Unicellulare profili di espressione genica Utilizzando FACS e qPCR con standard interni

L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare i livelli di mRNA nelle singole cellule utilizzando la qPCR microfluidica con standard interni. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia delle singole cellule, ad esempio se le popolazioni cellulari di cellule rispondono a uno stimolo in modi caratteristicamente diversi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può misurare l'espressione di più geni rispetto all'RNA FISH a un costo inferiore rispetto all'RNA-Seq in singole cellule.

Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando stavamo esplorando protocolli per misurare l'espressione genica in singole cellule mediante qPCR microfluidica. Volevamo modificare i metodi esistenti per stimare in modo più accurato il numero assoluto di diversi trascritti in singole cellule. A dimostrare la procedura di smistamento cellulare sarà William Telford, il responsabile della struttura di citometria a flusso utilizzata dal mio laboratorio.

Dopo aver generato e purificato gli ampliconi dai geni di interesse secondo il protocollo di testo, combinare 18 microlitri di ciascun amplicone purificato in una provetta per microcentrifuga a basso legame da 2,0 millilitri, quindi aggiungere un tampone di sospensione del DNA fino a 1.800 microlitri in modo che la concentrazione di ciascun amplicone sia cinque volte 10 alla sesta molecola per microlitro. Agitare accuratamente lo standard 5e6 e dividerlo in aliquote da 20 microlitri in provette PCR a basso legame tra loro. Dopo aver piastrato le cellule MCF7 p53-Venus secondo il protocollo di testo, aggiungere 400 nanogrammi per millilitro di neocarzinostatina alle cellule e trattarle per tre, 8,5, 14 o 24 ore.

Per preparare il tampone di lisi, combinare i reagenti elencati in questa tabella. Trasferire 92,4 microlitri di tampone in una provetta separata che funga da tampone di lisi per gli standard di ampliconi. Il tampone di lisi rimanente sarà per le cellule.

Preparare e aggiungere il DNA di E.coli al tampone di lisi per le cellule, come da protocollo di testo. Per preparare gli standard, etichettare sei provette da centrifuga a basso legame. Aggiungere 90 microlitri di tampone di sospensione di DNA alla provetta 5e5.

Aggiungere 90 microlitri di tampone contenente 6,2 picogrammi per microlitro di DNA di E.coli a ciascuna delle altre cinque provette e mantenere tutte le provette in ghiaccio. Dopo aver rimosso un'aliquota di 5e6 standard dal deposito, agitare brevemente la provetta, quindi farla girare per assicurarsi che il liquido si trovi sul fondo della provetta, quindi utilizzando una punta di pipetta a basso legante, aggiungere 10 microlitri di 5e6 standard alla provetta 5e5. Vortice, gira e rimetti il tubo sul ghiaccio.

Quindi, pipettare 10 microlitri dal tubo 5e5 nel tubo 5e4, quindi agitare brevemente il tubo, girarlo e rimettere il tubo sul ghiaccio. Ripetere le diluizioni seriali con ogni provetta, ricevendo 10 microlitri dalla provetta precedente fino a quando tutte le provette hanno una diluizione dello standard. Dopo aver preparato le provette per PCR con tampone di lisi, utilizzando una pipetta a 12 canali, distribuire nove microlitri di tampone di lisi cellulare dalla fila di provette per PCR in ciascun pozzetto delle prime sette file di una piastra per PCR.

Distribuire sette microlitri di tampone di lisi standard su ciascun pozzetto dell'ultima fila della piastra, quindi utilizzando puntali per pipette a basso legame, aggiungere due microlitri di standard a ciascun pozzetto della fila inferiore secondo la mappa della piastra. Aggiungere due microlitri di 3,1 picogrammi per microlitro di DNA di E.coli nei pozzetti di 10 cellule e 100 cellule, quindi aggiungere due microlitri di 6,2 picogrammi per microlitro di DNA di E.coli nei pozzetti senza cellule. Dopo aver programmato la selezionatrice cellulare attivata a fluorescenza per smistare in una piastra a 96 pozzetti in base alla mappa delle piastre, per puntare la macchina, sigillare una piastra PCR vuota e utilizzare il flusso di test per smistare goccioline e PBS sulla guarnizione della piastra vuota.

Se le goccioline non atterrano nella posizione corretta, rimuoverle dalla superficie della guarnizione, ricalibrare la selezionatrice di celle secondo le istruzioni del produttore della macchina e ripetere l'operazione fino a quando le goccioline nel flusso di smistamento non si sono depositate correttamente. Raccogliere le cellule mediante tripsinizzazione e ri-sospenderle in 0,5 millilitri di PBS con il 2% di FBS, quindi trasferirle in una provetta per citometria a flusso. Per selezionare le cellule, inserire la provetta con la sospensione cellulare nel selezionatore cellulare, aprire il sigillo sulla piastra del tampone di lisi e ordinare con cura le cellule di interesse nella piastra in base alla mappa della piastra.

Per garantire che le singole cellule siano ordinate alla massima purezza, far funzionare la macchina in modalità a cella singola e utilizzare il gating standard per citometria a flusso basato sulla dispersione diretta e laterale. Dopo la seduta, utilizzare un nuovo sigillo termico sterile per sigillare la piastra e centrifugarla a 400 volte g per quattro gradi Celsius per un minuto, quindi posizionare la piastra nel termociclatore ed eseguire il programma RT-STA precedentemente preparato. Dopo aver fatto girare la piastra RT-STA completata, utilizzare una pipetta a 12 canali per distribuire 3,6 microlitri di esonucleasi I diluita in ciascun pozzetto della piastra.

Sigillare e far girare brevemente la piastra, quindi posizionare la piastra nel termociclatore ed eseguire il programma exo I. Per misurare l'espressione genica di housekeeping in ciascun campione, preparare 900 microlitri di master mix qPCR di colorante legante il DNA per 96 reazioni utilizzando i primer di uno dei geni housekeeping selezionati. Distribuire nove microlitri di master mix in ogni pozzetto di una piastra PCR a 96 pozzetti, quindi aggiungere un microlitro di campione dalla piastra del campione al pozzetto corrispondente della piastra PCR.

Eseguire la piastra su una macchina PCR in tempo reale utilizzando un protocollo di ciclo termico suggerito dal produttore della miscela master o seguendo un protocollo standard, quindi analizzare i campioni e creare una mappa della piastra delle miscele campione secondo il protocollo di testo. Etichettare una piastra in cui il campione viene miscelato e quindi, utilizzando una pipetta a otto canali, distribuire 3,3 microlitri di miscela di reagenti per il caricamento del campione master mix in ciascun pozzetto di una piastra PCR a 96 pozzetti. Per ogni piastra PCR di campioni, agitare la piastra per 10 secondi e farla girare a 500 volte g per 10 secondi.

Rimuovere il coperchio e trasferire 2,7 microlitri di ogni campione positivo di una cellula nel pozzetto corrispondente sulla piastra di miscelazione del campione per i pozzetti di una cella indicati sulla mappa della piastra. Staccare l'adesivo dalla parte inferiore di un nuovo chip qPCR microfluidico, quindi utilizzando una siringa di fluido della linea di controllo con il tappo ancora inserito, spingere verso il basso ciascuna molla dell'accumulatore per allentarla e iniettare ogni accumulatore con 100-200 microlitri di fluido della linea di controllo. Inserire il chip nella macchina di caricamento ed eseguire lo script prime, quindi utilizzando una pipetta a otto canali, trasferire 4,5 microlitri di ciascuna miscela di saggio sul lato sinistro del chip qPCR microfluidico.

È fondamentale evitare di creare bolle d'aria sul fondo dei pozzi. Ciò creerà problemi di caricamento. Per evitare ciò, toccare i puntali della pipetta sul lato del pozzetto, quindi pipettare solo fino al primo arresto.

Trasferire 4,5 microlitri di ciascuna miscela di campioni sul lato destro del chip qPCR microfluidico, quindi inserire il chip nella macchina di caricamento ed eseguire lo script di miscelazione di carico. Al termine dello script di miscelazione del carico, verificare che non vi siano linee sul chip, che indicherebbero un problema di caricamento, quindi utilizzare del nastro adesivo per rimuovere con cura eventuali particelle di polvere dal chip, quindi inserire il chip nella macchina PCR microfluidica in tempo reale ed eseguire lo script di raccolta dati. Infine, analizza i dati secondo il protocollo di testo.

Questa figura mostra i livelli di espressione di un gene di housekeeping misurati mediante qPCR per determinare quali pozzetti hanno ricevuto una singola cellula. I campioni che hanno ricevuto una cellula hanno valori CT bassi. I campioni senza cella hanno valori CT molto più alti.

I pozzetti per lo standard dell'amplicone dovrebbero mostrare curve di amplificazione uniformemente distanziate. Dovrebbe esserci anche una netta separazione nelle curve per i pozzetti no cella, 10 celle e 100 celle. I campioni di DNA dei semi che rappresentano le cellule reali vengono selezionati da più piastre da 96 pozzetti e combinati in un'unica piastra per prepararsi alla qPCR microfluidica.

Questa mappa di calore riassume i risultati della qPCR microfluidica. La variazione di colore in ogni colonna mostra la variabilità nell'espressione di ciascun gene tra cellule diverse. Le due righe che sono molto più scure delle altre molto probabilmente rappresentano campioni scadenti.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante mantenere l'area di lavoro priva di RNasi e DNA, soprattutto quando si preparano gli standard e il tampone di lisi. Le parti pre-PCR di questo protocollo sono sensibili alla contaminazione. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come quantificare l'espressione di più geni di interesse nelle singole cellule.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come l'RNA FISH a singola molecola, per convalidare le misurazioni dell'abbondanza di mRNA in singole cellule.