Manipolazione funzionale delle materne genica Utilizzando In Vitro La maturazione degli ovociti in Zebrafish

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di effettuare la maturazione in vitro degli ovociti di pesce zebra e, se lo si desidera, di manipolare funzionalmente i prodotti genici materni, prima della fecondazione. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia dello sviluppo, relative all'importanza del contributo materno all'embrione. Il vantaggio principale di questa tecnica è la coltura di ovociti in vitro, seguita dalla fecondazione e dalla produzione di embrioni vitali.

E, se lo si desidera, consente la manipolazione funzionale dei prodotti genici materni che agiscono nell'embrione precoce subito dopo la fecondazione. Per iniziare, da otto a 10 giorni prima della manipolazione della coltura in vitro, utilizzare una rete da pesca per trasferire più set di un singolo maschio e una singola femmina del ceppo desiderato in una vasca di accoppiamento. Lasciali nella vasca di accoppiamento durante la notte.

Dopo aver permesso ai pesci di accoppiarsi fino al pomeriggio successivo, usa una rete per separare le femmine che producono uova durante l'accoppiamento e mettile in una vasca separata. Nutri queste femmine due volte al giorno con una miscela di mangime contenente circa una quantità uguale di artemia salina e fiocchi di cibo per pesci. In condizioni sterili, aggiungere 20 millilitri di L-15 Medium di Leibovitz con l-glutammina, PH 7.0, a un tubo conico da 50 millilitri.

Quindi, utilizzare 10 idrossido di sodio normale per portarlo a PH 9.0. Aggiungere 9 millilitri di L-15 Medium a due tubi conici separati da 50 millilitri. Quindi, etichettare una provetta DHP e l'altra DHP.

Nel tubo DHP, aggiungere 10 microlitri di DHP, 490 microlitri di DH2O e 500 microlitri di 10% BSA. Nel tubo DHP, aggiungere 100 microlitri di 10 milligrammi per millilitro di gentamicina, 400 microlitri di DH2O e 500 microlitri di BSA al 10%. Per effettuare la dissezione degli ovociti, iniziare preparando una soluzione madre di tricaina allo 0,2% in DH2O, tamponata a PH 7,0 con un tris molare PH 9,0.

Mantieni questa soluzione a 4 gradi Celsius. Da zero a quattro ore prima della fine del ciclo di luce giornaliero nella struttura, in un becher da 250 millilitri, aggiungere 20 millilitri di soluzione madre di tricaina allo 0,2%, PH 7,0, a 80 millilitri di acqua di pesce e mescolare. È fondamentale avviare la procedura entro quattro ore dalla fine del ciclo di luce diurna a cui i pesci sono abituati.

In caso contrario, gli ovociti non matureranno correttamente. Usando un cucchiaio, raccogli i pesci soppressi dalla soluzione di tricaina e sciacquali brevemente in acqua di pesce. Quindi, metti il pesce su un tovagliolo di carta per assorbire l'acqua in eccesso.

Usa una lama di rasoio pulita per decapitare il pesce soppresso a livello della pinna pettorale. Quindi, con le forbici da dissezione, praticare un'incisione longitudinale sul lato ventrale del pesce, estendendosi dall'estremità anteriore alla zona anale. Posizionare il pesce su una capsula di Petri al microscopio da dissezione con luce incidente.

Quindi, utilizzando un paio di pinze da dissezione, isolare le porzioni ovariche e trasferire il tessuto in un piatto di coltura di 35 x 10 millimetri, contenente quattro millilitri di L-15 Meidum di Leibovitz, DHP. Ora, con una pinza da dissezione, dissociare delicatamente gli ovociti dalla massa follicolare. Ordina i quattro ovociti allo stadio iniziale, che sono quasi al massimo delle dimensioni e caratterizzati da un citoplasma scuro opaco e da una vescicola germinale prontamente evidente, o GV, situata asimmetricamente all'interno dell'ovocita.

Scartare gli ovociti nelle fasi iniziali e gli ovuli traslucidi allo stadio maturo 5. Utilizzare una pipetta di vetro per pascolo per trasferire i quattro ovociti allo stadio iniziale in un secondo piatto di coltura di plastica da 35 x 10 millimetri, contenente quattro millilitri di terreno L-15 di Leibovitz, più DHP. Trasferire quantità minime di terreno DHP negativo nel piatto, contenente la soluzione DHP più.

Se si inietta l'mRNA, immediatamente prima dell'iniezione, utilizzare acqua di osmosi inversa di grado RNA e cloruro di potassio 0,2 molare per diluire l'MRNA in una soluzione finale di cloruro di potassio 0,1 molare. Se si iniettano morfolini, o MO, immediatamente prima dell'iniezione, diluire i MO alla concentrazione desiderata utilizzando acqua di osmosi inversa di grado RNA e cloruro di potassio 0,2 molari, per ottenere una concentrazione finale di cloruro di potassio 0,1 molare. Quindi, per eseguire l'iniezione, tenere manualmente gli ovociti con una pinza fine e, utilizzando un ago realizzato con una pipetta capillare di vetro tirata, iniettare circa un nanolitro negli ovociti di stadio quattro wild-type.

Continuare a incubare gli ovociti immaturi e iniettati in terreno DHP a 26,5 gradi Celsius. Controllare ogni 30 minuti circa per assicurarsi che gli ovociti rimangano intatti e stiano subendo una corretta maturazione, diventando progressivamente traslucidi. Utilizzare una pipetta da pascolo per rimuovere eventuali ovociti lizzanti.

E gettarli in un becher per rifiuti di laboratorio, per mantenere la qualità del mezzo. Con circa la metà del volume del terreno DHP fresco, scambiare il terreno di coltura per mantenere una soluzione limpida, a seconda della quantità di lisi degli ovociti. Quando la maggior parte degli ovociti è diventata traslucida e ha una GV che non è più evidente, utilizzare una pinza extra-fine per fare una lacerazione nella membrana follicolare, in una regione con maggiore spazio tra l'ovocita e la membrana.

Staccare una parte della membrana e, tenendo premuta la parte sbucciata, far rotolare l'ovocita fuori dalla membrana. Un altro passaggio critico è la rimozione della membrana follicolare. Se questo strato non viene completamente rimosso, la fecondazione e l'espansione del corion saranno ostacolate.

Trasferire gli ovociti defollicolati in un volume minimo di terreno, in una piastra di Petri con alcune gocce di terreno di coltura DHP, e procedere alla fecondazione. Verso la fine della fase di maturazione degli ovociti, e prima della defollicolazione, preparare una soluzione di spermatozoi utilizzando i testicoli di cinque maschi in 500 microlitri di soluzione di Hank. Aggiungere da 10 a 50 microlitri di soluzione di spermatozoi agli ovociti defollicolati nel terreno di coltura DHP.

Quindi, attendi 10 secondi. Utilizzando una pipetta, aggiungere alcune gocce di terreno E3 agli ovociti. Attendere un minuto, quindi utilizzare il mezzo E3 per allagare il piatto.

Dopo aver lasciato che gli embrioni fecondati si sviluppino, utilizzare un microscopio da dissezione con ottica a luce trasmessa per osservare la progressione attraverso le fasi di scissione per garantire una fecondazione di successo, come descritto in precedenza per la fecondazione e la stadiazione. Come si vede dall'espressione della GFP, gli ovociti provenienti da colture in vitro sono in grado di produrre proteine da mRNA esogeno durante lo sviluppo degli ovociti in appena due ore. Tuttavia, solo gli ovociti che avviano le condizioni di coltura al quarto stadio dell'oogenesi possono svilupparsi in ovociti maturi al quinto stadio.

In questo esperimento, l'mRNA iniettato di aurora B wild-type salva gli effetti fenotipici di una mutazione nel gene corrispondente, l'isola cellulare. Anche gli embrioni di un gruppo di controllo possono svilupparsi per mostrare il corrispondente fenotipo mutante. L'iniezione di un Morpholino che blocca la traduzione può fenocopiare con successo il fenotipo mutante noto, come dimostrato dall'iniezione di lrmp-MO negli ovociti, che imita il fenotipo mutante del corrispondente ciclo futile della mutazione.

La codifica dell'mRNA può anche essere iniettata in ovociti wild-type o mutanti per visualizzare i prodotti corrispondenti all'interno dell'embrione precoce. Ad esempio, come si vede qui, la proteina Sass6-mCherry si localizza nei focolai marcati dal marcatore centrosoma Gamma tubulina. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa 5-6 ore, se eseguita correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di non affrettare la procedura e consentire una corretta maturazione degli ovociti prima della defollicolazione e della fecondazione. Dopo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come la fissazione degli embrioni, per rispondere a ulteriori domande. Come il salvataggio del gene di interesse o la localizzazione di RNA o proteine.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della genesi embrionale precoce per esplorare il contributo dei prodotti genici materni nel pesce zebra. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come manipolare funzionalmente i prodotti genici materni attraverso la maturazione in vitro di ovociti di pesce zebra.