Name: Unicellulare profili di espressione genica Utilizzando FACS e qPCR con standard interni (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: Impara a quantificare l'espressione genica in singole cellule mammifere utilizzando FACS e qPCR microfluidica con standard interni. Questo metodo offre una stima accurata dei trascritti assoluti per studi di biologia cellulare.

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Vorremmo ringraziare V. Kapoor nel RCC ETIB Citometria a flusso core per il suo aiuto nello svolgere l&#39;ordinamento delle cellule durante lo sviluppo di questo protocollo. Ringraziamo anche M. Raffeld e l&#39;Unità CCR LP diagnostica molecolare e J. Zhu e l&#39;NHLBI sequenziamento del DNA e Genomica core per il loro aiuto nello svolgimento della qPCR durante lo sviluppo di questo protocollo. Questa ricerca è stata sostenuta dal Programma intramurale del NIH.

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<li>Dar, R. D., Razooky, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+burst+frequency+and+burst+size+are+equally+modulated+across+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Transcriptional burst frequency and burst size are equally modulated across the human genome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (43), 17454-17459 (2012).</li>
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<li>Levine, A. J., Oren, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+first+30+years+of+p53%3A+growing+ever+more+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The first 30 years of p53: growing ever more complex.</a> Nat. Rev. Cancer. 9 (10), 749-758 (2009).</li>
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<li>Ronander, E., Bengtsson, D. C., Joergensen, L., Jensen, A. T. R., Arnot, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Single-cell+Gene+Transcription+by+RNA+Fluorescent++In+Situ+Hybridization+%28FISH%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH).</a> J. Vis. Exp. (68), e4073(2012).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Abbiamo presentato un metodo per isolare le singole cellule di mammifero da una popolazione di cellule aderenti in coltura e per saggiare l&#39;espressione di circa 96 geni in ogni cellula. Una buona preparazione anticipo è fondamentale per questo metodo di lavorare bene. In particolare, progettazione e collaudo di primer coppie specifiche per le trascrizioni di interesse (passi 1.2-1.3) sono in termini di tempo, ma importanti passi, come primer determinano la qualità delle misurazioni unicellulari. Una volta coppie di ...

Cellule individuali in una popolazione può mostrare risposte molto diverse ad uno stimolo uniforme fisiologica 1, 2, 3, 4. La variazione genetica di cellule in una popolazione è un meccanismo per questa varietà di risposte, ma ci sono anche diversi fattori non genetici che possono aumentare la variabilità delle risposte, anche in una popolazione clonale delle cellule. Ad esempio, i livelli di singole proteine ​​e di altre importanti molecole di segnalazione possono variare su base cella per cella, dando luogo a variazioni nei profili di espressione genica a valle. Inoltre, l&#39;attivazione del gene può avvenire in esplosioni di breve durata di trascrizioni 5, 6, che può essere limitato ad un numero relativamente piccolo di trascrizioni per raffica 7, 8, 9. Comestocasticità in attivazione del gene può contribuire notevolmente alla variabilità nelle risposte biologiche e in grado di fornire un vantaggio selettivo nei microrganismi 10 e in cellule di mammifero 1, 2 risponde a uno stimolo fisiologico. Grazie alle due fonti genetiche e non genetiche di variazione, il profilo di espressione genica di una data cella in risposta ad uno stimolo può differire notevolmente dal profilo medio espressione genica ottenuti dalla misurazione della risposta bulk. Determinare la misura in cui le singole celle mostrano variabilità in risposta ad uno stimolo richiede tecniche per l&#39;isolamento di singole cellule, la misurazione dei livelli di espressione di trascritti di interesse, e l&#39;analisi computazionale dei dati di espressione risultanti. Ci sono diversi approcci per saggiare l&#39;espressione genica in cellule singole, che coprono una vasta gamma di costi, il numero di trascrizioni sondato, ela precisione di quantificazione. Ad esempio, monocellulari RNA-Seq offre un&#39;ampia profondità di copertura trascrizione e la capacità di quantificare migliaia di trascritti distinti per i geni più altamente espresso in singole cellule; Tuttavia, il costo associato con tale profondità sequenziamento può essere proibitivo, anche se i costi continuano a diminuire. Al contrario, una sola molecola di RNA ibridazione in situ fluorescente (FISH smRNA) offre una precisa quantificazione di trascritti per anche a bassa espressione dei geni ad un costo ragionevole per ogni gene di interesse; Tuttavia, solo un piccolo numero di geni bersaglio può essere analizzato in una data cella da questo approccio. test basati sulla PCR quantitativa, descritti in questo protocollo, forniscono una via di mezzo tra queste tecniche. Questi test impiegano un real-time PCR macchina microfluidica di quantificare fino a 96 trascrizioni di interesse in un momento in un massimo di 96 celle. Mentre ciascuno dei metodi di cui sopra ha costi hardware necessari, il costo di qualsiasi saggio individuale qPCR è relativamenteBasso. Questo protocollo è adattato da quello suggerito da un produttore di un real-time PCR macchina microfluidica (Protocollo di ADP 41, Fluidigm). Per abilitare la stima del numero assoluto di ogni trascritto in un approccio basato sulla PCR, abbiamo ampliato il protocollo di avvalersi di controlli interni di preparati ampliconi gene bersaglio che possono essere utilizzati in più esperimenti. Come esempio di questa tecnica, la quantificazione dell&#39;espressione dei geni regolati dal soppressore del tumore p53 in cellule MCF-7 di carcinoma mammario umano è descritto 11. Le cellule sono sfidati con un agente chimico che induce DNA rotture del doppio filamento. Studi precedenti hanno dimostrato che la risposta p53 al DNA rotture del doppio filamento presenta una grande eterogeneità in singole cellule, sia in termini di livelli di p53 12 e nell&#39;attivazione di distinti geni bersaglio 11. Inoltre, p53 regola l&#39;espressione di oltre 100ben caratterizzato geni bersaglio coinvolti in numerose vie a valle, tra cui l&#39;arresto del ciclo cellulare, apoptosi, e senescenza 13, 14. Poiché la risposta p53-mediata in ogni cella è sia complessa e variabile, l&#39;analisi delle prestazioni del sistema da un approccio in cui quasi 100 geni bersaglio può essere sondata simultaneamente in singole cellule, come quello descritto di seguito. Con lievi modifiche (quali metodi alternativi per isolamento cella singola e lisi), il protocollo può essere facilmente adattato per studiare una vasta gamma di tipi di mammiferi, cellule trascrizioni e risposte cellulari. Con una corretta preparazione anticipata, un giro di smistamento delle cellule e misura l&#39;espressione genica può essere condotta in base a questo protocollo per un periodo di tre giorni. Il seguente tempistica è suggerito: in anticipo, selezionare le trascrizioni di interesse, identificare e convalidare le coppie di primer che amplificano il cDNA da quelli trascrIPTS, e preparare gli standard e le miscele di primer che utilizzano tali primer. Il giorno 1, in seguito al trattamento delle cellule, raccolta e ordinare le celle, eseguire la trascrizione inversa e l&#39;amplificazione target specifico, e trattare i campioni con una esonucleasi per rimuovere primer non incorporati. Il giorno 2, eseguire il controllo di qualità sulle cellule ordinati utilizzando qPCR. Infine, il giorno 3, misurare l&#39;espressione genica nelle cellule ordinati usando microfluidica qPCR. La Figura 1 riassume i passi necessari.

<table><tbody><tr><td>Mini kit RNeasy Plus</td> Kit di trascrizione inversa del cDNA ad alta capacità <td>Qiagen</td><td>74134</td><td></td></tr><tr><td>con inibitore della RNasi</td><td>ThermoFisher</td><td>4374966</td><td></td></tr><tr><td>Phusion DNA polimerasi ad alta fedeltà</td><td>New England BioLabs</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>Kit di estrazione su gel QIAquick</td> Kit per il saggio <td></td><td></td> del dsDNA ad alta sensibilità Qiagen 28704 <td></td></tr><tr><td>Quant-iT</td><td>ThermoFisher</td><td>Q33120&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga a bassa adesione da 2,0 ml</td><td>USA Scientific</td><td>1420-2600</td><td></td></tr><tr><td>Tampone di sospensione del DNA</td><td>Teknova</td><td>T0221</td><td></td></tr><tr><td>Axygen 0,2 ml Maxymum Recovery Provette PCR a parete sottile</td><td>Corning</td><td>PCR-02-LC</td><td></td></tr><tr><td>GE 96.96 Campione di colorante legante il DNA Dynamic Array & Kit di reagenti per il caricamento del test</td><td>Fluidigm</td><td>100-3415</td><td></td></tr><tr><td>HyClone RPMI 1640 media</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30027.01</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino, certificato (USA)</td><td>ThermoFisher</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione antibiotico-antimicotica</td><td>Corning</td><td>30-004-CI</td><td></td></tr><tr><td>Neocarzinostatina</td><td>Sigma</td><td>N9162</td><td></td></tr><tr><td>ELIMINasi</td><td>Decon Labs</td><td>1101</td><td></td></tr><tr><td>SUPERase-In</td><td>ThermoFisher</td><td>AM2696</td><td></td></tr><tr><td>CellsKit qRT-PCR diretto in un solo passaggio</td><td>ThermoFisher</td><td>11753500</td><td></td></tr><tr><td>E. coli DNA</td><td>Affymetrix</td><td>14380 10 MG</td><td></td></tr><tr><td>Pellicola sigillante ThermalSeal, sterile</td><td>Excel Scientific</td><td>STR-THER-PLT</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria IIu</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HyClone Tripsina 0,05%</td><td>GE Healthcare Scienze della vita</td><td>SH30236.01</td><td></td></tr><tr><td>PBS, 1x</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 40 &; m Cell Strainer</td><td>Corning</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Esonucleasi I</td><td>New England BioLabs</td><td>M0293S</td><td></td></tr><tr><td>SsoFast EvaGreen Supermix con basso ROX</td><td>Bio-Rad</td><td>172-5210</td><td></td></tr><tr><td>96.96 Dynamic Array IFC per l'espressione genica (chip qPCR microfluidico)</td><td>Fluidigm</td><td>BMK-M-96.96</td><td></td></tr><tr><td>IFC Controller HX (macchina di caricamento)</td><td>Fluidigm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioMark o BioMark HD (macchina qPCR microfluidica)</td>Software di analisi PCR in tempo reale <td>Fluidigm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Software Fluidigm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

unicellulare profili di espressione genica utilizzando facs e qpcr con standard interni

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Le misurazioni dell'espressione genica da popolazioni di massa di cellule possono oscurare la notevole variazione trascrittomica delle singole cellule all'interno di quelle popolazioni. Le misurazioni dell'espressione genica di una singola cellula possono aiutare a valutare il ruolo del rumore nell'espressione genica, identificare correlazioni nell'espressione di coppie di geni e rivelare sottopopolazioni di cellule che rispondono in modo diverso a uno stimolo. Qui, descriviamo una procedura per misurare l'espressione di un massimo di 96 geni in singole cellule di mammifero isolate da una popolazione in crescita in coltura tissutale. Le cellule vengono smistate nel tampone di lisi mediante smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS) e le specie di mRNA di interesse vengono trascritte e amplificate in modo inverso. L'espressione genica viene quindi misurata utilizzando una macchina microfluidica per PCR in tempo reale, che esegue fino a 96 saggi qPCR su un massimo di 96 campioni alla volta. Descriviamo anche la generazione e l'uso di standard di amplicone PCR per consentire la stima del numero assoluto di ciascun trascritto. Rispetto ad altri metodi di misurazione dell'espressione genica in singole cellule, questo approccio consente la quantificazione di trascritti più distinti rispetto all'RNA FISH a un costo inferiore rispetto all'RNA-Seq.

Una panoramica generale del protocollo è mostrato in Figura 1, compresi i passi per il trattamento della cellula, l&#39;isolamento di singole cellule mediante FACS, la generazione e pre-amplificazione di librerie di cDNA da lisati monocellulari la conferma di librerie di cDNA monocellulari in pozzi ordinati, e la misura dell&#39;espressione genica da qPCR. In preparazione per l&#39;isolamento cella singola e a...

Descriviamo un metodo per ordinare singole cellule di mammifero e quantificare l'espressione di un massimo di 96 geni bersaglio di interesse in ogni cellula. Questo metodo include l'uso di standard qPCR interni per consentire la stima dei conteggi assoluti dei trascritti.

Unicellulare profili di espressione genica Utilizzando FACS e qPCR con standard interni

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare i livelli di mRNA in singole cellule utilizzando qPCR microfluidica con standard interni. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia a singola cellula, come ad esempio se popolazioni cellulari rispondono a uno stimolo in modi caratteristicamente diversi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può misurare l'espressione di un numero maggiore di geni rispetto all'RNA FISH e a un costo inferiore rispetto all'RNA-Seq nelle singole cellule.L'idea per questo metodo è nata quando stavamo esplorando protocolli per misurare l'espressione genica in singole cellule mediante qPCR microfluidica. Volevamo modificare i metodi esistenti per stimare con maggiore precisione il numero assoluto di trascritti diversi nelle singole cellule. A dimostrare la procedura di sorting cellulare sarà William Telford, responsabile della struttura di citometria a flusso utilizzata dal mio laboratorio.Dopo aver generato e purificato gli ampliconi dai geni di interesse secondo il protocollo descritto nel testo, combinare 18 microlitri di ciascun amplicone purificato in un tubo microcentrifuga da 2,0 millilitri a bassa adesione, quindi aggiungere tampone di sospensione del DNA fino a raggiungere un volume totale di 1.800 microlitri, in modo che la concentrazione di ciascun amplicone sia pari a cinque volte 10 alla sesta molecole per microlitro. Vortexare accuratamente lo standard 5e6 e suddividerlo in aliquote da 20 microlitri in provette PCR a bassa adesione. Dopo aver seminato le cellule MCF7 p53-Venus secondo il protocollo descritto nel testo, aggiungere 400 nanogrammi per millilitro di neocarzinostatina alle cellule e trattarle per 3, 8,5, 14 o 24 ore.Per preparare il buffer di lisi, combinare i reagenti elencati in questa tabella. Trasferire 92,4 microlitri del buffer in un tubo separato da utilizzare come buffer di lisi per gli standard di amplificone. Il buffer di lisi rimanente sarà destinato alle cellule.Preparare e aggiungere il DNA di E.coli al buffer di lisi per le cellule, come indicato nel protocollo scritto. Per preparare gli standard, etichettare sei provette da centrifuga a bassa adesione. Aggiungere 90 microlitri di buffer di sospensione del DNA al tubo 5e5.Aggiungere 90 microlitri di tampone contenente 6,2 picogrammi per microlitro di DNA di E.coli in ciascuna delle altre cinque provette e mantenere tutte le provette sul ghiaccio. Dopo aver prelevato un'aliquote di standard 5e6 dallo stoccaggio, vortexare brevemente la provetta, quindi centrifugarla per assicurarsi che il liquido sia in fondo alla provetta; successivamente, utilizzando una punta pipetta a bassa adesione, aggiungere 10 microlitri di standard 5e6 nella provetta 5e5. Vortexare, centrifugare e rimettere la provetta sul ghiaccio.Successivamente, pipettare 10 microlitri dal tubo 5e5 nel tubo 5e4, quindi vortexare brevemente il tubo, centrifugarlo e riporlo sul ghiaccio. Ripetere le diluizioni seriali con ogni tubo, aggiungendo 10 microlitri dal tubo precedente, fino a quando tutti i tubi non avranno una diluizione standard. Dopo aver preparato i tubi PCR con tampone di lisi, utilizzando una pipetta a 12 canali, distribuire nove microlitri di tampone di lisi cellulare dalla fila di tubi PCR in ciascun pozzetto delle prime sette file di una piastra PCR.Distribuire sette microlitri di tampone di lisi standard in ogni pozzetto dell'ultima riga della piastra, quindi, utilizzando punte da pipetta a bassa adesione, aggiungere due microlitri di standard in ogni pozzetto della riga inferiore secondo la mappa della piastra. Aggiungere due microlitri di 3,1 picogrammi per microlitro di DNA di E.coli nei pozzetti da 10 cellule e 100 cellule, quindi aggiungere due microlitri di 6,2 picogrammi per microlitro di DNA di E.coli nei pozzetti senza cellule. Dopo aver programmato l'ordinatore cellulare attivato da fluorescenza per effettuare l'ordinamento in una piastra a 96 pozzetti secondo la mappa della piastra, per mirare correttamente lo strumento, sigillare una piastra PCR vuota e utilizzare il flusso di prova per ordinare goccioline e PBS sul sigillo della piastra vuota.Se le goccioline non cadono nella posizione corretta, rimuoverle dalla superficie del sigillo, ricampionare il citofluorimetro secondo le istruzioni del produttore dell'apparecchiatura e ripetere finché le goccioline nel flusso di separazione non vengono depositate correttamente. Raccogliere le cellule mediante tripsinizzazione e ri-sospendere in 0,5 millilitri di PBS con 2% di FBS, quindi trasferire in un tubo per citometria a flusso. Per separare le cellule, inserire il tubo con la sospensione cellulare nel citofluorimetro, aprire il sigillo sulla piastra contenente il buffer di lisi e separare con attenzione le cellule di interesse nella piastra seguendo la mappa della piastra.Per garantire che le singole cellule vengano ordinate con la massima purezza, eseguire la macchina in modalità singola cellula e utilizzare il gating standard della citometria a flusso basato sulla diffusione anterograda e laterale. Al termine dell'analisi, utilizzare un nuovo sigillo termico sterile per sigillare la piastra e centrifugarla a 400 ×g a quattro gradi Celsius per un minuto, quindi posizionare la piastra nel termociclatore ed eseguire il programma RT-STA precedentemente preparato. Dopo aver centrifugato la piastra RT-STA completata, utilizzare una pipetta a 12 canali per distribuire 3,6 microlitri di esonucleasi I diluita in ogni pozzetto della piastra.Sigillare la piastra e centrifugare brevemente, quindi posizionare la piastra nel termociclatore ed eseguire il programma per l'eso I. Per misurare l'espressione del gene di controllo in ogni campione, preparare 900 microlitri di mix master qPCR con colorante per il legame al DNA per 96 reazioni, utilizzando primer di uno dei geni di controllo selezionati. Distribuire nove microlitri di mix master in ogni pozzetto di una piastra PCR a 96 pozzetti, quindi aggiungere un microlitro di campione dalla piastra dei campioni al pozzetto corrispondente della piastra PCR.Eseguire la piastra su una macchina PCR in tempo reale utilizzando un protocollo di termociclaggio suggerito dal produttore del master mix o seguendo un protocollo standard, quindi analizzare i campioni e creare una mappa della piastra dei mix dei campioni in base al protocollo descritto. Etichettare una piastra come mix dei campioni e quindi, utilizzando una pipetta a otto canali, distribuire 3,3 microlitri della miscela di master mix e reagente per il caricamento dei campioni in ogni pozzetto di una piastra PCR a 96 pozzetti. Per ogni piastra PCR di campioni, vortexare la piastra per 10 secondi e centrifugarla a 500 ×g per 10 secondi.Rimuovere il coperchio e trasferire 2,7 microlitri di ogni campione positivo di una singola cellula nel pozzetto corrispondente sulla piastra dei mix di campione per i pozzetti di una singola cellula indicati sulla mappa della piastra. Staccare l'adesivo dal fondo di un nuovo chip microfluidico per qPCR, quindi utilizzando una siringa contenente fluido della linea di controllo con il cappuccio ancora posizionato, premere verso il basso ciascuna molla dell'accumulatore per allentarla e iniettare in ogni accumulatore da 100 a 200 microlitri di fluido della linea di controllo. Inserire il chip nella macchina di caricamento ed eseguire lo script di condizionamento, quindi utilizzando una pipetta a otto canali, trasferire 4,5 microlitri di ciascun mix di saggio nel lato sinistro del chip microfluidico per qPCR.È fondamentale evitare la formazione di bolle d'aria nella parte inferiore delle pozzette. Ciò causerebbe problemi di caricamento. Per prevenirlo, appoggiare le punte della pipetta sul lato della pozzetta, quindi pipettare solo fino al primo arresto.Trasferire 4,5 microlitri di ciascuna miscela campione sul lato destro del chip microfluidico per qPCR, quindi inserire il chip nella macchina di caricamento ed eseguire lo script di caricamento della miscela. Al termine dello script di caricamento, verificare che non siano presenti linee attraverso il chip, che indicherebbero un problema di caricamento, quindi utilizzare del nastro per rimuovere con attenzione eventuali particelle di polvere dal chip, inserire il chip nella macchina microfluidica per PCR in tempo reale ed eseguire lo script di raccolta dati. Infine, analizzare i dati secondo il protocollo descritto nel testo.Questa figura mostra i livelli di espressione di un gene di controllo misurati mediante qPCR per determinare quali pozzetti hanno ricevuto una singola cellula. I campioni che hanno ricevuto una cellula presentano bassi valori di CT. I campioni senza cellula hanno valori di CT molto più elevati.I pozzetti per lo standard dell'amplicone devono mostrare curve di amplificazione equidistanti. Deve inoltre esserci una chiara separazione tra le curve dei pozzetti senza cellule, con 10 cellule e con 100 cellule. I campioni di DNA provenienti da cellule effettive vengono selezionati singolarmente da diverse piastre da 96 pozzetti ordinate e combinati in un'unica piastra per la preparazione della qPCR microfluidica.Questa mappa termica riassume i risultati della qPCR microfluidica. La variazione cromatica in ogni colonna mostra la variabilità nell'espressione di ciascun gene tra cellule diverse. Le due righe che sono molto più scure rispetto alle altre rappresentano molto probabilmente campioni difettosi.Quando si esegue questa procedura, è importante mantenere l'area di lavoro priva di RNasi e DNA, specialmente durante la preparazione degli standard e del buffer di lisi. Le fasi precedenti alla PCR di questo protocollo sono sensibili alla contaminazione. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come quantificare l'espressione di più geni di interesse in singole cellule.Dopo aver seguito questa procedura, altri metodi, come la FISH per singole molecole di RNA, possono essere eseguiti per convalidare le misurazioni dell'abbondanza di mRNA in singole cellule.

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