Una guida visiva per Ordinamento elettrofisiologiche registrazioni con 'SpikeSorter'

L'obiettivo generale di questo video è mostrare agli elettrofisiologi come utilizzare il programma, SpikeSorter, per rilevare e ordinare i picchi nelle registrazioni extracellulari dal tessuto neurale realizzato con array di microelettrodi. Il nostro obiettivo era quello di fornire una soluzione semplice a questo compito di smistamento delle punte utilizzando un programma con un'interfaccia user-friendly. SpikeSorter è in grado di leggere file in una varietà di formati e offre una varietà di strategie di pre-elaborazione e rilevamento degli eventi, oltre alle opzioni di ordinamento ed esportazione dei dati.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono all'analisi dei comportamenti neurali, studiati mediante registrazioni extracellulari con array multielettrodi. In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà a causa della complessità del compito e della mancanza di una metodologia standard e di una convalida oggettiva. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta, quando ci siamo trovati di fronte al problema di ordinare le nostre registrazioni, fatte con array multi-elettrodo a 54 canali e non abbiamo trovato alcuna soluzione disponibile.

Per iniziare questa procedura, aprire il programma. Vai su file e apri, quindi seleziona il formato del file di registrazione dall'elenco a discesa, in basso a destra nella finestra di dialogo del file aperto risultante. Quindi, seleziona il file e fai clic su Apri.

Fare clic su OK al termine della lettura. I segnali di registrazione vengono ora visualizzati nell'indicatore della forma d'onda della tensione. Se la registrazione non è filtrata e contiene il potenziale del campo locale, rimuoverlo facendo clic sull'icona del filtro sulla barra degli strumenti.

Selezionare il filtro butterworth passa-alto, una frequenza di taglio adatta e il numero di poli, quindi premere Fallo.Premere OK, quindi fatto, quindi ispezionare la forma d'onda filtrata sul display. I segnali di tensione possono essere ispezionati tenendo premuto il tasto sinistro del mouse e quindi trascinandoli. Utilizzare la rotellina di scorrimento per ingrandire e ridurre determinate funzioni.

Passa il mouse su punti specifici della forma d'onda per visualizzare i valori di tensione corrispondenti nell'angolo in alto a sinistra. Facendo doppio clic sulla finestra, si apre una finestra di dialogo che può essere utilizzata anche per esaminare rapidamente qualsiasi parte della registrazione e per esaminare eventi specifici nei canali o nei cluster, una volta completato il rilevamento e l'ordinamento degli eventi. Quindi, verifica la presenza di canali che potrebbero essere difettosi e che devono essere mascherati.

Fare clic sull'icona di controllo del canale e ispezionare il grafico. Per mascherare un canale esterno, selezionare il numero del canale o selezionarlo dall'elenco dei problemi. Al termine, chiudere la finestra di dialogo, quindi fare clic su Sì al prompt per salvare i valori della maschera.

I canali mascherati sono disattivati nell'indicatore di tensione. In questa procedura, andare a Rilevamento eventi pre-elaborazione per visualizzare la finestra di dialogo di rilevamento eventi. Usa il cursore in alto a destra per ispezionare il livello di rumore sui canali specifici.

Un'attenta ispezione del voltage display, può anche rivelare canali silenziosi o insolitamente rumorosi che devono essere mascherati. Scegliere la soglia variabile per il rilevamento degli eventi. L'intervallo di soglie consigliato è compreso tra 4,0 e 6,0 volte il rumore.

Selezionare 4.5. Scegliere il metodo di rilevamento dinamico del filtro multifasico dall'elenco a discesa. Impostate la finestra in modo che sia circa la metà della larghezza di una tipica forma d'onda spike, con valori compresi nell'intervallo, da 0,15 a 0,5 millisecondi.

Successivamente, selezionare il metodo di allineamento scegliendo l'opzione che meglio identifica una singola caratteristica temporalmente localizzata dei picchi che vengono ordinati. Lasciare le altre opzioni ai valori predefiniti e premere Start. Premere Fine per uscire dalla finestra di dialogo.

La finestra della forma d'onda della tensione mostra gli eventi rilevati in grigio sul canale centrale assegnato. I parametri di rilevamento degli eventi possono essere regolati in base ai risultati osservati a questo punto. Ad esempio, il rilevamento degli eventi può essere rieseguito con una soglia di rilevamento inferiore, al fine di rilevare più eventi.

Il passaggio successivo non viene in genere eseguito prima dell'ordinamento di routine, ma è utile quando si esegue l'ordinamento per la prima volta o quando si rilevano dati non familiari. Vai su ordina, converti i canali in cluster, per creare un singolo cluster per ogni canale dell'elettrodo non mascherato, supponendo che a ciascun canale siano assegnati alcuni eventi. Esamina questi cluster andando a rivedere, visualizzare, pulire e dividere i cluster per visualizzare un'altra finestra di dialogo.

Utilizzare il controllo di selezione per selezionare il cluster da visualizzare. Seleziona un cluster che abbia due o più sottocluster distinti, quindi premi il pulsante di riallineamento per modificare l'ora di ciascun evento, in modo da adattarlo meglio alla forma del modello. Quindi, premi Autosplit per raggruppare gli eventi in base alla distribuzione dei componenti principali.

Successivamente, fare clic sulle caselle di controllo per esaminare le forme d'onda nei sottocluster. Utilizzare il cursore per esaminare le forme d'onda corrispondenti. Come esercizio, utilizzare uno dei piccoli pulsanti di divisione per creare un nuovo cluster ed esaminarlo.

Si noti come il cluster rosso, ora rivela due sottocluster più chiaramente, dopo che quello verde è stato diviso. L'ordinamento potrebbe continuare manualmente in questo modo, ma è preferibile utilizzare la procedura di ordinamento automatico più veloce. Premi Fine e vai su Ordina, Ordina automaticamente.

Lasciare selezionata l'opzione Ignora rilevamento eventi se il rilevamento eventi è già stato eseguito, come qui. Se non è selezionata, il rilevamento degli eventi verrà eseguito automaticamente, utilizzando i valori dei parametri e le scelte ereditate dalla finestra di dialogo di rilevamento degli eventi. Nel pannello di clustering sottostante, selezionare una finestra temporale sufficientemente grande da contenere l'intera forma d'onda del picco, che precede e segue il punto di allineamento.

Selezionare quindi un'opzione di riallineamento da utilizzare durante il clustering e scegliere una dimensione minima del cluster. Decidere il numero di dimensioni nello spazio del PC che verranno utilizzate per il clustering e lasciare le altre opzioni alle impostazioni predefinite. Successivamente, premi Avvia per avviare l'ordinamento automatico.

Al termine dell'ordinamento automatico, premere avanti per passare alla fase di unione e divisione guidata manualmente, quindi premere Inizia. Nella nuova finestra di dialogo, le coppie di cluster che non sono chiaramente simili o distinte verranno presentate in sequenza. Per ogni coppia presentata, usa i pulsanti per scegliere se unire la coppia, unirla e dividerla nuovamente, per contrassegnare la coppia come distinta o ambigua, se non è chiaro quale sia la decisione migliore.

Fare clic sulle caselle di controllo per visualizzare un grafico dell'altezza del picco di picco o della prima o della seconda componente principale rispetto al tempo o degli istogrammi di correlazione automatica e incrociata. Questi possono aiutare nelle decisioni. Qui, vediamo un esempio di decisione di fusione.

Seguito da una decisione di fusione e divisione. Se l'opzione Unisci e dividi non è in grado di trovare cluster chiaramente separabili, utilizzare il dispositivo di scorrimento nella finestra di dialogo con prompt per variare manualmente un parametro di clustering e trovare una divisione che sembri soddisfacente. Se non è possibile ottenere questo risultato, utilizzare il pulsante di ripristino per tornare allo stato originale dei due cluster.

Al termine, premere dividi come mostrato. Ora vai alla revisione, post-elaborazione. Utilizzare il pulsante di pulizia dell'allineamento per rimuovere gli eventi dai cluster che non corrispondono al modello di cluster.

Quindi, utilizzare il pulsante di riclusterizzazione per riassegnare gli eventi non raggruppati a modelli specifici in base al valore di corrispondenza. Gli eventi recuperati sono contrassegnati come sottocluster di ciascun cluster padre e possono essere ispezionati utilizzando la finestra di dialogo visualizza, pulisci e dividi cluster. Questi eventi rimarranno nel cluster e verranno esportati come tali, a meno che non vengano eliminati.

Quindi, torna alla finestra di dialogo di post-elaborazione. Utilizzare il pulsante Elimina e il controllo di rotazione accanto ad esso per eliminare i cluster con un rapporto segnale/rumore inferiore alla soglia selezionata. Successivamente, utilizzare il pulsante di ordinamento per rinumerare i cluster in base a un criterio scelto.

Questa figura mostra la visualizzazione, ottenuta andando a visualizzare, le forme d'onda ordinate per la registrazione che è stata appena ordinata. L'esperienza comune è che le forme d'onda per una coppia di cluster sullo stesso canale sembrano identiche, ma la finestra di dialogo di confronto delle coppie mostra comunque cluster distinti nella proiezione PC. Le decisioni di fusione che seguono le precedenti fasi di ordinamento sono talvolta suggerite da grafici temporali di ampiezza e correlogrammi incrociati.

Ciò illustra una decisione di fusione basata sulla presenza di una forte correlazione incrociata asimmetrica a brevi intervalli di tempo, accoppiata con una chiara relazione tra i primi valori delle componenti principali delle due unità, mostrati qui sull'asse verticale. Questa figura mostra un caso in cui mancano prove simili per la fusione. Il correlogramma incrociato non è fortemente asimmetrico e gli autocorrelogrammi sono diversi.

Sebbene le forme d'onda siano simili, le due unità non dovrebbero probabilmente essere fuse, a causa della differenza nelle distribuzioni dei componenti principali. Questa figura mostra un caso in cui le forme delle forme d'onda sono simili e i primi valori dei componenti principali di due unità si fondono quando una di esse smette di sparare e l'altra inizia. In questo caso, la decisione di fondere sembra semplice.

Speriamo che questa breve introduzione a SpikeSorter sia stata utile. Abbiamo in programma di continuare a sviluppare il programma e di aggiungere nuove funzionalità dove possono essere utili. A tal fine, accogliamo con favore le segnalazioni di bug, i feedback costruttivi e i suggerimenti per il miglioramento.