Visualizzazione di interazione proteina-proteina in nucleare e citoplasmatica frazioni da Co-immunoprecipitazione e In Situ Proximity Assay legatura

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di confrontare i vantaggi e gli svantaggi della co-immunoprecipitazione, o co-ip, e del saggio di ligazione di prossimità, o pla, nella visualizzazione delle interazioni proteina-proteina in diversi compartimenti cellulari. Il confronto qui presentato di due diversi metodi può aiutare gli scienziati a decidere quale sia più adatto per il loro scopo specifico quando studiano i modelli di distribuzione delle interazioni proteiche nel nucleo e nel citoplasma di una cellula. Il vantaggio principale di co-ip è quello di rilevare autentiche interazioni proteico-proteiche.

Al contrario, il vantaggio del pla è quello di analizzare le interazioni proteiche dell'istituto in modo rapido a livello di singola cellula. Dopo aver coltivato e raccolto le cellule hex293 secondo il protocollo di testo, a 3 volte 10 alla sesta cellula, aggiungere 300 microlitri di soluzione di estrazione citoplasmatica a freddo e far vorticare le cellule alla massima velocità per 15 secondi. Incubare l'estratto su ghiaccio per 30 minuti e, ogni 10 minuti durante l'incubazione, far vorticare il campione per cinque secondi.

Quindi aggiungere 16,5 microlitri di soluzione di estrazione citoplasmatica fredda, agitare per cinque secondi e incubare il campione su ghiaccio per cinque minuti. Agitare l'estratto per cinque secondi e centrifugare il campione a 16.000 x g e 4 gradi Celsius per cinque minuti. Trasferire il surnatante in una nuova provetta preraffreddata e tenerlo in ghiaccio fino al momento dell'uso, quindi utilizzare un millilitro di PBS freddo per lavare i pellet insolubili tre volte pipettando su e giù e rimuovendo il PBS dopo ogni lavaggio.

Quindi, aggiungere 150 microlitri di soluzione di estrazione nucleare fredda, agitare per 15 secondi e incubare su ghiaccio per un'ora. Ogni 10 minuti durante l'incubazione, agitare il campione per 15 secondi e utilizzare un puntale da 200 microlitri per pipettare la soluzione 10 volte. Agitare la provetta per 15 secondi e centrifugare il campione a 16.000 x g a 4 gradi Celsius per 10 minuti, quindi trasferire il surnatante contenente l'estratto nucleare in una nuova provetta preraffreddata e tenerla in ghiaccio fino all'uso.

Rimuovere il 10% di ciascuno del volume degli estratti nucleari e citoplasmatici come input, quindi aggiungere PBS freddo agli estratti rimanenti fino a un volume finale di un millilitro. Tenere in ghiaccio fino al momento dell'uso. Dopo aver preeliminato le microsfere magnetiche coniugate con proteina g, se necessario, combinare 40 microlitri di microsfere magnetiche coniugate con proteina g con quattro microgrammi di anticorpo policlonale rapido anti-RBM3, o IGG rapido come controllo negativo in 200 microlitri di PBST.

Incubare a temperatura ambiente su un rotatore per 40 minuti. Posizionare le provette su una rastrelliera magnetica, quindi rimuovere e gettare il supernatent. Quindi, con 200 microlitri di PBST, lavare le perline una volta.

Aggiungere un millilitro di lisati diluiti alle perle e incubare su un rotatore a quattro gradi Celsius durante la notte. Il giorno seguente, posizionare le provette sulla rastrelliera magnetica e aspirare il supernatent. Aggiungere 0,5 millilitri di PBST alle perle e lavarle tre volte su un rotatore a quattro gradi Celsius, con una velocità fissa di 20 giri/min per 10 minuti.

Eluire la proteina dalle perle aggiungendo 40 microlitri di tampone per campioni, quindi riscaldare il campione a 70 gradi Celsius per 10 minuti. Dopo aver fatto girare le perline, trasferire il liquido in un nuovo tubo da 1,5 millilitri. Per eseguire la chimica immunocitica, seminare cellule HEK293 a 1,5 volte 10 nelle quattro cellule per camera in un vetrino rivestito di polidelisina a otto camere.

In 0,4 millilitri di DMEM integrato con il 10% di FPS e 100 unità per millilitro di penstrep. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per 48 ore, quindi aspirare il terreno e utilizzare il 4% di PFA per fissare le cellule a temperatura ambiente per 10 minuti in una cappa a flusso laminare. Quindi aspirare il PFA e utilizzare 0,5 millilitri di PBS per camera per lavare le cellule tre volte.

Aggiungere lo 0,5% di tritonX100 con il 5% di NGS e PBS per permeare e bloccare le cellule e incubare a temperatura ambiente per un'ora. Quindi, dopo aver diluito gli anticorpi primari monoclonali anti NF90 e gli anticorpi policlonali anti RBM3 da uno a 100, aggiungere gli anticorpi primari ai pozzetti e incubare sull'agitatore a quattro gradi Celsius durante la notte. Il giorno seguente, utilizzare 0,5 millilitri di PBS per lavare le camere tre volte per 10 minuti ciascuna.

Per eseguire la chimica immunocitica, aggiungere alle cellule una diluizione da uno a 500 di anticorpi antitopo accoppiati a colorante fluorescente verde e anticorpi anticoniglio accoppiati a colorante fluorescente rosso e incubare a temperatura ambiente per un'ora. Aggiungere una diluizione da una a 5.000 di DAPHE NBPS per controcolorare i nuclei e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti, quindi lavare i campioni con PBS come prima. Rimuovere le camere dal vetrino e asciugarle, prima di utilizzare 250 microlitri di supporto di montaggio per diapositiva per montarle.

Per preparare le sonde per il saggio di legatura di prossimità in provetta, dopo l'incubazione delle cellule e degli anticorpi primari e il lavaggio come appena dimostrato, diluire le sonde prefabbricate da uno a 5 in tritonx100 allo 0,1% e NGS e PBS al 5%, in un volume totale di 320 microlitri per un vetrino a otto camere. Incubare la soluzione a temperatura ambiente per 20 minuti. Rimuovere le camere dal lato di vetro e aggiungere le sonde diluite, quindi incubare le camere in un incubatore con umidità a 37 gradi Celsius per un'ora.

Preparare una soluzione di legatura mescolando otto microlitri di ligasi, 64 microlitri di materiale di legatura 5x e 248 microlitri di acqua. Staccare il liquido dal vetrino e utilizzare il tampone di lavaggio onex A per lavare i campioni due volte per cinque minuti ciascuno. Aggiungere la soluzione di legatura ai campioni e incubarli in un incubatore a umidità a 37 gradi Celsius per 30 minuti.

Preparare la soluzione di amplificazione mescolando quattro microlitri di polimerasi, 64 microlitri di stock di amplificazione 5x e 252 microlitri di acqua e avvolgere il tubo in un foglio per proteggerlo dalla luce. Quindi, picchiettare il liquido dal vetrino e utilizzare un tampone di lavaggio A per lavare i campioni due volte per due minuti ciascuno. Aggiungere la soluzione di amplificazione ai campioni e incubare a 37 gradi Celsius in un incubatore buio e umido per 100 minuti.

Quindi, dopo aver picchiettato il liquido come prima, lavare i campioni due volte per 10 minuti ciascuno nel tampone di lavaggio B prima di lavarli una volta in 0,1 x tampone di lavaggio B.Infine, asciugare il vetrino e montare i campioni con 250 microlitri di terreno di montaggio commerciale con DAPHE, esaminare la fluorescenza al microscopio e acquisire immagini con la telecamera CCD. Gli esperimenti di co-immunoprecipitazione con RBM3 come proteina esca hanno rivelato che le interazioni NF90-RBM3 sono prevalentemente presenti nel nucleo e una minoranza si trova nel citoplasma. In questo esperimento di immunofluorescenza, NF90 e RBM3 sono entrambi osservati nel nucleo.

Entrambe le proteine si trovano anche nel citoplasma in C2 ed entrambe le proteine mostrano una perfetta colocalizzazione in ciascun compartimento. Come si vede in queste immagini, il test di legatura di prossimità ha rivelato il modello di interazioni NF90-RBM3, che è molto simile alla chimica immunocitica convenzionale, che ha la maggior parte delle interazioni nel nucleo nella maggior parte delle cellule. Solo una piccola percentuale di cellule ha dimostrato una distribuzione prevalentemente citoplasmatica delle interazioni NF90-RBM3.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che, sebbene più conveniente, il PLA non riflette direttamente le interazioni proteico-proteiche. Al contrario, co-ip rileva l'interazione diretta. Inoltre, la specificità dell'anticorpo primario determina la qualità del risultato.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come scegliere un metodo appropriato per studiare le interazioni proteina-proteina in diversi compartimenti cellulari in base al tuo scopo sperimentale.