Name: Unicellulare profili di espressione genica Utilizzando FACS e qPCR con standard interni (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: Impara a quantificare l'espressione genica in singole cellule mammifere utilizzando FACS e qPCR microfluidica con standard interni. Questo metodo offre una stima accurata dei trascritti assoluti per studi di biologia cellulare.

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Vorremmo ringraziare V. Kapoor nel RCC ETIB Citometria a flusso core per il suo aiuto nello svolgere l&#39;ordinamento delle cellule durante lo sviluppo di questo protocollo. Ringraziamo anche M. Raffeld e l&#39;Unità CCR LP diagnostica molecolare e J. Zhu e l&#39;NHLBI sequenziamento del DNA e Genomica core per il loro aiuto nello svolgimento della qPCR durante lo sviluppo di questo protocollo. Questa ricerca è stata sostenuta dal Programma intramurale del NIH.

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Abbiamo presentato un metodo per isolare le singole cellule di mammifero da una popolazione di cellule aderenti in coltura e per saggiare l&#39;espressione di circa 96 geni in ogni cellula. Una buona preparazione anticipo è fondamentale per questo metodo di lavorare bene. In particolare, progettazione e collaudo di primer coppie specifiche per le trascrizioni di interesse (passi 1.2-1.3) sono in termini di tempo, ma importanti passi, come primer determinano la qualità delle misurazioni unicellulari. Una volta coppie di ...

Cellule individuali in una popolazione può mostrare risposte molto diverse ad uno stimolo uniforme fisiologica 1, 2, 3, 4. La variazione genetica di cellule in una popolazione è un meccanismo per questa varietà di risposte, ma ci sono anche diversi fattori non genetici che possono aumentare la variabilità delle risposte, anche in una popolazione clonale delle cellule. Ad esempio, i livelli di singole proteine ​​e di altre importanti molecole di segnalazione possono variare su base cella per cella, dando luogo a variazioni nei profili di espressione genica a valle. Inoltre, l&#39;attivazione del gene può avvenire in esplosioni di breve durata di trascrizioni 5, 6, che può essere limitato ad un numero relativamente piccolo di trascrizioni per raffica 7, 8, 9. Comestocasticità in attivazione del gene può contribuire notevolmente alla variabilità nelle risposte biologiche e in grado di fornire un vantaggio selettivo nei microrganismi 10 e in cellule di mammifero 1, 2 risponde a uno stimolo fisiologico. Grazie alle due fonti genetiche e non genetiche di variazione, il profilo di espressione genica di una data cella in risposta ad uno stimolo può differire notevolmente dal profilo medio espressione genica ottenuti dalla misurazione della risposta bulk. Determinare la misura in cui le singole celle mostrano variabilità in risposta ad uno stimolo richiede tecniche per l&#39;isolamento di singole cellule, la misurazione dei livelli di espressione di trascritti di interesse, e l&#39;analisi computazionale dei dati di espressione risultanti. Ci sono diversi approcci per saggiare l&#39;espressione genica in cellule singole, che coprono una vasta gamma di costi, il numero di trascrizioni sondato, ela precisione di quantificazione. Ad esempio, monocellulari RNA-Seq offre un&#39;ampia profondità di copertura trascrizione e la capacità di quantificare migliaia di trascritti distinti per i geni più altamente espresso in singole cellule; Tuttavia, il costo associato con tale profondità sequenziamento può essere proibitivo, anche se i costi continuano a diminuire. Al contrario, una sola molecola di RNA ibridazione in situ fluorescente (FISH smRNA) offre una precisa quantificazione di trascritti per anche a bassa espressione dei geni ad un costo ragionevole per ogni gene di interesse; Tuttavia, solo un piccolo numero di geni bersaglio può essere analizzato in una data cella da questo approccio. test basati sulla PCR quantitativa, descritti in questo protocollo, forniscono una via di mezzo tra queste tecniche. Questi test impiegano un real-time PCR macchina microfluidica di quantificare fino a 96 trascrizioni di interesse in un momento in un massimo di 96 celle. Mentre ciascuno dei metodi di cui sopra ha costi hardware necessari, il costo di qualsiasi saggio individuale qPCR è relativamenteBasso. Questo protocollo è adattato da quello suggerito da un produttore di un real-time PCR macchina microfluidica (Protocollo di ADP 41, Fluidigm). Per abilitare la stima del numero assoluto di ogni trascritto in un approccio basato sulla PCR, abbiamo ampliato il protocollo di avvalersi di controlli interni di preparati ampliconi gene bersaglio che possono essere utilizzati in più esperimenti. Come esempio di questa tecnica, la quantificazione dell&#39;espressione dei geni regolati dal soppressore del tumore p53 in cellule MCF-7 di carcinoma mammario umano è descritto 11. Le cellule sono sfidati con un agente chimico che induce DNA rotture del doppio filamento. Studi precedenti hanno dimostrato che la risposta p53 al DNA rotture del doppio filamento presenta una grande eterogeneità in singole cellule, sia in termini di livelli di p53 12 e nell&#39;attivazione di distinti geni bersaglio 11. Inoltre, p53 regola l&#39;espressione di oltre 100ben caratterizzato geni bersaglio coinvolti in numerose vie a valle, tra cui l&#39;arresto del ciclo cellulare, apoptosi, e senescenza 13, 14. Poiché la risposta p53-mediata in ogni cella è sia complessa e variabile, l&#39;analisi delle prestazioni del sistema da un approccio in cui quasi 100 geni bersaglio può essere sondata simultaneamente in singole cellule, come quello descritto di seguito. Con lievi modifiche (quali metodi alternativi per isolamento cella singola e lisi), il protocollo può essere facilmente adattato per studiare una vasta gamma di tipi di mammiferi, cellule trascrizioni e risposte cellulari. Con una corretta preparazione anticipata, un giro di smistamento delle cellule e misura l&#39;espressione genica può essere condotta in base a questo protocollo per un periodo di tre giorni. Il seguente tempistica è suggerito: in anticipo, selezionare le trascrizioni di interesse, identificare e convalidare le coppie di primer che amplificano il cDNA da quelli trascrIPTS, e preparare gli standard e le miscele di primer che utilizzano tali primer. Il giorno 1, in seguito al trattamento delle cellule, raccolta e ordinare le celle, eseguire la trascrizione inversa e l&#39;amplificazione target specifico, e trattare i campioni con una esonucleasi per rimuovere primer non incorporati. Il giorno 2, eseguire il controllo di qualità sulle cellule ordinati utilizzando qPCR. Infine, il giorno 3, misurare l&#39;espressione genica nelle cellule ordinati usando microfluidica qPCR. La Figura 1 riassume i passi necessari.

<table><tbody><tr><td>Mini kit RNeasy Plus</td> Kit di trascrizione inversa del cDNA ad alta capacità <td>Qiagen</td><td>74134</td><td></td></tr><tr><td>con inibitore della RNasi</td><td>ThermoFisher</td><td>4374966</td><td></td></tr><tr><td>Phusion DNA polimerasi ad alta fedeltà</td><td>New England BioLabs</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>Kit di estrazione su gel QIAquick</td> Kit per il saggio <td></td><td></td> del dsDNA ad alta sensibilità Qiagen 28704 <td></td></tr><tr><td>Quant-iT</td><td>ThermoFisher</td><td>Q33120&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga a bassa adesione da 2,0 ml</td><td>USA Scientific</td><td>1420-2600</td><td></td></tr><tr><td>Tampone di sospensione del DNA</td><td>Teknova</td><td>T0221</td><td></td></tr><tr><td>Axygen 0,2 ml Maxymum Recovery Provette PCR a parete sottile</td><td>Corning</td><td>PCR-02-LC</td><td></td></tr><tr><td>GE 96.96 Campione di colorante legante il DNA Dynamic Array & Kit di reagenti per il caricamento del test</td><td>Fluidigm</td><td>100-3415</td><td></td></tr><tr><td>HyClone RPMI 1640 media</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30027.01</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino, certificato (USA)</td><td>ThermoFisher</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione antibiotico-antimicotica</td><td>Corning</td><td>30-004-CI</td><td></td></tr><tr><td>Neocarzinostatina</td><td>Sigma</td><td>N9162</td><td></td></tr><tr><td>ELIMINasi</td><td>Decon Labs</td><td>1101</td><td></td></tr><tr><td>SUPERase-In</td><td>ThermoFisher</td><td>AM2696</td><td></td></tr><tr><td>CellsKit qRT-PCR diretto in un solo passaggio</td><td>ThermoFisher</td><td>11753500</td><td></td></tr><tr><td>E. coli DNA</td><td>Affymetrix</td><td>14380 10 MG</td><td></td></tr><tr><td>Pellicola sigillante ThermalSeal, sterile</td><td>Excel Scientific</td><td>STR-THER-PLT</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria IIu</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HyClone Tripsina 0,05%</td><td>GE Healthcare Scienze della vita</td><td>SH30236.01</td><td></td></tr><tr><td>PBS, 1x</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 40 &; m Cell Strainer</td><td>Corning</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Esonucleasi I</td><td>New England BioLabs</td><td>M0293S</td><td></td></tr><tr><td>SsoFast EvaGreen Supermix con basso ROX</td><td>Bio-Rad</td><td>172-5210</td><td></td></tr><tr><td>96.96 Dynamic Array IFC per l'espressione genica (chip qPCR microfluidico)</td><td>Fluidigm</td><td>BMK-M-96.96</td><td></td></tr><tr><td>IFC Controller HX (macchina di caricamento)</td><td>Fluidigm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioMark o BioMark HD (macchina qPCR microfluidica)</td>Software di analisi PCR in tempo reale <td>Fluidigm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Software Fluidigm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

unicellulare profili di espressione genica utilizzando facs e qpcr con standard interni

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Le misurazioni dell'espressione genica da popolazioni di massa di cellule possono oscurare la notevole variazione trascrittomica delle singole cellule all'interno di quelle popolazioni. Le misurazioni dell'espressione genica di una singola cellula possono aiutare a valutare il ruolo del rumore nell'espressione genica, identificare correlazioni nell'espressione di coppie di geni e rivelare sottopopolazioni di cellule che rispondono in modo diverso a uno stimolo. Qui, descriviamo una procedura per misurare l'espressione di un massimo di 96 geni in singole cellule di mammifero isolate da una popolazione in crescita in coltura tissutale. Le cellule vengono smistate nel tampone di lisi mediante smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS) e le specie di mRNA di interesse vengono trascritte e amplificate in modo inverso. L'espressione genica viene quindi misurata utilizzando una macchina microfluidica per PCR in tempo reale, che esegue fino a 96 saggi qPCR su un massimo di 96 campioni alla volta. Descriviamo anche la generazione e l'uso di standard di amplicone PCR per consentire la stima del numero assoluto di ciascun trascritto. Rispetto ad altri metodi di misurazione dell'espressione genica in singole cellule, questo approccio consente la quantificazione di trascritti più distinti rispetto all'RNA FISH a un costo inferiore rispetto all'RNA-Seq.

Una panoramica generale del protocollo è mostrato in Figura 1, compresi i passi per il trattamento della cellula, l&#39;isolamento di singole cellule mediante FACS, la generazione e pre-amplificazione di librerie di cDNA da lisati monocellulari la conferma di librerie di cDNA monocellulari in pozzi ordinati, e la misura dell&#39;espressione genica da qPCR. In preparazione per l&#39;isolamento cella singola e a...

Descriviamo un metodo per ordinare singole cellule di mammifero e quantificare l'espressione di un massimo di 96 geni bersaglio di interesse in ogni cellula. Questo metodo include l'uso di standard qPCR interni per consentire la stima dei conteggi assoluti dei trascritti.

Unicellulare profili di espressione genica Utilizzando FACS e qPCR con standard interni

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare i livelli di mRNA in singole cellule utilizzando qPCR microfluidica con standard interni. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia a singola cellula, come ad esempio se popolazioni cellulari rispondono a uno stimolo in modi caratteristicamente diversi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può misurare l'espressione di un numero maggiore di geni rispetto all'RNA FISH e a un costo inferiore rispetto all'RNA-Seq nelle singole cellule.L'idea per questo metodo è nata quando stavamo esplorando protocolli per misurare l'espressione genica in singole cellule mediante qPCR microfluidica. Volevamo modificare i metodi esistenti per stimare con maggiore precisione il numero assoluto di trascritti diversi nelle singole cellule. A dimostrare la procedura di sorting cellulare sarà William Telford, responsabile della struttura di citometria a flusso utilizzata dal mio laboratorio.Dopo aver generato e purificato gli ampliconi dai geni di interesse secondo il protocollo descritto nel testo, combinare 18 microlitri di ciascun amplicone purificato in un tubo microcentrifuga da 2,0 millilitr

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Singoli profili di espressione delle cellule consente la dettagliata analisi di espressione genica di cellule singole. Noi descrivere i metodi per l'isolamento dei cardiomiociti, e preparare il lisati risultante sia per microarray intero trascrittoma o qPCR di obiettivi specifici.

Cella singola Profiling trascrizionale dei cardiomiociti adulti mouse

Un metodo per l'isolamento di singole cellule retiniche e successiva amplificazione del cDNA è descritto loro. Unicellulari trascrittomica rivela il grado di eterogeneità cellulare presente in un tessuto e scopre nuovi geni marcatori per le popolazioni di cellule rare. Il protocollo di accompagnamento può essere regolato secondo molti tipi cellulari differenti.

Single-cell Profiling dei neuroni retinici maturi e in sviluppo

Descriviamo un protocollo di PCR in tempo reale al profilo microRNA nel fluido cerebrospinale (CSF). Con l'eccezione di protocolli di estrazione di RNA, la procedura può essere estesa a RNA estratto da altri fluidi corporei, cellule coltivate, ei campioni di tessuto.

Liquido cerebrospinale MicroRNA profiling Utilizzando quantitativa Real Time PCR

Singolo gene delle cellule saggio di espressione è necessaria per comprendere eterogeneità di cellule staminali.

Profiling cellule staminali embrionali umane individuale mediante RT-PCR

I cromosomi progettisti del progetto Synthetic Yeast Genome, Sc2.0, possono essere distinti dalle loro controparti native utilizzando un test di genotipizzazione basato su PCR chiamato PCRTagging, che ha un punto finale di presenza/assenza. Qui descriviamo un metodo di rilevamento della PCR in tempo reale ad alto rendimento per la genotipizzazione PCRTag.

Analisi qPCRTag - A High Throughput, Real Time PCR Assay per Sc2.0 genotipizzazione

Questo protocollo descrive un metodo per isolare singole cellule da embrioni di zebrafish, arricchimento per cellule di interesse, catturare cellule di zebrafish in sistemi multiplex a singola cellula basati su microfluidica e valutare l'espressione genica da singole cellule.

Isolamento e caratterizzazione di singole cellule da embrioni di zebrafish

Questo protocollo descrive come valutare l'espressione di una vasta gamma di geni a livello clonale. Single-cell RT-qPCR produce risultati altamente affidabili con una forte sensibilità per le centinaia di campioni e geni.

Unicellulare espressione genica Utilizzando Multiplex RT-qPCR per caratterizzare eterogeneità delle rare popolazioni linfoidi

Alla rinfusa gene espressione misure nube singola cella differenze nelle popolazioni eterogenee delle cellule. Qui, descriviamo un protocollo per analisi di espressione genica e l'indice come unicellulare ordinano di Florescence attivato Cell Sorting (FACS) possa essere combinato per delineare eterogeneità e immunophenotypically caratterizzare popolazioni molecolarmente distinte delle cellule.

Una combinatoria unicellulare approccio per la caratterizzazione molecolare e Immunophenotypic eterogeneità del tronco umano e popolazioni di cellule progenitrici

Questo metodo descrive i passaggi per migliorare la qualità e la quantità dei dati di sequenza che possono essere ottenuti da campioni di RNA incorporati in paraffina fissata alla formalina (FFPE). Descriviamo la metodologia per valutare in modo più accurato la qualità dei campioni di FFPE-RNA, preparare le librerie di sequenziamento e analizzare i dati provenienti da campioni DI FFPE-RNA.

Ottimizzazione per il sequenziamento e l'analisi di campioni FFPE-RNA degradati

L'ibridazione in situ a fluorescenza di RNA a singola molecola (smFISH) è un metodo per quantificare con precisione i livelli e la localizzazione di specifici RNA a livello di singola cellula. Qui riportiamo i nostri protocolli di laboratorio convalidati per l'elaborazione a banco umido, l'imaging e l'analisi delle immagini per la quantificazione di RNA a singola cellula di specifici RNA.

Analisi a singola cellula di alleli trascrizionalmente attivi mediante FISH a singola molecola

Impara a quantificare l'espressione genica in singole cellule mammifere utilizzando FACS e qPCR microfluidica con standard interni. Questo metodo offre una stima accurata dei trascritti assoluti per studi di biologia cellulare.

Unicellulare profili di espressione genica Utilizzando FACS e qPCR con standard interni

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