Name: Sviluppo di un sistema di consegna economico DNA da Acufection e la sua applicazione alla ricerca della pelle (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Scopri un metodo economico per esprimere DNA plasmidico nella pelle del topo mediante acufection. Questa tecnica consente di studiare il ruolo di geni immunitari nell'infiammazione cutanea e sviluppare nuove terapie per patologie come la psoriasi.

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla concessione da parte del Ministero della Scienza e della Tecnologia (MOST 103-2633-B-002-002, 104-2320-B-002-048). Ringraziamo Drs. Betty Wu-Hsieh e Chien-Kuo Lee al NTU, Leigh Zerboni presso la Stanford University e il dottor Peter Hoffmann presso l&#39;Università delle Hawaii per la lettura del manoscritto, Yun Chien a NTU per l&#39;assistenza tecnica, e il dottor Wen Wei-Chi in agricoltura biotecnologie Centro di ricerca presso Academia Sinica per un parere tecnico.

topi femmina a 8 - 12 settimane di età sono stati utilizzati per questo studio. C57 / BL6 wild-type (WT) e IL-15 carente (IL15 - / -) topi sono stati acquistati da National Laboratory Animal Centre (NLAC), Taiwan e Taconic Farm, rispettivamente. IL-15-deficienti (IL15 - / -) e IL-15-dominante (IL15 +/- e IL15 + / +) hanno mostrato un rapporto 1: 3 nella seconda generazione dalla croce di eterozigoti IL15 +/-. Il genotipo di IL-15 - / - mice è stata confermata da analisi PCR. I topi sono stati mantenuti nella struttura specifico patogeno libero (SPF) presso il Laboratorio Animal Center (LAC), National Taiwan University (NTU) College of Medicine. Tutte le procedure di animali, tra cui i materiali ei metodi di anestesia sono stati eseguiti in conformità con il protocollo degli animali approvato dalla National Taiwan University College of Medicine e al Collegio della sanità pubblica Istituzionale Animal Care and Use Committee (IACUC) (Dichiarazione giurata di approvazione del protocollo Animal 20.130.225). &lt;p class = &quot;jove_title&quot;&gt; 1. Preparazione di aghi agopuntura NOTA: Aghi di agopuntura sono dispositivi medici composti da un&#39;impugnatura ed un&#39;estremità dell&#39;ago (Figura 1A). I diametri dell&#39;ago agopuntura variava da 0,2 mm (36 G) a 0,35 mm (28 G). Selezioniamo il punto più fine dell&#39;ago per evitare danni potenziali delle cellule eccessivo durante pungendo la pelle. Ci sono 4 differenti lunghezze dell&#39;ago 0,2 mm di cui 13 mm (0,5 pollici), 25 mm (1,0 in), 40 mm (1,5 pollici) e 50 mm (2,0 pollici) di lunghezza. Un fascio di 10 aghi con spezzone 13 mm, purché la presa migliore confortevole durante oscillazione dell&#39;ago su C57BL / 6 mouse pelle. I parametri possono essere modificati se il metodo viene applicato sulla pelle di animali più grandi o eseguito da ricercatori con mani più grandi. <ol><li> Rimuovere aghi dalla confezione sterile, apirogena. Mettere gli aghi su un telino sterile. </li><li> Usare nastro adesivo per legare l&#39;etichettatura 10 aghi insieme ina fascio (Figura 1B). NOTA: I 10 aghi sono geometricamente disposti a formare una forma cilindrica. Per comodità, utilizzare un pezzo di parafilm per stabilizzare la disposizione prima di applicare il nastro adesivo. Assicurarsi che tutti i punti di ago sono sullo stesso piano. Utilizzando un fascio invece di un singolo ago facilita infusione DNA massima aumentando l&#39;area di contatto tra gli aghi e la cute. </li></ol> 2. Preparazione di un Importo di grandi dimensioni e privo di endotossine plasmidi DNA <ol><li> Trasformare cellule batteriche competenti chimicamente con il DNA plasmidico. </li><li> Selezionare e inoculare una singola colonia batterica in 3 mL di terreno LB contenenti antibiotici e incubare a 37 ° C in un agitatore notte. </li><li> Scalare la cultura diluendo la coltura batterica a 1: 100 a 250 mL di terreno LB con antibiotici e agitazione durante la notte a 37 ° C. </li><li> Preparare una grande quantità di DNA utilizzando un alta quality, endotossine kit di preparazione gratuito plasmide seguendo le istruzioni del produttore. NOTA: protocollo Acufection richiede un&#39;elevata purezza e una grande quantità di DNA plasmidico. Uso di alta qualità, è consigliabile endotossine e DNA plasmidico purificato colonna. </li><li> Eluire il DNA in acqua sterile. DNA Conservare in piccole aliquote a -20 ° C fino al momento acufection. NOTA: Evitare ripetuti di congelamento e scongelamento del DNA al fine di garantire plasmide di espressione del DNA coerente. </li><li> Diluire DNA plasmidico a 1 mg / ml in PBS sterile per acufection. </li></ol> 3. Procedura per Acufection NOTA: La quantità ottimale di DNA e l&#39;area della superficie della pelle bersaglio può variare per diversi geni e devono essere ulteriormente ottimizzata. La forza spillatura e il numero di volte per disperdere lo strato corneo della pelle può anche variare a seconda dello spessore della pelle. Queste condizioni devono essere determinate con cura dopo aver valutato il livello di espressione del gene transcri acufectedpts da qRT-PCR. <ol><li> Pesare i topi e amministrare tribromoethanol (400 ug per peso corporeo gm) mediante iniezione peritoneale. NOTA: 2,2,2-tribromoethanol è un agente anestetico iniettabile che era comunemente usata nei topi. Le soluzioni sono realizzate sciogliendo un grado non farmaceutico 2,2,2-tribromoethanol (2,5 g) in acqua distillata (200 mL) contenente 2,5% di 2-metil-2-butanolo. </li><li> Utilizzare veterinario oftalmologica pomata sugli occhi per prevenire la secchezza sotto anestesia. NOTA: effetto anestetico sarà indotta a 1 - 2 min. Controllare il pinch riflesso punta a garantire sufficiente profondità dell&#39;anestesia prima del funzionamento. </li><li> Radere la pelle dorsale fianco e applicare una crema depilatoria per sciogliere proteine ​​di cheratina nel fusto del capello. NOTA: L&#39;uso della crema depilatoria per eliminare i peli faciliterà l&#39;infusione di DNA nella pelle. </li><li> Utilizzare batuffoli di cotone imbevuto di acqua per rimuovere la crema depilatoria. NOTA: La crema depilatoria è solubile in acqua. La rimozione completa del wil cremal prevenire una superficie unta e garantire un risultato migliore puntura. </li><li> Usare un tampone di cotone sterile imbevuta di etanolo al 70% per disinfettare la superficie della pelle. </li><li> Mark l&#39;area di destinazione (1 cm x 1 cm) sulla pelle depilata con uno stampino predosato. NOTA: In occasione del sito di destinazione vi aiuterà ad applicare il fascio ago su e giù all&#39;interno di un&#39;area definita. Questo è importante per garantire la consegna della stessa quantità di DNA ad una superficie specifica per minimizzare la variazione esperimento a esperimento. </li><li> Una goccia 10 ml di DNA plasmidico (10 ug) sulla pelle sensibile. NOTA: La quantità di DNA per acufection varia con differenti geni e il tipo di vettore di espressione. La quantità di DNA usato deve essere attentamente titolato prima di effettuare l&#39;esperimento di interesse. Il 10 microlitri è una piccola goccia di liquido e si siede bene sulla pelle rasata e depilate senza rotolare giù mentre puntura. Includere un gruppo di controllo di topi trattati con 10 microlitri vuoto vettore di DNA da confrontare con un topicufected con il gene di studio. </li><li> Tenere il fascio di agopuntura (Figura 1B) e forare la superficie contrassegnata con un movimento su e giù per 100 volte o finché l&#39;umidità dal DNA in PBS sulla pelle scompare. NOTA: può verificarsi un certo rossore della superficie della pelle. Evita di fare tagli profondi che sanguinano. Il numero di up-and-down pungendo movimenti sulla superficie della pelle è operativamente determinata quando l&#39;umidità dal DNA in PBS (10 mL) scompare sulla pelle. Abbiamo deciso 100 volte in 30 s, perché ha dato i risultati più consistenti da geni acufection-consegnato. Se del caso, gli aghi possono essere riutilizzati per 6 punture pelle bersaglio (1 cm x 1 cm ciascuno). Risciacquare gli aghi in etanolo al 70% e PBS tra acufection. Cambiare per nuovi aghi quando sono spenti o per diversa DNA plasmidico per evitare la contaminazione incrociata. </li><li> Mettere i topi acufected su una piastra elettrica per mantenere la temperatura corporea fino a quando sveglio. </li><li> Rientro topi per loro gabbia quando hannoripreso conoscenza sufficiente. Nota: Tenere topi acufected in gabbia separata (meno di 5 animali per gabbia) dalla gabbia di topi non-acufected. </li><li> Mettere bottiglia d&#39;acqua in luogo e tornare la gabbia alla IVC (gabbie a ventilazione individuale) rack. </li></ol> Cura 4. post-operatorio <ol><li> Per le prime 48 ore dopo la procedura, monitorare attentamente i topi per qualsiasi disagio compresi i cambiamenti comportamentali (irrequietezza, agitazione o disturbo alimentare) o aspetto anomalo (pelo ruvido o la postura ricurva). </li></ol> 5. Imiquimod (IMQ) trattamento della pelle IL-15ΔE7-acufected NOTA: l&#39;espressione trascrizionale e proteine ​​produzione di gene acufected sono rilevabili il giorno 3. I topi acufected con il plasmide di interesse può essere trattata con diversi tipi di stimolanti 3 giorni dopo la trasfezione. Illustriamo qui trattando la pelle del mouse IL-15ΔE7-acufected con crema di IMQ. IMQ è un f imidazoquinolin ammina approvatoo trattare genitali esterni e verruche perinatali 13. Il trattamento topico IMQ è mostrato di indurre disturbi della pelle psoriasi-come l&#39;essere umano nei topi con la manifestazione di pelle squamosa, la proliferazione epidermica e l&#39;infiltrazione 12, 14, 15 dei neutrofili cutanea. NOTA: Il vettore plasmidico conteneva intera lunghezza topo IL-15 cDNA, sotto la regolazione del fattore di allungamento-1 α (PEF), fiancheggiata da un peptide segnale IL-2 e un tag FLAG al C-terminale (pEF-IL- 15, 5859 paia di basi), che è stato costruito come descritto da Bamford et al. 16. Il plasmide viene utilizzato come modello IL-15 per eliminare i primi 16 ammino acidi nelle residui 33 - 48 nell&#39;esone 7 del IL-15 gene IL-15ΔE7 (pEF-IL-15ΔE7, 5.811 paia di basi) da SOE (sintesi per estensione sovrapposizione) PCR 17. colonie batteriche che sono stati con successotrasformato con IL-15ΔE7 sono stati verificati mediante digestione con enzimi di restrizione e sequenziamento del DNA seguita da 12, 18. Una grande quantità di DNA plasmidico privo di endotossine è stato preparato come descritto nel passaggio 2 protocollo. <ol><li> Anestetizzare topi acufected mediante iniezione intraperitoneale di tribromoethanol (400 ug per peso corporeo gm) e applicare veterinario pomata oftalmica sugli occhi per evitare secchezza sotto anestesia. Controllare il pinch riflesso punta per assicurare sufficiente profondità dell&#39;anestesia prima dell&#39;inizio delle procedure operative. NOTA: Poiché una pelle 2 cm x 2 cm verranno trattati per IMQ, 2 dosi di pil-15ΔE7 DNA plasmidico (10 mg in 10 ml di PBS per dose) è acufected su 2 siti bersaglio (1 cm x 1 cm ciascuno). </li><li> Mark affiancano pelle (2 cm x 2 cm) che copre l&#39;area acufected. </li><li> Utilizzare Q-applicatore per applicare topicamente la crema IMQ sulla superficie contrassegnata. Nota: passo 5.1 viene eseguita soltanto per la prima dose (60 mg / dose).I prossimi dosi consecutive vengono applicati ai topi non anestetizzati. </li><li> Documentare i cambiamenti della pelle dorsale IMQ-trattati giornalmente con una videocamera ad alta definizione. Nota: Una persona tiene il mouse mentre un altro sta registrando. Ancora immagini sono girato e montato in un secondo momento. </li><li> Euthanize topi iniettando una dose eccessiva di tribromoethanol (800 mg per peso corporeo gm) seguita da dislocazione cervicale il giorno 4 o 7 ° giorno dopo il trattamento IMQ. La pelle è asportato ed elaborato (passi 4,1-4,5). </li></ol> 6. Omogenato della pelle del mouse <ol><li> Utilizzare un paio di forbici chirurgiche per eseguire un taglio orizzontale dalla base della coda. Procedere bilateralmente alla base della arti posteriori e continuare a tagliare verticalmente lungo il fianco alla base dell&#39;arto anteriore. </li><li> sbucciare accuratamente la pelle dal tessuto sottostante dal posteriormente al anteriore. Usare le forbici per tagliare la pelle dorsale. Posizionare la pelle su una piastra di Petri sterile. </li><li> Utilizzare un bisturi per asportare bersagliopelle e congelare in azoto liquido immediatamente. Nota: Le stesse dimensioni della pelle acufected colpo (1 cm x 1 cm) o con il trattamento IMQ (2 cm x 2 cm) è fissato per ogni mouse per minimizzare le variazioni esperimento-to-esperimento. </li><li> Posizionare il tessuto della pelle congelata al centro di un pre-raffreddata malta 2-vano con manici e un pestello. Utilizzare un martello di piombo sulla malta per polverizzare il tessuto. </li><li> posizionare rapidamente il tessuto polverizzato in una nuova provetta contenente 500 ml di reagente di lisi cellulare per l&#39;estrazione di RNA o ad una provetta contenente 50 ml di PBS e 1x proteasi inibitore cocktail avere lisato proteico. </li></ol> 7. H &amp; E e la colorazione immunoistochimica di Sezione della cute <ol><li> Posizionare il tessuto cutaneo in una cassetta e immergerlo in paraformaldeide al 4% durante la notte. </li><li> Incorporare e sezione di tessuto, che nel nostro caso è stato eseguito dal Laboratorio Patologia LAC, NTU. Nota: La sezione è tagliato ad uno spessore di 5 um. Luogo secti tessutions su vetrini con carica positiva. </li><li> Riscaldare le diapositive a 65 ° C per 15 min. </li><li> Porre i vetrini in un rack di colorazione. Immergere il rack in corrispondenti serbatoio contenente sostituto xilene per 5 minuti seguita due volte per immersione sequenziale in 100%, 95%, 80%, 75%, 60% e 50% di etanolo (5 min ciascuna) per la reidratazione. Immergere i vetrini in acqua di rubinetto per 3 minuti prima della colorazione. </li><li> Eseguire ematossilina ed eosina. Nota: H &amp; E macchia è stata eseguita su richiesta al Laboratorio di Patologia presso il LAC, NTU. </li><li> Per macchia immunoistochimica, bloccare la sezione con soluzione blocco a temperatura ambiente per 5 minuti per ridurre il fondo non specifica colorazione. Nota: La soluzione blocco viene sviluppato commercialmente con tecniche di immunoistochimica. Nessun siero animale è contenuto in questo prodotto. </li><li> Immergerlo in PBS per sciacquare la soluzione blocco. </li><li> Diluire la soluzione blocco in PBS a 1:10 e aggiungere 2% di siero fetale bovino (FBS) (soluzione diluente). </li><li&gt; Pipettare l&#39;anticorpo primario opportunamente diluito sulla sezione e incubare per 60 min a temperatura ambiente. Nota: Gli anticorpi sono diluiti in soluzione diluente. concentrazioni di anticorpi per questa colorazione sono stati ottimizzati a 1: 800 e 1: 200 per Ki67 (clone SolA15) e Ly6G (clone 1A8), rispettivamente. Queste concentrazioni si trovano a mostrare macchie distinte, senza colorazione di fondo. <ol><li> Macchiare una sezione serie nello stesso ciclo con la stessa soluzione omettendo l&#39;anticorpo primario per controllare per il legame non specifico dell&#39;anticorpo secondario. </li></ol></li><li> Lavare i vetrini tre volte in TBS più 0,1% Tween-20 (soluzione TBST) per 5 minuti ciascuna. Cambio soluzione tra un lavaggio. </li><li> Pipetta una goccia di polimeri etichettate per ogni sezione e incubare a temperatura ambiente per 40 min. Nota: Il polimero marcato viene commercialmente preparato combinando polimeri amminoacidici con perossidasi e l&#39;anticorpo secondario che si riduce ad un frammento Fab&#39;. Il reagente è pronto all&#39;uso percolorazione immunoistochimica di sezioni di tessuto mouse. </li><li> Lavare i vetrini tre volte in TBST per 5 minuti ciascuno. Cambio soluzione tra un lavaggio. </li><li> Pipetta 3,3&#39;-diaminobenzindine tetraidrocloride soluzione (DAB) sulla sezione di tessuto e lasciare riposare a temperatura ambiente fino un precipitato marrone è visibile sotto un microscopio campo chiaro. Nota: Il tempo per DAB precipitare in presenza di perossidasi è di circa 30 min. </li><li> Immergere i vetrini in acqua per interrompere l&#39;attività perossidasica. Immergere i vetrini in soluzione verde di metile per la colorazione nucleare. Lavare i vetrini tre volte in PBS per 5 minuti ciascuna. </li><li> Posizionare un coprioggetto sulla sezione macchiato che è coperto con montante fisso (8 ml per sezione). </li></ol> 8. fotografia e analisi di macchiato sezione di tessuto <ol><li> Visualizza H &amp; E macchiato e IHC sezioni di tessuto sotto un microscopio a campo luminoso. catturare immagini utilizzando Charge Coupled Device (CCD) collegata al microscopio. per qanalisi QUANTITATIVA, software di imaging può essere utilizzato <ol><li> Scandire l&#39;intera sezioni colorate usando uno ScanScope con un obiettivo 20X. </li><li> Misurare lo spessore epidermico all&#39;interno di un segmento 1 mm dell&#39;epidermide e contare il numero di cellule Ki67-immunoreattive all&#39;interno del segmento. NOTA: quantitativa analisi viene eseguita utilizzando la microscopia automazione e immagine software di analisi. spessore epidermico è definito dalla distanza tra lo strato basale e lo strato più esterno dell&#39;epidermide. </li><li> Contare il numero di cellule Ly6G-immunoreattive nella zona cutanea (230 x 270 um 2 rettangolo) immediatamente sotto topica cutanea IMQ-trattata. </li></ol></li></ol>

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Gli autori non hanno interessi finanziari da dichiarare.

La fase più critica per garantire l&#39;espressione del DNA plasmidico è acufected ad oscillare in modo uniforme e allentare lo strato corneo della pelle. Spingendo gli aghi delicatamente senza tagliare la pelle, la forza dovrebbe essere abbastanza duro per deprimere la superficie. Per facilitare l&#39;assorbimento del DNA in 10 microlitri soluzione su un 1 cm x 1 cm di superficie, gli aghi devono oscillare su e giù per circa 100 volte in 30 s. Si può determinare la forza che deve pungere la pelle e notando il numero di...

La pelle è la prima linea di difesa ospite. Cheratinociti (KC) sono il tipo di cellula importante nella pelle degli esseri umani e topi. In risposta a stimoli ambientali (per esempio luce solare, ossigeno, prodotti chimici e invasione patogeni), KC sono attivati e produrre una vasta gamma di citochine proinfiammatorie e chemochine, quali IL-8, IL-6, IL-1α, IL-1β, TNF α e GM-CSF 1. Insieme innescano il reclutamento di cellule immunitarie per la pelle. Infiammazione cutanea aggravata è spesso associata a numerose malattie umane compresi dermatite da contatto ectopica acuta e l&#39;infiammazione mediata da cellule T cronica (es dermatite allergica da contatto e psoriasi) 2. Modulando risposte proinfiammatorie nella pelle inibendo l&#39;attivazione KC è un approccio plausibile per trattare l&#39;infiammazione cutanea. Questo protocollo descrive un nuovo approccio per esprimere transitoriamente un gene citochina nell&#39;epidermide per studiare res immunitarioponse conseguenti ad un tale trattamento nella pelle. L&#39;epidermide compone lo strato più superficiale della pelle. Essa funge da barriera fisica mantenendo sostanze esterne come acidi nucleici e patogeni di entrare negli strati più profondi della pelle. Diverse tecniche senza ago sono stati stabiliti per il trasferimento epidermica DNA 3, 4. DNA in soluzione o associata con liposomi cationici o vettori di adenovirus è stata applicata direttamente alla epidermide modificati con tecniche come la rimozione dello strato corneo o il trattamento con il reagente depilazione. Rimozione dell&#39;epitelio corneo facilita DNA attraversare la barriera epidermica e l&#39;interazione con cheratinociti e cellule di Langerhans per indurre risposte immunitarie 5. Mentre una grande area di superficie disponibile per il trasferimento di DNA e questo approccio non comporta aghi, ci sono svantaggi tra cui il requisitoper le grandi quantità di DNA periodo (10 - 100 pg), trattamento duro sulla pelle di strippaggio, ei risultati inconsistenti nell&#39;indurre risposta immunitaria negli animali immunizzati senza consegna DNA richiamo 6. Consegna intracellulare microparticelle mediata da DNA nudo alla pelle ha dimostrato di essere altamente efficiente e riproducibile per indurre la risposta immunitaria 7, 8. Una pistola gene portatile è stato utilizzato per bombardare sito bersaglio pelle con plasmide particelle d&#39;oro rivestite di DNA 2 micron di diametro di dimensioni per mezzo del flusso d&#39;aria in pressione dell&#39;elio 9. Il DNA plasmidico è presumibilmente assorbito dalle cellule dendritiche (DC) KCsand nella pelle e la proteina è espressa localmente o essere trasportati a linfonodi drenanti dalle DC 10. Anche se il sistema di pistola gene è semplice e non richiede esperienza tecnica limitata, il costo per la preparazione e la consegna dei &quot;bul DNAlet &quot;(cioè polvere d&#39;oro, gas elio) e per la pistola gene stesso ha limitato l&#39;applicazione generale. Inoltre, la necessità di un sistema di erogazione di gas elio limita la facilità di trasporto pistola genica quando gli esperimenti sono condotti in luoghi diversi. Microseeding è stato dimostrato per ottenere una maggiore efficienza del trasferimento genico di singola iniezione e bombardamento di particelle 11. Microseeding utilizza una pistola tatuaggio per consegnare il DNA alla pelle senza l&#39;uso di perline di particelle 11. oscillante i microaghi sulla pelle utilizzando questo approccio rischia di raschiare direttamente la membrana cellulare e quindi trasferire il DNA a più celle contemporaneamente. Tuttavia, il dolore associato con il gran numero di iniezioni con aghi 0,254 mm di diametro è uno svantaggio. Qui forniamo un approccio alternativo alla consegna del DNA in vivo. Il &quot;acufection&quot; </strong&gt; protocollo abbiamo descritto qui fornisce un modo economico ed efficiente per fornire DNA plasmidico in pelle topo. Brevemente, dieci aghi (0,2 mm di diametro x 13 mm di lunghezza) sono stati legati in un fascio con nastro adesivo. Un volume di 10 microlitri di PBS con 10 pg di DNA plasmide contenente il transgene di interesse è stato posto sulla rasata, depilatoria pelle fianco crema-trattata. Utilizzando il fascio di agopuntura oscillare la superficie (1 cm x 1 cm) della pelle, le cheratine a strato corneo sono stati allentati e il DNA plasmidico applicato alla superficie è stato assorbito nell&#39;epidermide. danni alla pelle è stata monitorata ed è risultato essere il minimo. Espressione del gene trasfettato nella pelle acufected stato confermato sia quantitativa real-time PCR (qRT-PCR) ed ELISA. Gli effetti modulatori del sistema immunitario del acufection consegnate IL-15ΔE7 su infiammazione cutanea sono stati dimostrati utilizzando il modello di topo IMQ-trattati 12. Mentre acufection dimostra di essere un dema facile e menoMetodo nding per la consegna del DNA in vivo, la quantità ottimale di DNA per i diversi geni e le volte per pungere la pelle deve essere attentamente ottimizzata per ottenere risultati riproducibili.

<table><tbody><tr><td>Accu Handy Needle</td><td>Accu</td><td>36Gx0.5</td><td>Dispositivo medico</td></tr><tr><td>NairTM Lozione</td><td>Chiesa & Dwight</td><td>N/A Utilizzare</td><td>per rimuovere i peli</td></tr><tr><td>Shandon Xyline sostituto</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>6764506</td><td>Deparaffinizzazione</td></tr><tr><td>Avertin (2,2,2-Tribrometanolo)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4,840-2</td><td>Anestesia</td></tr><tr><td>2-metil-2-butanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>152463</td><td>Solvente per la dissoluzione dell'avertina</td></tr><tr><td>DifcoTM LB brodo, Miller</td><td>BD</td><td>244620</td><td>Propagazione e mantenimento di E. coli per biologia molecolare</td></tr><tr><td>Complesso ELISA di topo IL-15/IL-15R Kit ELISA Ready-SET-Go</td><td>eBioscience</td><td>88-7215</td><td>Misura la proteina IL-15</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-topo Ly6G</td><td>BioLegend</td><td>127601</td><td>utilizzato per la colorazione immunoistochimica</td></tr><tr><td>anti-topo Ki-67</td><td>eBioscience</td><td>14-5698-80</td><td>Anticorpo utilizzato per colorante immunoistochimico</td></tr><tr><td>Simple Stain Mouse MAXPO (Rat)</td><td>Nichirei Biosciences</td><td>414341F</td><td>Reagente per bloccare il segnale di fondo nella colorazione topo su topo</td></tr><tr><td>Kit substrato DAB Perossidasi (HRP)</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-4100</td><td>Substrato perossidato per colorazione immunoistochimica</td></tr><tr><td>Blocco Ultra V</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>TA-060-UB</td><td>Ridurre la colorazione di fondo aspecifica</td></tr><tr><td>Verde metile</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8884</td><td>Colorazione nucleare</td></tr><tr><td>Vecta MountTM</td><td>Vector Laboratories</td><td>M-5000</td><td>Conservazione permanente delle colorazioni istochimiche</td></tr><tr><td>Compresse cocktail di inibitori della proteasi</td><td>Roche</td><td>04-693-116-001</td><td>Inibire l'attività della proteasi nel lisato cellulare</td></tr><tr><td>Crema Aldara</td><td>3M Parmaceuticals</td><td>N/A</td><td>5% crema imiquimod</td></tr><tr><td>Bessman Tissue Pulverizer</td><td>Spectrum Labs</td><td>189475</td><td>Utilizzo per polverizzare il tessuto cutaneo</td></tr><tr><td>ABI7900HT ciclatore</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td>Saggio PCR quantitativo in tempo reale</td></tr><tr><td>Videocamera</td><td>Panasonic</td><td>HDC-SD60</td><td>Documentazione dell'immagine</td></tr><tr><td>Axio Scope.A1</td><td>ZEISS</td><td>N/A</td><td>Microscopia a campo chiaro</td></tr></tbody></table>

sviluppo di un sistema di consegna economico dna da &quot;acufection&quot; e la sua applicazione alla ricerca della pelle

Development of an Economical DNA Delivery System by "Acufection" and its Application to Skin Research

Disregolazione della risposta immunitaria in pelle è associata a numerosi disturbi della pelle umana. Trasferimento diretto dei geni immuno-correlati nel tessuto della pelle è un approccio interessante per indagare la modulazione immunitaria di infiammazione cutanea in modelli murini di malattie umane. Qui vi presentiamo un protocollo costo-efficacia che ha trasportato DNA nudo in pelle mouse e porta alla espressione del transgene. Il metodo è coniato &quot;acufection&quot;, che denota acu DNA puntura mediata fection trans. Per eseguire acufection, pelle di topo è stato infuso con il DNA in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e poi punge leggermente con un fascio di aghi per favorire l&#39;assorbimento di DNA e trasfezione in cellule. Il DNA plasmidico è presumibilmente occupato da cheratinociti e cellule dendritiche (DC) nella pelle ed espresso in proteine. Puntura meccanico con il aghi per sé non ha causato danni alla pelle o indurre attivazione dei cheratinociti. L&#39;espressionedei geni trasfettati è stato rilevato nella pelle sia a livello trascrizionale e traslazionale seguenti acufection per 2 giorni e mantenuto fino a 7 giorni. L&#39;obiettivo primario per lo sviluppo di questo metodo acufection è stato quello di indagare su un&#39;isoforma precedenza indefinito di IL-15. Usando questo metodo, un splicing alternativo IL-15 isoforma con parzialmente eliminato esone 7 (IL-15ΔE7) è stata espressa nella pelle e successivamente trattati con un recettore Toll-like 7 (TLR7) agonista, imiquimod (IMQ), per indurre infiammazione. Acufection consegnate IL-15ΔE7 in pelle soppressa proliferazione dei cheratinociti, spessore epidermico e il reclutamento di neutrofili nell&#39;infiammazione cutanea IMQ-indotta. Con crescente interesse nell&#39;identificazione dei meccanismi regolatori di infiammazione cutanea, il protocollo qui descritto fornisce un costo alternativo efficace e versatile al cannone gene o microseeding per la consegna del DNA in vivo. Essa può consentire potenzialmente scoperta della funzione di un romanzogene in pelle o per indagare nuovo trattamento per le malattie cutanee.

Mentre alcuni rossore era evidente entro la prima ora dopo puntura con aghi di agopuntura, la pelle liberata il giorno 2 ed è stata osservata alcuna reazione avversa cutanea fino al giorno 7 dopo puntura (Figura 2A). Ago che pungono indotto molto basso livello di epidermico orthokeratosis e infiltrazione dermica minima da H &amp; E analisi comparata con la pelle non trattata (Figura 2B). Lo spessore epidermico <strong class="xfi...

Questo protocollo è un&#39;alternativa economica per esprimere il DNA plasmidico nudo in pelle topo. L&#39;obiettivo generale del protocollo è quello di consegnare i geni immuno-correlati nel tessuto della pelle di delineare il ruolo funzionale di un gene specifico in infiammazione cutanea.

Sviluppo di un sistema di consegna economico DNA da &quot;Acufection&quot; e la sua applicazione alla ricerca della pelle

Dysregulation of immune response in skin is associated with numerous human skin disorders. Direct transfer of immune-related genes into skin tissue is a ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di veicolare geni correlati al sistema immunitario nel tessuto cutaneo per definire il ruolo funzionale di un gene specifico nell'infiammazione cutanea. Questo metodo può contribuire a scoprire la funzione di un gene nuovo nella pelle, favorendo lo sviluppo di nuove terapie per malattie cutanee come la psoriasi.Il principale vantaggio di questa tecnica è che fornisce un modo economico per esprimere DNA plasmidico nella pelle del topo. Per preparare il DNA plasmidico, inoculare tre millilitri di terreno LB contenente antibiotico con la colonie batterica precedentemente trasformata e selezionata. Incubare la coltura tutta la notte su un agitatore a 37 gradi Celsius.Dopo l'incubazione notturna, diluire la coltura batterica in 250 millilitri di terreno LB, integrato con antibiotici, per aumentare la coltura. Incubare la coltura tutta la notte a 37 gradi Celsius con agitazione. Utilizzare un kit di preparazione plasmidica di alta qualità, privo di endotossine, per preparare una grande quantità di DNA.Diluire il DNA plasmidico ottenuto in PBS sterile fino a una concentrazione finale di un milligrammo per millilitro. Dopo aver anestetizzato il topo, applicare un unguento oftalmologico veterinario sugli occhi per prevenire l'essiccamento. Quindi rasare la pelle sulla schiena dell'animale.Applicare una crema depilatoria per sciogliere le proteine cheratiniche nei follicoli piliferi rimanenti. Dopo la depilazione, rimuovere la crema con un batuffolo di cotone inumidito in acqua. Utilizzando un bastoncino di cotone sterile imbevuto di etanolo al 70%, disinfettare la superficie cutanea e delimitare l'area cutanea target con il modello preparato in precedenza. Applicare 10 microlitri di soluzione di DNA contenente 10 microgrammi di DNA plasmidico nell'area cutanea desiderata.Per effettuare l'acufezione del mouse, tenere l'apparato di agopuntura perpendicolarmente rispetto alla pelle e praticare ripetutamente la puntura sulla superficie designata. Eseguire 100 punture nell'arco di 30 secondi oppure fino a quando la soluzione applicata sulla pelle non viene assorbita. Per ottenere un'espressione efficace del DNA plasmidico nel tessuto cutaneo, è importante evitare di penetrare troppo in profondità nella pelle e assicurarsi che la soluzione di DNA venga ben assorbita.Dopo aver completato la procedura, posizionare il topo infetto su un tappetino riscaldante per mantenere la temperatura corporea fino al risveglio dall'anestesia. Quando il topo avrà ripreso una coscienza sufficiente, restituirlo alla gabbia e fornire acqua e cibo. Monitorare attentamente il topo per qualsiasi sintomo di disagio, inclusi cambiamenti comportamentali e aspetto anomalo, nelle prime 48 ore successive alla procedura.Contrassegnare la pelle del fianco che ricopre l'area di due centimetri per due centimetri precedentemente acufetta con IL-15deltaE7. Quindi, utilizzando un applicatore di cotone, applicare topicalmente la crema a base di Imiquimod sulla superficie designata. Per monitorare i cambiamenti giornalieri della pelle dorsale trattata con Imiquimod, un ricercatore deve effettuare la registrazione mentre il secondo tiene saldamente il topo ed espone l'area trattata alla vista della videocamera ad alta definizione.Osservare eventuali cambiamenti come squame argentee, placche o eritema sulla pelle trattata. Dopo aver soppresso il topo come descritto, effettuare un'incisione orizzontale alla base della coda utilizzando un paio di forbici sierologiche e allargare il taglio bilateralmente verso la base di ciascun arto posteriore. Procedere quindi con incisioni verticali allineate ai fianchi fino a raggiungere la base di tutti e quattro gli arti.Staccare con attenzione la pelle dal tessuto sottostante, partendo dalla coda verso la testa dell'animale. Utilizzando forbici, asportare la pelle dorsale e trasferire il campione ottenuto in una piastra di Petri sterile. Con un bisturi, asportare un campione adeguato della pelle bersaglio.Poi congelarlo immediatamente in azoto liquido. Per polverizzare il tessuto cutaneo, posizionare il campione congelato al centro di un macinatore per tessuti a due scomparti precedentemente raffreddato, dotato di manici e di un pestello, e utilizzare un martello di piombo sul mortaio. Trasferire immediatamente il tessuto polverizzato in nuove provette contenenti i reagenti appropriati per qualsiasi analisi successiva.Iniziare la procedura di colorazione riscaldando i vetrini delle sezioni di pelle in paraffina fissate con formalina, preparate come descritto nel protocollo testuale, a 65 gradi Celsius per 15 minuti. Immergere i vetrini due volte in xilene per cinque minuti. Successivamente, reidratare i vetrini attraverso un gradiente di etanolo.Infine, lavare i vetrini in acqua corrente per tre minuti prima della colorazione. Per la colorazione immunoistochimica, disegnare innanzitutto un cerchio intorno al tessuto con una penna impermeabile e quindi incubare il campione con la soluzione di blocco per eliminare la colorazione di fondo non specifica. Dopo il blocco, lavare il vetrino in PBS.Successivamente, pipettare l'anticorpo primario diluito sulla sezione e incubare per 60 minuti a temperatura ambiente. Lavare i vetrini tre volte in TBST per cinque minuti. Quindi applicare una goccia del polimero marcato sulla sezione e incubare il vetrino a temperatura ambiente per 40 minuti.In seguito, lavare il vetrino tre volte in TBST per cinque minuti, cambiando la soluzione tra un lavaggio e l'altro. Quindi aggiungere 100 microlitri di soluzione DAB sulle sezioni di tessuto e lasciare reagire a temperatura ambiente, fino a quando si osserva un prodotto di colore bruno al microscopio.Quindi lavare i vetrini in acqua per arrestare l'attività della perossidasi. Controstainare il campione con la soluzione di Verde Metile, che si lega specificamente al DNA per cinque secondi. Lavare i vetrini tre volte in PBS per cinque minuti ciascuna.Coprire la sezione colorata con otto microlitri di mezzo di montaggio permanente e sovrapporre un coprioggetto. Infine, acquisire le immagini dei vetrini come descritto nel protocollo testuale. Nell'immagine sono mostrati un topo controllo e un topo sottoposto ad acufezione per un'ora, due giorni, cinque giorni o sette giorni prima dell'acquisizione della fotografia.Come mostrato qui, la procedura di acufezione non ha causato danni cutanei visibili. Inoltre, l'acufezione non ha influenzato né lo spessore della pelle né il numero di cellule positive per Ki67. Ulteriore conferma che la procedura non provoca alterazioni dei tessuti o proliferazione delle cellule epidermiche.L'espressione di CXCL-1 e IL-6 è stata misurata mediante qRT-PCR, confermando l'attivazione minima dei cheratinociti osservata in seguito all'acufezione. D'altro canto, qRT-PCR e ELISA hanno dimostrato una marcata espressione di IL-15 nella pelle di topi sottoposti ad acufezione con il gene IL-15.In definitiva, la somministrazione mediata da acufezione del gene IL-15deltaE7 al tessuto cutaneo impedisce lo sviluppo di pelle squamosa e l'infiltrazione di neutrofili nei topi trattati con imiquimod. Una volta padroneggiata, questa procedura può essere eseguita in 12 minuti se effettuata correttamente. Durante il tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di preparare un nuovo fascio di aghi per ogni acufezione e un lotto di DNA plasmidico di alta qualità.Al termine di questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi come l'infezione virale, al fine di rispondere ad ulteriori domande, ad esempio sulla funzione di un nuovo gene nella modulazione della risposta immunitaria antivirale. Una volta sviluppato, questo approccio aprirà la strada ai ricercatori nel campo dell'immunologia per esplorare la risposta immunitaria nella pelle. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come indurre l'espressione del DNA plasmidico nella pelle del topo in modo economico.

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Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Questo protocollo video descrive una tecnica di coltura in vitro basata su cassetta per generare pelle organotipica umana utilizzando cheratinociti epidermici e derma umano devitalizzato. Imitano la funzione e la fisiologia delle loro controparti tissutali in vivo.

Coltura cutanea 3D organotipica: una tecnica di coltura in vitro basata su cassetta per rigenerare l'epidermide umana sul derma acellulare

Il video dimostra un metodo per trasferire direttamente il DNA plasmidico codificante l'interleuchina-15 nel tessuto cutaneo di un modello murino carente di interleuchina-15 attraverso l'agopuntura utilizzando microaghi. Questi microaghi generano micropunture nello strato più esterno della pelle, facilitando l'assorbimento e la trasfezione del DNA plasmidico nelle cellule epidermiche, compresi i cheratinociti, all'interno del tessuto cutaneo.

Somministrazione mediata da acufezione di geni immuno-correlati nei tessuti cutanei di topo

Tatuaggio della pelle è un modo potente e sicuro per la consegna del DNA vaccino intradermica. Qui, un plasmide EGFP codifica DNA viene consegnato da tatuaggio alla pelle di un topo di laboratorio, e l'espressione di EGFP in cellule della pelle viene poi controllata mediante microscopia confocale.

Pelle tatuaggio come un nuovo approccio per la consegna del DNA vaccino

Questo studio dimostra la riprogrammazione delle cellule somatiche verso la pluripotenza in vivo senza la generazione di teratomi. Abbiamo utilizzato l'iniezione idrodinamica della vena caudale di DNA plasmidico codificante i fattori Yamanka per indurre la riprogrammazione in vivo di epatociti adulti in cellule di maggiore pluripotenza.

In vivo riprogrammazione di età somatiche celle a pluripotenza da iperespressione di fattori Yamanaka

L'obiettivo di questo articolo è fornire un protocollo completo e dettagliato su come generare pelle organica umana geneticamente modificata da cheratinociti epidermici e derma umano devitalizzato.

Generazione di culture geneticamente modificate pelle organotipiche Uso devitalizzate derma umano

La mosca mediterranea della frutta (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) è un parassita dell'agricoltura mondiale. Una comprensione più profonda della sua biologia è fondamentale per controllare le popolazioni di mosche e quindi ridurre l'impatto economico. La microiniezione di embrioni è uno strumento fondamentale che consente sia la trasformazione della linea germinale che gli studi di genetica inversa in questa specie.

Consegna degli acidi nucleici attraverso Embrione microiniezione in tutto il mondo agricolo parassita,<em&gt; Capitata Ceratitis</em

In questo articolo, dimostriamo come viene eseguita la tecnica assorbente microbiopsy e come l'esempio può essere utilizzato per l'estrazione di RNA per campionamento semplice e simultanea della pelle e sangue in modo minimamente invasivo.

Microbiopsy assorbente campionamento ed estrazione di RNA per sangue mininvasivo, simultaneo e analisi della pelle

Qui presentiamo un protocollo alle cellule micropattern a risoluzione monocellulare utilizzando l'adesione programmata dal DNA. Questo protocollo utilizza una piattaforma di fotolitografia da banco per creare modelli di oligonucleotidi del DNA su un vetrino e quindi etichetta le membrane cellulari con oligonucleotidi complementari disponibili in commercio. L'ibridazione degli oligos si traduce in adesione cellulareprogrammata.

Modellazione semplice, economica e modulare delle cellule utilizzando il DNA

Qui descriviamo i protocolli per tre tipi di colture di espianti di pelle embrionale aviaria che possono essere utilizzate per esaminare le interazioni tissutali, il filmato timelapse di imaging 4D (3D più tempo), la perturbazione globale o locale della funzione molecolare e la caratterizzazione della biologia dei sistemi.

Utilizzo di espianti di pelle aviaria per studiare il patterning e l'organogenesi dei tessuti

Qui descriviamo i metodi per la microfabbricazione di nanofibre di carbonio allineate verticalmente (VACNF), il trasferimento di VACNF su substrati flessibili e l'applicazione di VACNF su substrati rigidi e flessibili alle piante per la somministrazione di biomolecole e coloranti.

Utilizzo di array di nanofibre di carbonio allineati verticalmente su substrati rigidi o flessibili per la somministrazione di biomolecole e coloranti alle piante

Scopri un metodo economico per esprimere DNA plasmidico nella pelle del topo mediante acufection. Questa tecnica consente di studiare il ruolo di geni immunitari nell'infiammazione cutanea e sviluppare nuove terapie per patologie come la psoriasi.

Sviluppo di un sistema di consegna economico DNA da "Acufection" e la sua applicazione alla ricerca della pelle

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