoraggio dell&#39;efficacia delle strategie di bonifica.

La figura 1 presenta un diagramma di flusso del protocollo di campionamento tampone. Questo protocollo è costituito da quattro fasi principali; 1) la raccolta dei campioni, 2) conservazione e il trasporto, 3) virale purificazione dell&#39;RNA e concentrazione e 4) analisi RT-qPCR e genotipizzazione. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55205/55205fig1.jpg" /> Figura 1: Diagramma di flusso de...

È stata sviluppata e valutata una metodologia di campionamento basata su macroschiuma per il rilevamento e la quantificazione del norovirus su superfici dure ambientali.

Tampone Metodo di campionamento per la rilevazione di Norovirus umana sulle superfici

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

L'obiettivo generale del nostro metodo di campionamento superficiale basato su macrospugne è identificare l'eziologia dell'epidemia, valutare complessivamente la dinamica della contaminazione ambientale del virus e verificare l'efficacia delle strategie di bonifica per il norovirus. Questo protocollo descrive dettagliatamente come raccogliere un campione mediante tampone da superfici ambientali, come questi tamponi devono essere conservati e trasportati, e quale protocollo di laboratorio è raccomandato per la rilevazione e il tipaggio del norovirus a partire da tali tamponi. I principali miglioramenti apportati a questo protocollo di campionamento ambientale per i norovirus consistono nella determinazione del tipo ottimale di materiale del tampone, nella quantificazione della quantità di norovirus recuperabile da superfici dure e nella dimostrazione che il protocollo può essere utilizzato efficacemente per campionare aree superficiali più estese.In questo video, due dei miei scienziati del personale, Geun Woo Park e Preeti Chhabra, illustreranno il protocollo di prelievo con tampone per la rilevazione e il tipaggio dei norovirus. Per iniziare il prelievo, recarsi nell'area di campionamento ed eseguire un passaggio orizzontale, un passaggio verticale e un passaggio diagonale con un unico movimento del tampone. Inserire ciascun tampone in un tubo separato e avvitare bene il cappuccio.Prelevare campioni da superfici in acciaio inossidabile, da una superficie di tavoletta igienica e da una maniglia. Successivamente, etichettare un tubo da 15 millilitri e una colonna RNA Midi per ogni campione. Includere un controllo negativo di estrazione in ogni esperimento.Preparare un flacone vuoto per raccogliere lo scarto del buffer di estrazione universale di acidi nucleici, o UNEX. Per preparare la soluzione di lisi per 10 tamponi, mescolare 25 millilitri di buffer UNEX con 25 millilitri di PBST. Aggiungere 50 microlitri di sospensione di colifago MS2 a 50 millilitri di soluzione di lisi.Inserire un tampone in un tubo da 15 millilitri e aggiungere cinque millilitri di soluzione di lisi. Mescolare il tampone nella soluzione e incubare la miscela a temperatura ambiente. Aggiungere cinque millilitri di etanolo al 100% in ogni tubo e vortexare i tubi per 10 secondi.Rimuovere con attenzione il tampone dal tubo da 15 millilitri, premendolo delicatamente contro la parete del tubo per eliminare il liquido in eccesso, quindi scartare il tampone. Trasferire con attenzione 4,5 millilitri della miscela di etanolo UNEX su una colonna Midi e centrifugare la colonna. Al termine della centrifugazione, scartare il filtrato.Caricare altri 4,5 millilitri della stessa miscela sulla stessa colonna, quindi centrifugare la colonna. Scartare il filtrato. Per il primo lavaggio, aggiungere 3,5 millilitri di etanolo al 70% sulla colonna Midi e centrifugare la colonna.Dopo la centrifugazione, eliminare il filtrato. Per il secondo lavaggio, aggiungere altri 3,5 millilitri di etanolo al 70% sulla colonna Midi. Centrifugare ed eliminare il filtrato.Per la centrifugazione a secco, centrifugare le colonne Midi per rimuovere ogni traccia di etanolo. Posizionare la colonna Midi in un nuovo tubo da centrifuga da 15 millilitri. Aggiungere 250 microlitri di tampone di eluizione sulla colonna Midi e attendere un minuto prima di centrifugare per ottenere il recupero massimo di RNA virale.Aggiungere 500 microlitri di tampone di legame per RNA a 250 microlitri di RNA e vortexare la miscela per 10 secondi. Aggiungere 750 microlitri di etanolo al 100% e vortexare per 10 secondi. Successivamente, etichettare una colonna da centrifuga per ogni campione.Caricare il campione da 750 microlitri su una colonna da centrifuga e centrifugare le colonne. Scartare il flusso passante. Caricare i rimanenti 750 microlitri su una colonna da centrifuga e centrifugare le colonne.Per il prelavaggio, aggiungere 400 microlitri di tampone per la preparazione dell'RNA in ciascuna colonna spin e centrifugare la colonna. Scartare il flusso passante. Per il primo lavaggio, aggiungere 800 microlitri di tampone di lavaggio per l'RNA in ciascuna colonna spin e centrifugare le colonne.Scartare il flusso in eccesso. Per il secondo lavaggio, aggiungere 400 microlitri di tampone di lavaggio per RNA in ciascuna colonna da centrifuga e centrifugare. Scartare il flusso in eccesso.Per la centrifugazione a secco, centrifugare la colonna di filtrazione per rimuovere ogni traccia di tampone di lavaggio. Trasferire con attenzione la colonna di filtrazione in una provetta microcentrifuga pulita da 1,5 millilitri. Aggiungere 25 microlitri di tampone di eluizione sulla colonna di filtrazione e incubare la colonna per un minuto a temperatura ambiente per aumentare il recupero di RNA virale dalla colonna.Raccogliere l'RNA centrifugando la colonna di filtrazione a 10.000 × g per un minuto. Procedere direttamente alla PCR in tempo reale. Prima di continuare con la RTPCR multiplex in tempo reale, pulire le superfici di lavoro, le pipette e le centrifughe con una soluzione decontaminante per RNasi.Scongelare i reagenti per PCR in tempo reale sul ghiaccio. Scongelare l'RNA del campione sul ghiaccio in un'area separata. Determinare il numero di reazioni e preparare almeno il 10% in più di reagente per la miscela master per compensare le perdite durante la pipettaggio.Successivamente, vortexare i singoli componenti del mix master per cinque secondi. Mescolare accuratamente l'enzima agitando delicatamente il tubo. Centrifugare brevemente i componenti del mix master per cinque secondi.Quindi, preparare la miscela master per la rilevazione del norovirus G1 e G2 mediante RTPCR seguendo le istruzioni del kit e aggiungere primer e sonde oligonucleotidici specifici per il norovirus in una provetta microcentrifuga da 1,5 millilitri. Successivamente, mescolare la miscela master aspirando e dispensando sette volte su e giù con la pipetta. Aliquotare 22 microlitri della miscela master in ciascun pozzetto della piastra per PCR in tempo reale.Vortexare il campione di RNA per cinque secondi e raccogliere il contenuto mediante centrifugazione di cinque secondi. Aggiungere tre microlitri di controlli positivi di RNA del campione e diluizioni seriali 10 volte dei trascritti di RNA G1 e G2 alla piastra di PCR in tempo reale. Aggiungere tre microlitri di acqua priva di nucleasi alle pozzette del controllo senza modello, o NTC.Sigillare la piastra con un film adesivo ottico. Centrifugare con attenzione la piastra a 1.300 ×g per un minuto per rimuovere eventuali bolle d'aria o gocce di liquido presenti nei pozzetti. Successivamente, impostare la PCR in tempo reale ed inserire le condizioni di termociclaggio.Determinare le curve standard sia per i trascritti G1 che per quelli G2. Convertire i valori di Ct in copie di RNA utilizzando la rispettiva curva standard. Calcolare il rapporto tra il volume dell'eluito totale di RNA e la quantità totale di RNA utilizzata per il saggio in tempo reale per determinare il numero totale di copie di RNA per campione.Per genotipizzare i campioni positivi al norovirus mediante RTPCR convenzionale emi-nested, preparare innanzitutto un mix master per il primo giro di RTPCR e distribuire aliquote da 20 microlitri in provette PCR pre-etichettate. Aggiungere cinque microlitri di RNA a ciascuna provetta. Al termine del primo giro di RTPCR, preparare un mix master per il secondo giro emi-nested di PCR distribuendo aliquote da 23 microlitri in nuove provette.Infine, aggiungere due microlitri del prodotto PCR del primo round a ciascun tubo. Il metodo di campionamento con tamponi a base di macrofoam è stato testato sul campo su campioni raccolti da una nave da crociera in cui erano stati segnalati casi sospetti di gastroenterite da norovirus. Quattro dei 17 campioni di tampone positivi al norovirus sono stati sottoposti a genotipizzazione, e tutti i campioni presentavano sequenze G2 identiche.La determinazione del carico virale ha permesso la valutazione di superfici fortemente contaminate, come i sedili dei water. La relazione dei valori di soglia del ciclo, o valori Ct, è stata determinata mediante RTPCR in tempo reale in relazione alla capacità di sequenziare questi campioni. In totale, 127 su 217 campioni di tampone sono risultati positivi per il norovirus G2.Campioni da tampone con valori di Ct compresi tra 24 e 27 e tra 28 e 31 sono stati genotipizzati con tassi rispettivamente del 100% e del 72,2%. Al contrario, solo il 22% e l'1,6% dei campioni da tampone con valori di Ct compresi tra 32 e 36 e tra 37 e 40 sono stati sequenziati con successo. Come abbiamo dimostrato, questo protocollo consente di determinare il livello di contaminazione ambientale durante focolai di norovirus, di individuare la possibile causa di un focolaio quando non sono disponibili campioni clinici e, inoltre, di valutare l'efficacia delle pratiche di pulizia.Per ottenere il risultato più accurato, è molto importante seguire con precisione questo protocollo al fine di minimizzare la variabilità dei risultati tra i diversi campioni.

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Immunologia e Infezioni

Un One-Step RT-PCR per il rilevamento e l'identificazione genogruppo di isolati Norovirus da feci bambini, che utilizza primer e sonde TaqMan specifiche al telaio di lettura aperta 1 (ORF1)-ORF2 regione di giunzione, la regione più conservata del genoma Norovirus è descritto. Un non-commerciale e conveniente metodo di estrazione dell'RNA è dettagliato.

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Un test per quantificare il legame delle VLP del Norovirus umano ai batteri intestinali

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Qui presentiamo una procedura per misurare i virus coltivabili totali utilizzando la linea cellulare di rene Buffalo Green Monkey. La procedura fornisce uno strumento standardizzato per misurare la presenza di virus infettivi nelle acque ambientali e potabili.

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Qui presentiamo una procedura per quantificare enterovirus e norovirus nelle acque ambientali e potabili utilizzando la PCR quantitativa a trascrizione inversa. Il recupero medio del virus dalle acque sotterranee con questa procedura standardizzata del metodo EPA 1615 è stato del 20% per il poliovirus e del 30% per il norovirus murino.

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Tampone Metodo di campionamento per la rilevazione di Norovirus umana sulle superfici

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