3D Stem magnetica cellulare Aggregazione e bioreattore maturazione per la cartilagine Regeneration

L'obiettivo generale di questo metodo di aggregazione cellulare magnetica e maturazione dinamica è quello di migliorare la condrogenesi in vitro delle cellule stromali mesenchimali o MSC. L'aggregazione magnetica delle cellule staminali invece della condrogenesi come condensazione cellulare è una fase chiave precoce del processo di rigenerazione della cartilagine. Dopo che le cellule staminali sono state confinate negli scaffold, gli scaffold possono essere spostati nel bioreattore cellulare per valutare la maturazione dinamica delle cellule.

Un importante metodo dinamico può essere applicato ad altri biosistemi come la riparazione muscolare, cardiaca o vascolare. Ma come vedrai, è molto adatto per la rigenerazione della cartilagine. La dimostrazione visiva della semina magnetica delle cellule e la maturazione dinamica delle cellule utilizzando il bioreattore vero e proprio sono fondamentali perché queste due tecniche sono difficili da apprendere solo dalle istruzioni testuali.

Per costruire il dispositivo micromagnetico per la formazione di aggregati, inserire prima una punta magnetica di 750 micrometri di diametro in ogni foro di tre centimetri in una piastra di alluminio spessa sei millimetri e posizionare la piastra su un magnete permanente al neodimio. Per costruire un dispositivo per la semina dell'impalcatura, prima tagliare il polistirene duro in quadrati di 2,4 centimetri quadrati e inserire magneti di tre millimetri di diametro e sei millimetri di lunghezza a uguale distanza su una superficie di 1,6 centimetri quadrati. Quindi posizionare il dispositivo su un magnete permanente al neodimio.

Per marcare le MSC umane, prima coltiva le cellule staminali in un terreno di crescita completo a 37 gradi Celsius al 5% di anidride carbonica fino a quando non sono confluenti al 90%. Aspirare e poi sciacquare le cellule con Serum three RPMI medium senza glutammina e aggiungere 10 millilitri di soluzione di nanoparticelle di ossido di ferro per pallone di coltura da 150 centimetri quadrati per un'incubazione di 30 minuti nell'incubatore di coltura cellulare. Al termine dell'incubazione, sciacquare le cellule per cinque minuti con Serum three RPMI medium senza glutammina per internalizzare le nano particelle ancora attaccate alla membrana plasmatica.

Quindi sostituire l'RPMI in ogni pallone con 25 millilitri di terreno di coltura MSC completo e rimettere le cellule nell'incubatore di coltura cellulare durante la notte. La mattina successiva, staccare le celle magnetiche con otto millilitri di tripsina-EDTA allo 05% per pallone. E raccogliere le cellule dissociate mediante centrifugazione.

Sospendiamo i pellet per il conteggio e posizioniamo una piastra di Petri per colture cellulari da 35 millimetri con fondo di vetro sopra ogni dispositivo magnetico. Per formare magneticamente gli aggregati, aggiungere tre millilitri di terreno condrogenico a ciascuna capsula di Petri e depositare delicatamente non più di otto microlitri di 2,5 volte 10 alla quinta cellula marcata per aggregato. È fondamentale che le cellule non si depositino né troppo lentamente né troppo velocemente.

E né troppo vicino né troppo lontano dal magnetismo. Quando tutti gli aggregati sono stati posizionati, lasciare che gli sferoidi si formino per 20-30 minuti senza disturbi. Quindi trasferire gli aggregati nell'incubatore per colture cellulari.

Lo stesso giorno, formare aggregati centrifugando 2,5 volte 10 al 5° cellule staminali marcate in provette coniche da 15 millilitri con 1,5 millilitri di terreno condrogenico. Per seminare magneticamente gli scafffold, posizionare uno scaffold poroso polisaccaridico pullulano/destrano essiccato per piastra di Petri e diluire 2 volte 10 al 6° cellule marcate in 350 microlitri di terreno condrogenico senza TGFbeta3. Pipettare con cura le cellule sugli scaffold e incubare le strutture a 37 gradi Celsius per consentire la piena penetrazione cellulare.

Dopo cinque minuti, aggiungere delicatamente tre millilitri di terreno condrogenico alla capsula di Petri e rimettere gli scaffold nell'incubatore di coltura cellulare per quattro giorni per consentire alle cellule di migrare attraverso i pori dello scaffold. Lo stesso giorno, seminare anche un'altra serie di scaffold con 2 volte 10 al 6° cellule staminali marcate come dimostrato e incubare le cellule senza il magnete per ottenere scaffold uniformemente seminati come controlli positivi. Per la condrogenesi in scaffold il quinto giorno, rimuovere il dispositivo magnetico da tutti gli scaffold e restituire gli scaffold statici all'incubatore di coltura cellulare fino al giorno 25, cambiando il terreno due volte a settimana.

Per la coltura cellulare dinamica, anche il quinto giorno, tagliare il tubo di silicone alla lunghezza appropriata secondo le istruzioni del produttore e regolare il tubo, la camera di coltura da 500 millilitri, i rotatori a due vie e le gabbie in una stazione di sicurezza microbiologica sterile. Seguendo le istruzioni del produttore, collegare il tubo ai rotatori a due vie nella camera di coltura. Quindi utilizzare una spatola sterile per trasferire con cura due scaffold cellularizzati in ciascuna gabbia.

Quando tutti gli scaffold sono stati trasferiti, inserire le gabbie attraverso gli aghi nel coperchio per evitare che si muovano durante la rotazione. E riempire la camera di coltura con terreno condrogenico. Utilizzare una tecnica antisettica sterile durante la preparazione delle camere per evitare la contaminazione di qualsiasi strumento o impalcatura.

Successivamente inserire le gabbie nella camera e quindi chiudere la camera e accendere la pompa peristaltica per riempire il tubo con mezzo condrogenico ed eliminare le bolle d'aria. Posizionare e fissare la camera piena all'interno del motore del bioreattore e accendere il computer che controlla le rotazioni del braccio e della camera. Quindi applicare una velocità di rotazione di cinque rotazioni al minuto sia al braccio che alla camera e regolare la pompa peristaltica a una portata di 10 rotazioni al minuto per l'alimentazione continua degli scaffold cellularizzati.

Per generare un costrutto aggregato 3D privo di impalcature l'ottavo giorno, avviare la fusione mettendo due aggregati a contatto in mezzo condrogenico per otto dublet. Quindi il giorno 11 unisci due dublette per formare quattro quadruplette e forma la struttura finale il giorno 15 fondendo le quattro quadruple. I tessuti formati dalla fusione magnetica dimostrano un aumento significativo dell'espressione del collagene II rispetto ai pellet ottenuti per centrifugazione.

Con un aumento della tendenza all'espressione aggregante. Per gli scaffold statici cellularizzati e l'aumento dell'espressione di aggreganti e collagene II si osservano quando si utilizza la semina magnetica, rispetto allo scaffold seminato senza forze magnetiche. È interessante notare che l'espressione del collagene II è molto più alta quando la semina magnetica è combinata con la differenziazione dinamica.

L'analisi istologica con il blu di toluidina rivela che la fusione magnetica sequenziale di 16 aggregati mostra un'abbondante deposizione di glicani glucosamine. Inoltre, negli scaffold a semina magnetica, il contenuto di glicani della glucosamina è più elevato quando gli scaffold sono differenziati in un bioreattore rispetto a quando sono coltivati staticamente. Una volta padroneggiata, l'aggregazione delle celle magnetiche può essere completata in due ore se eseguita correttamente.

Quando si tenta questa procedura, è importante ricordarsi di risospendere le cellule marcate nel volume più piccolo possibile per facilitare la formazione dell'aggregato. Dopo la semina magnetica degli scaffold, è possibile eseguire la maturazione dinamica utilizzando il bioreattore vero e proprio per migliorare l'espressione dei nuovi condrociti sintetizzati. Sin dal suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della medicina rigenerativa per esplorare la rigenerazione della cartilagine articolare negli esseri umani.

Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come costruire dispositivi magnetici, etichettare le cellule staminali in aggregati di cellule staminali, seminare magneticamente scaffold e utilizzare un vero bioreattore. Non dimenticare che lavorare con cellule e tessuti umani può essere estremamente pericoloso e che è necessario prendere sempre precauzioni, come indossare guanti, camici e occhiali protettivi.