Name: Visualizzazione di interazione proteina-proteina in nucleare e citoplasmatica frazioni da Co-immunoprecipitazione e In Situ Proximity Assay legatura (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Impara a confrontare la co-immunoprecipitazione e la proximity ligation assay per visualizzare le interazioni proteina-proteina nel nucleo e nel citoplasma di cellule HEK293. Questo metodo aiuta a scegliere l'approccio più adatto.

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Questo studio è stato sostenuto dal Fondo Nazionale Svizzero per la Ricerca Scientifica (FNS, 31003A_163305).

1. Co-immunoprecipitazione <ol><li> Seed HEK293 cellule a 2 x 10 5 cellule per pozzetto in una piastra da 6 pozzetti in 2 ml modificato (DMEM) supplemento di Dulbecco dell&#39;Aquila con il 10% di siero fetale bovino (FBS) e 100 U / mL penicillina-streptomicina (Pen-Strep) . </li><li> Crescere le cellule per 48 ore a 37 ° C con 5% di CO 2. </li><li> Lavare le cellule con soluzione salina fredda tampone fosfato (PBS) per tre volte. Celle di raccolta per centrifugazione a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Preparazione delle frazioni nucleari e citoplasmatici utilizzando reagenti commerciali estrazione nucleari e citoplasmatici. Seguire le istruzioni del produttore con alcune modifiche. <ol><li> Utilizzare 3 x 10 6 cellule per un esperimento di co-immunoprecipitazione (circa il 90% di confluenza da 3 pozzetti di una piastra da 6 pozzetti). Aggiungere 300 ml soluzione fredda citoplasmatica di estrazione (CER I) e vortex per 15 secondi alla massima velocità. </li><li> Incubare per 30 minuti in ghiaccio. Durante l&#39;incubazione, vortex per 5 s ogni 10 min. </li><li> Aggiungere 16,5 ml di estrazione a freddo citoplasmatica soluzione II (CER II), vortex per 5 secondi e incubare per 5 minuti in ghiaccio. </li><li> Vortex per 5 secondi e centrifugare a 16.000 xg per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Trasferire il surnatante (estratto citoplasmatica) in un nuovo tubo pre-raffreddata, e tenere in ghiaccio fino al momento dell&#39;utilizzo. </li><li> Lavare pellet insolubili (nuclei contenenti) tre volte con 1 ml di PBS freddo ogni volta pipettando su e giù cinque volte. Rimuovere PBS dopo lavaggio. </li><li> Aggiungere 150 ml soluzione di estrazione a freddo nucleare (NER), vortex per 15 secondi e incubare 1 ora su ghiaccio. Durante l&#39;incubazione, vortex per 15 secondi e pipetta 10 volte con una punta di 200 microlitri ogni 10 min. </li><li> Vortex per 15 s e centrifugare a 16.000 xg per 10 min a 4 ° C. </li><li> Trasferire il surnatante (estratto nucleare) in un nuovo tubo pre-raffreddata, tenere in ghiaccio fino al momento dell&#39;uso. </li></ol></li><li> Estrarre il 10% del volume di estratti nucleari e citoplasmatici ciascuno come ingressi. </li><li> UNdd PBS freddo ai rimanenti estratti ad un volume finale di 1 ml. Tenere in ghiaccio fino al momento dell&#39;uso. NOTA: Pre-clearing non è essenziale quando si utilizzano proteine ​​sfere magnetiche G-coniugato. Tuttavia, se lo sfondo è elevata, eseguire il pre-clearing incubando 40 microlitri di proteine ​​perline G-coniugati magnetici (50% liquami) e 1 ml diluito lisato da questo passaggio a 4 ° C per 30 minuti su un rotatore. surnatante separato (lisato pre-cancellati) da perline con cremagliera magnetica. Eliminare le perline. </li><li> Per anticorpo primario coppia con sfere magnetiche proteine ​​G-coniugati, incubare 40 microlitri di proteine ​​sfere magnetiche G-coniugati (50% slurry) con anticorpi 4 mg policlonale di coniglio anti-RBM3 o IgG di coniglio (controllo negativo) in 200 ml di PBS più Tween 20 tampone (PBST, 0,02% Tween 20) a temperatura ambiente (RT) per 40 minuti su un rotatore. </li><li> perline e surnatante separato anticorpo accoppiato con una cremagliera magnetica, e scartare il surnatante. Lavare le perline una volta con 200 microlitri PBST (0,02%). </li><li> Aggiungere 1ml diluito lisati (o, se necessario, lisati pre-autorizzato) ai talloni e incubare su un rotatore a 4 ° C durante la notte. </li><li> Il giorno successivo, separare le perline e il surnatante da una cremagliera magnetica, e scartare il surnatante. Lavare 3 x 10 minuti con 0,5 ml di PBST (0,02%) per ciascun tubo a 4 ° C su un rotatore con una velocità fissa di 20 rpm. </li><li> Eluire proteine ​​delle perle con l&#39;aggiunta di tampone campione di 40 microlitri (1x tampone campione commerciale e 50 mm 1,4-ditiotreitolo (DTT)). Riscaldare a 70 ° C per 10 min. Spin giù e travaso di liquidi in una nuova provetta da 1,5 ml. </li><li> Diluire lisati input in tampone campione (concentrazione finale: tampone campione commerciale 1x e 50 mM DTT) e scaldare a 70 ° C per 10 min. ingressi di carico e proteine ​​immunoprecipitate dal l&#39;ultimo passo di un prefabbricato 4-12% gel bis-Tris. Il volume di carico dei pozzetti non deve superare i 20 microlitri. Eseguire l&#39;elettroforesi in tampone esecuzione commerciale 1x in ghiaccio per 35 min. NOTA: nucleare di carico ed estratto citoplasmaticas in un rapporto di 1: 2 (V / V), che riflette la stessa quantità iniziale di cellule. </li><li> Trasferimento proteine ​​di membrana PVDF in tampone di trasferimento commerciale 1x a 30 V per 2 ore a 4 ° C. </li><li> Block membrana con 5% di latte scremato in PBST (0,1% Tween 20) a temperatura ambiente per 40 minuti su un agitatore. </li><li> Incubare a membrana con anticorpi primari (sia diluito in 1: 1.000) in PBST (0,1%) a 4 ° C durante la notte. </li><li> Lavare 3 x 10 min con PBST (0,1%) a temperatura ambiente su un agitatore. </li><li> Incubare a membrana con perossidasi di rafano (HRP) coniugata anti-topo o anti-coniglio anticorpi secondari (sia diluito in 1: 5.000) in PBST (0,1%) a temperatura ambiente per 1 ora. </li><li> Lavare 3 x 10 min con PBST (0,1%) a temperatura ambiente su un agitatore. </li><li> Utilizzare 0,2 ml chemiluminescenza (ECL) miscela di substrato per cm 2 di membrana, incubare a temperatura ambiente per 5 min. Evitare di tutta la luce da questo punto in poi, tranne luci rosse. </li><li> Eliminare il liquido ed esporre ad una pellicola a raggi X in una cassetta di pellicola. Sviluppare pellicola utilizzando un pr pellicola automaticamacchina ocessing. </li></ol> 2. Immunocitochimica e di prossimità legatura Assay <ol><li> Seme HEK293 cellule a 1.5 x 10 4 cellule per camera in una 8-camera di poli-D-lisina scorrevole rivestito in 0,4 ml DMEM supplementato con 10% FBS e 100 U / ml Pen-Strep. </li><li> Crescere le cellule per 48 ore a 37 ° C con 5% di CO 2. </li><li> Aspirare media, e fissare le cellule con 4% paraformaldeide (PFA) per 10 minuti a RT. </li><li> Aspirare PFA, e lavare 3 x 10 minuti con 0,5 ml di PBS per ogni camera. </li><li> Permeabilize e cellule blocco con 0,5% Triton X-100 e 5% di siero normale di capra (NGS) in PBS a temperatura ambiente per 1 ora. </li><li> Incubare con anticorpi primari in 0,1% Triton X-100 e 5% in PBS NGS su agitatore a 4 ° C durante la notte. Diluire topo monoclonale anti-NF90 anticorpi e policlonale di coniglio anti-RBM3 anticorpi 1: 100 in PBS per doppia colorazione. Per il controllo negativo, omettere indipendentemente uno dei due anticorpi primari, e omettere entrambi gli anticorpi in un terzo controllo. NOTA: non utilizzare il blocco commerciale e reagenti diluizione. </li><li> Lavare 3 x 10 minuti con 0,5 ml di PBS per camera. </li><li> Con riserva di immunocitochimica o di prossimità protocolli di analisi legatura <ol><li> immunocitochimica <ol><li> Incubare con 1: 500 diluito verde colorante fluorescente accoppiati anti-topo e fluorescenti anti-coniglio anticorpi secondari rossi dye-accoppiato a temperatura ambiente per 1 ora. Evitare la luce da questo punto in poi. </li><li> nuclei di contrasto con 4 &#39;, 6-diamidin-2-phenylindol (DAPI) diluito 1: 5000 in PBS a temperatura ambiente per 10 min. </li><li> Lavare 3 x 10 minuti con 0,5 ml di PBS per camera. </li><li> Rimuovere le camere del vetrino e asciutta. Montare con 250 μ, medio per vetrino di montaggio. </li></ol></li><li> test legatura di prossimità <ol><li> Preparare prossimità sonde test legatura. Mescolare e diluire due sonde di prossimità test legatura (anti-topo e anti-coniglio anticorpi secondari allegati con diversi oligonucleotidi che possono legare °ruvida aggiunta di altre due oligonucleotidi in soluzione legatura) sia 1: 5 in 0,1% Triton X-100 e 5% NGS in PBS, con un volume totale di 320 microlitri per una slitta 8-camera (circa 40 microlitri per cm 2) . Incubare a temperatura ambiente per 20 min. </li><li> Rimuovere le camere dal vetrino e aggiungere le sonde diluito. Incubare in un incubatore di umidità a 37 ° C per 1 ora. </li><li> Preparare la soluzione legatura. Mescolare 8 ml ligasi, 64 ml 5 x legatura magazzino e 248 ml H 2 O. </li><li> Preleva il liquido dalla diapositiva, e lavare 2 x 5 min in 1x tampone di lavaggio A (fornito con il kit). </li><li> Aggiungere la soluzione legatura e incubare in un incubatore di umidità a 37 ° C per 30 min. </li><li> Preparare la soluzione di amplificazione. Mix 4 microlitri polimerasi, 64 ml 5x amplificazione magazzino e 252 ml di H 2 O. Evitare la luce da questo punto in poi. </li><li> Toccare il liquido dalla diapositiva, e lavare 2 x 2 min in 1x tampone di lavaggio A. </li><li> Aggiungere l&#39;amplificatoresoluzione lification e incubare in un incubatore umidità buio a 37 ° C per 100 min. </li><li> Preleva il liquido dalla diapositiva, e lavare 2 x 10 min in 1x tampone di lavaggio B (fornito con il kit). Lavare per 1 min a 0,01X tampone di lavaggio B. </li><li> Asciugare il vetrino e montare con 250 microlitri di un mezzo di montaggio commerciale (con DAPI) per vetrino. </li></ol></li></ol></li><li> Esaminare segnali fluorescenti sotto un microscopio utilizzando una lente oculare 10X e 20X lente obiettivo. Acquisire le immagini da una telecamera CCD. </li></ol>

<ol><li>Patiño, C., Haenni, A. L., Urcuqui-Inchima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF90+isoforms%2C+a+new+family+of+cellular+proteins+involved+in+viral+replication%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">NF90 isoforms, a new family of cellular proteins involved in viral replication?</a> Biochimie. 108, 20-24 (2015).</li>
<li>Shim, J., Lim, H., R Yates, J., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+export+of+NF90+is+required+for+interleukin-2+mRNA+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Nuclear export of NF90 is required for interleukin-2 mRNA stabilization.</a> Mol Cell. 10 (6), 1331-1344 (2002).</li>
<li>Sakamoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NF90-NF45+complex+functions+as+a+negative+regulator+in+the+microRNA+processing+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The NF90-NF45 complex functions as a negative regulator in the microRNA processing pathway.</a> Mol Cell Biol. 29 (13), 3754-3769 (2009).</li>
<li>Dresios, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold+stress-induced+protein+Rbm3+binds+60S+ribosomal+subunits%2C+alters+microRNA+levels%2C+and+enhances+global+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Cold stress-induced protein Rbm3 binds 60S ribosomal subunits, alters microRNA levels, and enhances global protein synthesis.</a> Proc Natl Acad Sci. 102 (6), 1865-1870 (2005).</li>
<li>Danno, S., Itoh, K., Matsuda, T., Fujita, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+expression+of+mouse+Rbm3%2C+a+cold-shock+protein%2C+in+Sertoli+cells+of+cryptorchid+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Decreased expression of mouse Rbm3, a cold-shock protein, in Sertoli cells of cryptorchid testis.</a> Am J Pathol. 156 (5), 1685-1692 (2000).</li>
<li>Wellmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen-regulated+expression+of+the+RNA-binding+proteins+RBM3+and+CIRP+by+a+HIF-1-independent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Oxygen-regulated expression of the RNA-binding proteins RBM3 and CIRP by a HIF-1-independent mechanism.</a> J Cell Sci. 117 (Pt 9), 1785-1794 (2004).</li>
<li>Zhu, X., Zelmer, A., Kapfhammer, J. P., Wellmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold-inducible+RBM3+inhibits+PERK+phosphorylation+through+cooperation+with+NF90+to+protect+cells+from+endoplasmic+reticulum+stress%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Cold-inducible RBM3 inhibits PERK phosphorylation through cooperation with NF90 to protect cells from endoplasmic reticulum stress.</a> FASEB J. 30 (2), 624-634 (2016).</li>
<li>Fields, S., Song, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+genetic+system+to+detect+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A novel genetic system to detect protein-protein interactions.</a> Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).</li>
<li>Verhelst, J., De Vlieger, D., Saelens, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-immunoprecipitation+of+the+Mouse+Mx1+Protein+with+the+Influenza+A+Virus+Nucleoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein.</a> J Vis Exp. (98), (2015).</li>
<li>Söderberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nat Methods. 3 (12), 995-1000 (2007).</li>
<li>Jarvius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+detection+of+phosphorylated+platelet-derived+growth+factor+receptor+beta+using+a+generalized+proximity+ligation+method%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">In situ detection of phosphorylated platelet-derived growth factor receptor beta using a generalized proximity ligation method.</a> Mol Cell Proteomics. 6 (9), 1500-1509 (2007).</li>
<li>Liu, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein-protein+interactions+in+cross-talk+pathways+reveals+CRKL+protein+as+a+novel+prognostic+marker+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein-protein interactions in cross-talk pathways reveals CRKL protein as a novel prognostic marker in hepatocellular carcinoma.</a> Mol Cell Proteomics. 12 (5), 1335-1349 (2013).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ci sono diversi vantaggi e carenze per entrambi i metodi. Come relativamente nuova tecnica, un evidente vantaggio di dosaggio vicinanza legatura è la possibilità di chiarire le interazioni proteina-proteina a livello di singola cellula, invece di un lotto di cellule eterogenee. Immagini ad alta intensità e la risoluzione (ad esempio con microscopio confocale) prevedono la possibilità per la quantificazione contando macchie fluorescenti singoli. Al contrario, la combinazione convenzionale di tecnica di co-immuno...

Fattore nucleare 90 (NF90) è una proteina multi-isoforma con numerose funzioni, tra cui la risposta all&#39;infezione virale, regolazione di interleuchina-2 post-trascrizione e regolazione dei miRNA biogenesi 1-3. RBM3 è una proteina RNA-binding, coinvolto nella traduzione e miRNA biogenesi e può essere indotta da vari fattori di stress, tra cui l&#39;ipotermia e ipossia 4-6. Recentemente, abbiamo trovato NF90 e RBM3 in un complesso proteico 7. L&#39;interazione di NF90 e RBM3 è essenziale per modulare l&#39;attività della proteina chinasi RNA-like chinasi reticolo endoplasmatico (PERK) in risposta proteina spiegato 7. Sia NF90 e RBM3 si trovano prevalentemente nel nucleo, ma una piccola percentuale di NF90 e navetta RBM3 nel citoplasma e si legano lì gli uni agli altri per funzioni specifiche, ad esempio, per regolare l&#39;attività vantaggio. Pertanto, è importante visualizzare la distribuzione delle interazioni NF90-RBM3 nel compartimento subcellulare, che può indicareloro diversi ruoli nel rispettivo comparto. Decenni fa, lievito due ibridi (Y2H) è stato sviluppato per rilevare l&#39;interazione tra due proteine 8. Tuttavia, a causa della costruzione artificiale di proteine ​​fuse, risultati falsi positivi hanno limitato l&#39;applicazione di questo metodo. Per lungo tempo, co-immunoprecipitazione era la tecnica principale per analizzare le interazioni proteina-proteina, specialmente in condizioni endogene 9. Per analizzare il complesso proteico co-immunoprecipitato, Western blot è la tecnica più conveniente, mentre la spettrometria di massa è usato quando eccellente sensibilità e la precisione sono desiderati. Negli ultimi anni, saggio di prossimità legatura è stato sviluppato come un nuovo metodo per rilevare interazioni proteina-proteina in entrambe le cellule e tessuti in situ 10,11. Qui, abbiamo confrontato il più popolare metodo di co-immunoprecipitazione e relativamente nuovo metodo di analisi di prossimità legatura a catturare NF9Interazione 0-RBM3 in frazioni subcellulari. Abbiamo anche discusso i vantaggi ei limiti di entrambe le tecniche.

<table><tbody><tr><td>L'aquila modificata di Dulbecco' s Medium (DMEM)</td><td>Sigma</td><td>D6429</td><td>Alto glucosio 4.500 mg/L</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina (PenStrep)</td><td>BioConcept</td><td>4-01F00-H</td><td></td></tr><tr><td>NE-PER Reagenti per estrazione nucleare e citoplasmatica</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>78833</td><td></td></tr><tr><td>1,4-Ditiotreitolo (DTT)</td><td>Carl Roth</td><td>6908.3</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G</td><td>Novex, Thermo Fisher Scientific</td><td>10003D</td><td></td></tr><tr><td>DRBP76 (NF90/NF110) anticorpo</td><td>BD Transduction Laboratories</td><td>612154</td><td>utilizzare 1:1.000 per WB e 1:100 per l'anticorpo ICC/PLA</td></tr><tr><td>RBM3</td><td>ProteinTech</td><td>14363-1-AP</td><td>utilizzare 1:1.000 per WB e 1:100 per ICC/PLA</td></tr><tr><td>Lamin A/C anticorpo</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#2032</td><td>usa 1:1.000 per WB&nbsp;</td></tr><tr><td>anticorpo anti-GAPDH</td><td>Abcam</td><td>ab8245</td><td>uso 1:1.000 per WB&nbsp;</td></tr><tr><td>coniglio normale IgG</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2027</td><td></td></tr><tr><td>anti-coniglio IgG, anticorpo secondario legato a HRP</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#7074</td><td>uso 1:5.000 per WB&nbsp;</td></tr><tr><td>anticorpo secondario HRP anti-topo</td><td>Carl Roth</td><td>4759.1</td><td>uso 1:5.000 per WB&nbsp;</td></tr><tr><td>Substrato di blotting ECL occidentale Clarity</td><td>Bio-Rad</td><td>#1705060</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel</td><td>Novex, Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0321BOX</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)</td><td>Novex, Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x)</td><td>Novex, Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0002</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Transfer Buffer (20x)</td><td>Novex, Thermo Fisher Scientific</td><td>NP00061</td><td></td></tr><tr><td>Amersham Hypond P 0.2 Membrana PVDF</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>10600021</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-lisina Vetrino per coltura a 8 pozzetti</td><td>Corning BioCoat</td><td>354632</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide (PFA)</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Siero di capra normale (NGS)</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific PCN5000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-topo di capra (anticorpo H+L), Alexa Fluor 488 coniugato</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11001</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-coniglio di capra (anticorpo H+L), Alexa Fluor 568 coniugato</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11011</td><td></td></tr><tr><td>4&prime;, 6-diamidin-2-fenilindolo (DAPI)</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Duolink PLA sonda Anti-mouse PLUS</td><td>Sigma</td><td>DUO92001</td><td></td></tr><tr><td>Duolink PLA sonda Anti-coniglio MINUS</td><td>Sigma</td><td>DUO92005</td><td></td></tr><tr><td>Reagenti di rilevamento Duolink Rosso</td><td>Sigma</td><td>DUO92008</td><td></td></tr><tr><td>Duolink Tamponi di lavaggio Fluorescenza</td><td>Sigma</td><td>DUO82049</td><td></td></tr><tr><td>Duo Mezzo di montaggio con DAPI</td><td>Sigma</td><td>DUO82040</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma</td><td>81381</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Olympus</td><td>AX-70</td><td></td></tr><tr><td>Telecamera CCD</td><td>SPOT</td><td>Insight 2MP Firewire</td><td></td></tr><tr><td>Pellicola radiografica</td><td>Fujifilm</td><td>Super RX</td><td></td></tr><tr><td>Macchina per l'elaborazione di pellicole</td><td>Fujifilm</td><td>FPM-100A</td><td></td></tr></tbody></table>

visualizzazione di interazione proteina-proteina in nucleare e citoplasmatica frazioni da co-immunoprecipitazione e<em&gt; in situ</em&gt; proximity assay legatura

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Le interazioni proteina-proteina sono coinvolte in migliaia di processi cellulari e avvengono in un contesto spaziale distinto. Tradizionalmente, la co-immunoprecipitazione è una tecnica popolare per rilevare le interazioni proteina-proteina. La successiva analisi Western blot è il metodo più comune per visualizzare le proteine co-immunoprecipitate. Recentemente, il saggio di legatura di prossimità è diventato un potente strumento per visualizzare le interazioni proteina-proteina in situ e offre la possibilità di quantificare le interazioni proteina-proteina con questo metodo. Analogamente all'immunocitochimica convenzionale, anche la tecnica del saggio di ligazione di prossimità si basa sull'accessibilità degli anticorpi primari agli antigeni, ma al contrario, il saggio di ligazione di prossimità rileva le interazioni proteina-proteina con una tecnica unica che coinvolge la PCR a circolo rotante, mentre l'immunocitochimica convenzionale mostra solo la co-localizzazione delle proteine.
Il fattore nucleare 90 (NF90) e la proteina 3 del motivo legante l'RNA (RBM3) sono stati precedentemente dimostrati come partner interagenti. Sono prevalentemente localizzati nel nucleo, ma migrano anche nel citoplasma e regolano le vie di segnalazione nel compartimento citoplasmatico. Qui, abbiamo confrontato l'interazione NF90-RBM3 sia nel nucleo che nel citoplasma mediante co-immunoprecipitazione e saggio di legatura di prossimità. Inoltre, abbiamo discusso i vantaggi e i limiti di queste due tecniche nella visualizzazione delle interazioni proteina-proteina rispetto alla distribuzione spaziale e alle proprietà delle interazioni proteina-proteina.

Figura 1 dimostra che NF90 e RBM3 sono entrambe le proteine nucleari e solo una piccola frazione è presente nel citoplasma. In particolare, ci sono tre diverse bande colorate positivo per RBM3. Il più piccolo appena al di sotto del 20 kDa riflette la dimensione corretta del RBM3 (il peso molecolare previsto di RBM3 è di 17 kDa). L&#39;origine delle altre due bande resta ancora da esplorare. esperimenti di co-immunoprecipitazione con RBM3 come la proteina esca hanno rivel...

Le interazioni proteina-proteina possono verificarsi sia nel nucleo che nel citoplasma di una cellula. Per studiare queste interazioni, vengono applicati la tradizionale co-immunoprecipitazione e il moderno saggio di legatura di prossimità. In questo studio, confrontiamo questi due metodi per visualizzare la distribuzione delle interazioni NF90-RBM3 nel nucleo e nel citoplasma.

Visualizzazione di interazione proteina-proteina in nucleare e citoplasmatica frazioni da Co-immunoprecipitazione e<em&gt; In Situ</em&gt; Proximity Assay legatura

Protein-protein interactions are involved in thousands of cellular processes and occur in distinct spatial context. Traditionally, co-immunoprecipitation ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è confrontare i vantaggi e gli svantaggi dell'immunoprecipitazione congiunta, o co-ip, e del saggio di legatura per prossimità, o pla, nella visualizzazione delle interazioni proteina-proteina in diversi compartimenti cellulari. Il confronto qui presentato tra due metodi differenti può aiutare gli scienziati a decidere quale sia meglio adatto al loro scopo specifico quando si studiano i modelli di distribuzione delle interazioni proteina-proteina nel nucleo e nel citoplasma di una cellula. Il principale vantaggio della co-ip è la capacità di rilevare interazioni proteina-proteina autentiche.Al contrario, il vantaggio del PLA è quello di analizzare le interazioni proteina-proteina a livello cellulare singolo in modo rapido. Dopo aver coltivato e raccolto le cellule HEK293 seguendo il protocollo descritto nel testo, aggiungere a 3 × 10⁶ cellule 300 µL di soluzione fredda per l'estrazione citoplasmatica e vortexare le cellule alla massima velocità per 15 secondi. Incubare l'estratto sul ghiaccio per 30 minuti e, ogni 10 minuti durante l'incubazione, vortexare il campione per cinque secondi.Quindi aggiungere 16,5 µL di soluzione fredda di estrazione citoplasmatica, vortexare per cinque secondi e incubare il campione sul ghiaccio per cinque minuti. Vortexare l'estratto per cinque secondi e centrifugare il campione a 16.000 × g e 4 °C per cinque minuti. Trasferire il soprannatante in un nuovo tubo preraffreddato e mantenerlo sul ghiaccio fino all'uso; quindi utilizzare un millilitro di PBS freddo per lavare i pellet insolubili per tre volte, aspirando e dispensando su e giù, rimuovendo il PBS dopo ogni lavaggio.Successivamente, aggiungere 150 microlitri di soluzione fredda di estrazione nucleare, vortexare per 15 secondi e incubare sul ghiaccio per un'ora. Ogni 10 minuti durante l'incubazione, vortexare il campione per 15 secondi ed utilizzare una punta da 200 microlitri per pipettare la soluzione 10 volte. Vortexare il tubo per 15 secondi e centrifugare il campione a 16.000 x g a 4 gradi Celsius per 10 minuti, quindi trasferire il soprannatante contenente l'estratto nucleare in un nuovo tubo preraffreddato e mantenerlo sul ghiaccio fino all'uso.Rimuovere il 10% del volume di ciascun estratto nucleare e citoplasmatico come campioni di input, quindi aggiungere PBS freddo ai restanti estratti fino a un volume finale di un millilitro. Mantenere in ghiaccio fino all'uso. Dopo aver eseguito la pre-pulizia, se necessario, delle perle magnetiche coniugate con proteina G, combinare 40 microlitri di perle magnetiche coniugate con proteina G con quattro microgrammi di anticorpo policlonale anti-RBM3 rapido, oppure con anticorpo IgG rapido come controllo negativo, in 200 microlitri di PBST.Incubare fino a temperatura ambiente su un agitatore rotante per 40 minuti. Posizionare le provette su un supporto magnetico, quindi rimuovere e scartare il soprannatante. Successivamente, lavare i campioni una volta con 200 microlitri di PBST.Aggiungere un millilitro di lisati diluiti alle perle e incubare su un agitatore rotante a quattro gradi Celsius durante la notte. Il giorno seguente, posizionare i tubi sul supporto magnetico ed aspirare il sopranatante. Aggiungere 0,5 millilitri di PBST alle perle e lavarle tre volte su un agitatore rotante a quattro gradi Celsius, con una velocità fissa di 20 giri al minuto per 10 minuti.Eluire la proteina dalle perle aggiungendo 40 microlitri di buffer per campione, quindi riscaldare il campione a 70 gradi Celsius per 10 minuti. Dopo aver centrifugato le perle, trasferire il liquido in un nuovo tubo da 1,5 millilitri. Per eseguire la chimica immunocitica, seminare le cellule HEK293 a 1,5 volte 10 alla quattro cellule per camera su un vetrino con otto camere rivestito di polilisina.In 0,4 millilitri di DMEM integrato con 10%FPS e 100 unità per millilitro di penstrep. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 48 ore, quindi aspirare il mezzo e utilizzare PFA al 4% per fissare le cellule a temperatura ambiente per 10 minuti in una cappa a flusso laminare. Successivamente, aspirare il PFA e utilizzare 0,5 millilitri di PBS per pozzetto per lavare le cellule tre volte.Aggiungere 0,5% di Triton X100 con 5% di NGS e PBS per permeabilizzare e bloccare le cellule, quindi incubare a temperatura ambiente per un'ora. Successivamente, dopo aver diluito gli anticorpi primari monoclonale anti-NF90 e policlonale anti-RBM3 in rapporto 1:100, aggiungere gli anticorpi primari alle pozzette e incubare sulla piastra agitatrice a quattro gradi Celsius durante la notte. Il giorno seguente, utilizzare 0,5 millilitri di PBS per lavare le camere tre volte, per 10 minuti ciascuna.Per eseguire la chimica immunocitica, aggiungere alle cellule una diluizione da uno a 500 di anticorpi antitopo coniugati con colorante fluorescente verde e anticorpi anticoniglio coniugati con colorante fluorescente rosso, quindi incubare a temperatura ambiente per un'ora. Aggiungere una diluizione da uno a 5.000 di DAPHE NBPS per la controcolorazione dei nuclei e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti, quindi lavare i campioni con PBS come in precedenza. Rimuovere le camere dal vetrino di vetro ed essiccarle, prima di montarle utilizzando 250 microlitri di mezzo di montaggio per ogni vetrino.Per preparare le sonde per il saggio di legame per prossimità in provetta, dopo aver incubato le cellule e gli anticorpi primari e aver effettuato il lavaggio come appena dimostrato, diluire le sonde pronte all'uso uno a cinque in 0,1% Triton X-100, 5% NGS e PBS, per un volume totale di 320 microlitri per una lamella a otto camere. Incubare la soluzione a temperatura ambiente per 20 minuti. Rimuovere le camere dal lato in vetro e aggiungere le sonde diluite, quindi incubare le camere in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius per un'ora.Preparare una soluzione di ligazione mescolando otto microlitri di ligasi, 64 microlitri di tampone di ligazione 5x e 248 microlitri di acqua. Rimuovere il liquido dal vetrino e lavare i campioni due volte con il tampone di lavaggio A oneX, per cinque minuti ciascuna. Aggiungere la soluzione di ligazione ai campioni e incubarli in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius per 30 minuti.Preparare la soluzione di amplificazione mescolando quattro microlitri di polimerasi, 64 microlitri di soluzione madre 5x per l'amplificazione e 252 microlitri di acqua, quindi avvolgere il tubo nella stagnola per proteggerlo dalla luce. Successivamente, rimuovere il liquido dal vetrino e lavare i campioni due volte con un volume x di tampone di lavaggio A, per due minuti ciascuna. Aggiungere la soluzione di amplificazione ai campioni e incubare a 37 gradi Celsius in un'incubatrice umida al buio per 100 minuti.Quindi, dopo aver eliminato il liquido come in precedenza, lavare i campioni due volte per 10 minuti ciascuno in tampone di lavaggio B, prima di lavarli una volta in tampone di lavaggio B 0,1 x. Infine, asciugare il vetrino e montare i campioni con 250 microlitri di un mezzo di montaggio commerciale contenente DAPHE, osservare la fluorescenza al microscopio ed acquisire le immagini con una camera CCD. Esperimenti di co-immunoprecipitazione con RBM3 come proteina esca hanno rivelato che le interazioni NF90-RBM3 sono presenti principalmente nel nucleo, mentre una minoranza si trova nel citoplasma. In questo esperimento di immunofluorescenza, sia NF90 che RBM3 sono visibili nel nucleo.Entrambe le proteine sono presenti anche nel citoplasma in C2 e mostrano una perfetta codistribuzione in ciascun compartimento. Come si osserva in queste immagini, il saggio di legatura per prossimità ha rivelato il modello di interazioni tra NF90 e RBM3, molto simile a quello della comune immunoistochimica convenzionale, con la maggior parte delle interazioni localizzate nel nucleo nella maggioranza delle cellule. Solo una piccola proporzione di cellule ha mostrato una distribuzione prevalentemente citoplasmatica delle interazioni tra NF90 e RBM3.Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare che, sebbene più comoda, la PLA non riflette direttamente le interazioni tra proteine. Al contrario, la co-ip rileva interazioni dirette. Inoltre, la specificità dell'anticorpo primario determina la qualità del risultato.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come scegliere un metodo appropriato per studiare le interazioni proteina-proteina in diversi compartimenti cellulari in base al tuo scopo sperimentale.

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