Name: Estrusione idraulica del midollo spinale e isolamento dei gangli dorsali nei roditori (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Scopri l'estrusione idraulica del midollo spinale per isolare i gangli dorsali nei roditori. Questo metodo rapido riduce i danni tissutali e facilita la ricerca neurobiologica su modelli murini.

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Vorremmo ringraziare David Kiel, Università di Aarhus, per le riprese e il montaggio. Il software VirtualDub è stato utilizzato per l'elaborazione di sequenze video al microscopio. Ringraziamo l'Istituto danese di ricerca di neuroscienze traslazionali - DANDRITE, Nordic EMBL Partnership, per l'accesso alle attrezzature e la Fondazione di ricerca dell'Università di Aarhus, il progetto EU 7FP PAINCAGE, Det Frie Forskningsrad (DFF) e la Fondazione Lundbeck per il finanziamento.

Tutti gli animali sono stati trattati nel pieno rispetto delle normative danesi ed europei. numero di permessi: 2012-15-2934. 1. Preparazione della siringa per idraulica estrusione del midollo spinale <ol><li> Per un ratto adulto, usare una siringa da 10 ml. Per un topo adulto, usare una siringa da 5 ml. Per i cuccioli, usare una siringa da ml 2.5. </li><li> Regolare la punta della pipetta non-filtro universale adatto per 2-200 pipette microlitri tagliando l&#39;estremità più grande della punta della pipetta fino a quando non si inserisce saldamente alla siringa. Posizionare la punta della pipetta rettificato sulla siringa. Per i cuccioli, utilizzare un 23 G o un ago simile invece di un puntale rettificato. </li><li> Aspirare ghiacciata PBS sterile e lasciare la siringa sul ghiaccio fino a nuovo uso. </li></ol> 2. L&#39;eutanasia <ol><li> Non eseguire dislocazione cervicale, in modo da disturbare la vertebre spinali rendendo impossibile l&#39;estrusione. </li><li> Per ratto adulto / mouse, eutanasia usando il gas come CO 2 o isofluRane. Queste sostanze sono dannose. Eseguire l&#39;eutanasia in una cappa aspirante e gestire le sostanze secondo le linee guida dell&#39;istituzione. (ATTENZIONE: CO 2: H280, P410, P403, isoflurano: H361d, P260, P281, P280) <ol><li> Per garantire che il roditore è morto, garantire l&#39;assenza di riflesso pizzicando una zampa con una pinzetta. Decapitare il roditore con grandi forbici. Per i cuccioli, eutanasia per decapitazione. </li></ol></li></ol> 3. Isolamento della colonna vertebrale <ol><li> Spruzzare acqua sul pelo per controllare i capelli. </li><li> Utilizzando un paio di forbici, tagliare aperto il pelo lungo la colonna vertebrale in direzione distale e isolare la colonna vertebrale tagliando su entrambi i lati lungo la colonna vertebrale oltre l&#39;osso pelvico. Tagliare il midollo spinale distalmente all&#39;osso pelvico con un paio di forbici. NOTA: L&#39;asse rostrale-caudale è indicato come l&#39;asse prossimale-distale durante il protocollo. <ol><li> Tagliare la colonna vertebrale con un paio di forbici per evitare il proximal-più distale e la maggior parte delle aree, come questi possono rendere la colonna vertebrale anche S-forma per il successo di estrusione del midollo spinale. Assicurarsi che il midollo spinale è visibile a entrambe le estremità. Se il midollo spinale non è visibile, tagliare la colonna vertebrale con le forbici fino al midollo spinale diventa visibile. </li></ol></li></ol> 4. estrusione idraulica del midollo spinale <ol><li> Collocare un piatto Petri (100 mm di diametro) riempita con PBS sterile su ghiaccio. </li><li> Raddrizzare la colonna vertebrale applicando un indice sulla parte piegata (prossimale porzione più) della colonna vertebrale, raddrizzando così la colonna vertebrale per quanto possibile. <ol><li> Per i cuccioli, evitare di piegare la colonna vertebrale, come le vertebre verrà interrotto il rendering del midollo spinale estrusione impossibile. </li></ol></li><li> Inserire la punta della pipetta (23 G ago per cuccioli, in alternativa, 18 ago G per topi adulti) al distale-più fine della colonna vertebrale. Se inserita correttamente, la punta è stabilizzato nella cavità spinale. </li><li> Assicurarsi che la colonna vertebrale è raddrizzato per quanto possibile. Applicare una pressione costante, ed estrudere il midollo spinale nella capsula di Petri sul ghiaccio. Assicurarsi che il midollo spinale è tenuto umido in ghiaccio con l&#39;in PBS fino a nuovo trattamento. </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55226/55226fig1.jpg" /> Figura 1: midolli spinali rappresentativi. Idraulico estruso midollo spinale. Da sinistra a destra: ratto adulto, topo adulto, mouse cucciolo. ingrandimenti lombare segnati dalla scatola. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55226/55226fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> 5. Identificazione dei gangli dorsali (DRG) <ol><li> Dividere la colonna vertebrale in due parti longitudinali uguali con le forbici e posizionare la colonna vertebrale spaccatura sotto il microscopio. </li><li> Identificare il segmento T13 vertebra dopo<html> localizzare il sito di attacco del distale-più costae sulla colonna vertebrale facendo attenzione a non confondere il costae con le vicine nervi intercostali. I distali-più costae sono attaccati alla parte prossimale del segmento vertebra T13 e T13 DRG si trova distalmente alla vertebra T13 e prossimalmente alla vertebra L1. </li><li> Identificare DRG concomitanti in direzione distale. Per un ratto adulto, DRG concomitanti appaiono bianche con dorsali chiaramente visibili e radici ventrali. Per un topo adulto, DRG concomitanti appaiono bianche con dorsali chiaramente visibili e radici ventrali. Per i cuccioli, DRG concomitanti appaiono come sfere trasparenti. </li></ol><img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/55226/55226fig2.jpg" /> Figura 2: Identificazione DRG nella colonna vertebrale dopo l&#39;estrusione del midollo spinale. La colonna vertebrale è stato suddiviso consentendo la visualizzazione di DRG come indicato dalle frecce. Esemplificato da ratto adulto e pup del mouse.<html> ref = target &quot;http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55226/55226fig2large.jpg&quot; = &quot;_ blank&quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. 6. L&#39;isolamento di DRG <ol><li> Piatti Numero di Petri (30 mm di diametro) in funzione delle DRG specifici da isolati, ad esempio L3, L4, L5. Riempire le capsule di Petri con ghiacciata PBS sterile e disporli sul ghiaccio. </li><li> Utilizzando le forbici micro, tagliare dorsali e ventrali radici più vicino possibile ai DRG come possibile rilasciare loro, evitando di danneggiare i DRG. </li><li> Con la punta delle pinzette chiusi, delicatamente scoop DRG e trasferirli ai corrispondenti piatti numerati Petri. </li></ol><img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55226/55226fig3.jpg" /> Figura 3: Rappresentante isolato DRG. Da sinistra a destra: ratto adulto, topo adulto, mouse cucciolo.&quot;_blank&quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. 7. lavorazione di tessuti per ulteriori analisi <ol><li> Western blotting <ol><li> Isolare l&#39;area tessuto di interesse, ad esempio il midollo spinale lombare allargamento. Se necessario, separare il midollo spinale in lati ipsilaterale e controlaterale e ulteriormente in dorsali e ventrali corna. </li><li> Posizionare il tessuto in tampone di lisi come tampone di lisi TNE (10 mM Tris-base, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP40 in bidistillata H 2 O) contenente opportuni inibitori su ghiaccio. </li><li> Omogeneizzare il tessuto per circa 30 s su ghiaccio con un pestello macinazione meccanica. </li><li> Centrifugare per 15 min a 16.000 xga 4 ° C e utilizzare il supernatante per un&#39;ulteriore elaborazione secondo protocolli standard 5, 6 o mantenere il supernatante a -20 ° C fino all&#39;utilizzo. </li></ol></li><li> RNA-analisi <ol><li> Isolare il tessuto di interesse. </li><li> Porre immediatamente il tessuto in soluzione stabilizzazione RNA per stabilizzare l&#39;RNA per la conservazione. </li><li> Isolare RNA secondo protocolli standard 7. </li><li> Convertire RNA a cDNA ed eseguire qPCR secondo protocolli standard 7. </li></ol></li><li> immunoistochimica <ol><li> Per il tessuto fresco congelato (applicabile al midollo spinale): <ol><li> Preparare la polvere di ghiaccio secco polverizzando cubetti di ghiaccio secco per un importo corrispondente a due cucchiai di polvere. Coprire cubetti di ghiaccio secco in un panno e polverizzare i cubi con un martello. Posizionare lamina d&#39;argento (circa 5 cm x 5 cm) su uno strato di cubetti di ghiaccio secco e coprire la lamina d&#39;argento con polvere di ghiaccio secco. </li><li> Posizionare l&#39;area del midollo spinale selezionato per ulteriori analisi sulla polvere di ghiaccio secco con una pinzetta, lasciarlo snap-freeze, e trasferire il midollo spinale di un tubo di crio. Tenerlo in ghiaccio secco in ogni momento o conservarlo a -80 ° C fino a quando ci ulteriormentee. </li><li> Trasferire il midollo spinale per un criostato (-20 ° C). Se necessario, tagliare il midollo spinale all&#39;interno del criostato. Posizionare il midollo spinale in embedding materiale all&#39;interno del criostato, al fine di allegare al disco di preparato. </li><li> Tagliare il midollo spinale nello spessore desiderato, ad esempio 5 micron, e raccogliere su lastre di vetro. Riscaldare le lastre di vetro con un dito immediatamente precedenti la raccolta dei tessuti per una migliore attacco. Mantenere qualsiasi tessuto rimanente in tubi crioconservazione a -80 ° C fino all&#39;utilizzo. </li><li> Lasciare le sezioni su lastre di vetro all&#39;interno del criostato fino al momento per la post-fissaggio. </li><li> Post-fix sezioni di immersione nel 4% PFA per 10 min a temperatura ambiente. </li><li> Eseguire la colorazione secondo protocolli standard 8. </li></ol></li><li> tessuto fisso per crio sezionamento (applicabile al midollo spinale e DRG) <ol><li> Fissare midollo spinale e DRG in al 4% PFA (2 h per il midollo spinale, 1.5 h per DRG del mouse e 4 ore per DRG di ratto)4 ° C (posto midollo spinale in posizione orizzontale per evitare che si fissa in una posizione piegata). </li><li> Trasferire il tessuto al 25% w / v di saccarosio notte a 4 ° C. Il tessuto può essere memorizzato nel 25% w / v di saccarosio addizionato con poche gocce di azide di sodio al 10% per prevenire la contaminazione microbica a 4 ° C fino all&#39;utilizzo. Se necessario, tagliare il midollo spinale per compensare l&#39;allargamento lombare solo su una tavola di silicone o simile. </li><li> Utilizzando la punta di un tovagliolo di carta, aspirare soluzione di saccarosio in eccesso dal tessuto. </li><li> Riempire una metà dello stampo crio con materiale di incorporamento. Spingere le bolle ai lati dello stampo crio con strumenti come pinzette chiusi. </li><li> Posizionare il tessuto sul materiale embedding usando pinzette ed assicurare l&#39;orientamento del tessuto desiderato. </li><li> Riempire lo stampo crio completamente con materiale di incorporamento e spingere le bolle più lontano dal tessuto possibile (ad esempio utilizzando una pinzetta chiusi). </li><li> Riempire una piastra di Petri (100 mmdi diametro) con 2-metilbutano. Questa sostanza è nociva. Eseguire questo passaggio in una cappa aspirante e gestire la sostanza secondo le linee guida dell&#39;istituto (ATTENZIONE: H224, H304, H336, H411, P210, P280, P273, P301, P331, P304 / P340, P309 / P310). </li><li> Porre la capsula di Petri su uno strato di ghiaccio secco e aggiungere due cubetti di ghiaccio secco al piatto Petri. Mettere lo stampo crio nella scatola di Petri e lasciare che il materiale embedding per congelare completamente. </li><li> Mantenere il tessuto incorporato in ghiaccio secco in ogni momento o a -80 ° C avvolto in Parafilm fino al procedimento. </li><li> Tagliare il tessuto su un criostato (-20 ° C) nello spessore desiderato, ad esempio 5 micron. </li><li> Eseguire la colorazione secondo protocolli standard 8. </li></ol></li><li> tessuto fissato per paraffina-embedding (applicabile al midollo spinale e DRG) <ol><li> Fix midollo spinale e DRG in 4% PFA (2 h per il midollo spinale, 1.5 h per DRG topo e 4 h per DRG di ratto) a 4 ° C (posto midollo spinalein posizione orizzontale per evitare che si fissa in una posizione piegata). </li><li> Trasferire il tessuto al 25% w / v di saccarosio notte a 4 ° C. Il tessuto può essere memorizzato nel 25% w / v di saccarosio addizionato con poche gocce di azide di sodio al 10% per prevenire la contaminazione microbica a 4 ° C fino all&#39;utilizzo. </li><li> Isolare l&#39;area tessuto di interesse, ad esempio il midollo spinale lombare allargamento. </li><li> Riempire una metà stampo embedding con paraffina. </li><li> Raffreddare brevemente stampo embedding posizionandolo sulla zona di raffreddamento della macchina embedding per indurire un po &#39;la paraffina. Ciò consente un migliore posizionamento dei tessuti. </li><li> Posizionare il tessuto nell&#39;orientamento desiderato nello stampo embedding. Riempire lo stampo embedding con paraffina e raffreddare immediatamente. </li><li> Posizionare lo stampo incorporamento paraffina contenente a 4 ° C durante la notte per far indurire completamente e rimuovere il blocco di paraffina contenente il tessuto dallo stampo incorporamento. </li><li> sezioni tagliate ona microtomo nello spessore desiderato, ad esempio 5 micron. </li><li> Eseguire la colorazione secondo protocolli standard 8. </li></ol></li></ol></li></ol>

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<li>Peeraer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+evaluation+of+rat+dorsal+root+ganglion+neurons+as+an+in+vitro+model+for+diabetic+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pain+Res%22%5BJournal%5D)">Pharmacological evaluation of rat dorsal root ganglion neurons as an in vitro model for diabetic neuropathy.</a> J Pain Res. 4, 55-65 (2011).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Se la colonna vertebrale è disturbato, ad esempio mediante dislocazione cervicale, il midollo spinale dividerà durante l&#39;estrusione. Se il midollo spinale non può essere estruso, la colonna spinale può essere leggermente tagliati a entrambe le estremità e il tentativo di estrusione può essere ripetuto. Nel caso sia necessario l&#39;intero midollo spinale per ulteriori analisi, cioè costituito dell&#39;allargamento cervicale e l&#39;allargamento lombare della colonna vertebrale deve essere tagliato solo leggermente. Se è necessario solo il rigonfiamento lombare per ulteriori analisi, il midollo spinale deve essere tagliato secondo la presente protocollo. La colonna vertebrale deve essere raddrizzata con la punta delle dita per facilitare l&#39;estrusione. Il protocollo è applicabile ai roditori di ogni età ed è qui esemplificato da un topo adulto (8 settimane), un cucciolo mouse (5 giorni) e un ratto adulto (10 settimane). A seconda del tipo di animale e la tensione, il numero di sezioni toracica e lombare può variare 9, </sup&gt; 10, 11. A seconda delle proteine ​​da analizzare, roditori adulti possono essere perfusi con soluzioni di enzimi inibizione prima dell&#39;eutanasia. Se si esegue un esperimento che coinvolge lesioni nervose unilaterale, il midollo spinale può essere suddiviso in parti ipsilaterale e controlaterale utilizzando pinzette ultrafini subito dopo l&#39;estrusione. Inoltre, ogni lato può essere suddiviso in dorsale e ventrale lati. Il tessuto può quindi essere elaborato per ulteriori analisi, ad esempio Western blotting. Transcardial perfusione-fissazione con PFA prima dell&#39;estrusione del midollo spinale dovrebbe essere evitata, in quanto rende il midollo spinale non flessibile e impedisce midollo spinale estrusione idraulica. Idraulico estrusione del midollo spinale si strappa le radici dorsali. Per gli esperimenti in cui sono necessari allegati radici dorsali, si consiglia di laminectomia. Inoltre, meningi spinali vengono persi per estrusione idraulico, che può essere evitato laminectomia serie estrusione idraulica del midollo spinale e isolamento DRG potrebbe anche essere eseguita utilizzando ossigenato liquido cerebrospinale artificiale (ACSF) invece di PBS ghiacciato. L&#39;uso di ACSF permette conservazione del tessuto isolato in un ambiente migliore fisiologica, che è particolarmente importante nel caso di successive registrazioni elettrofisiologiche 12, 13. Un&#39;alternativa al ACSF potrebbe essere PBS contenente 1 g / L di glucosio per la generazione di colture DRG primaria 14. estrusione idraulica del midollo spinale è un metodo molto più veloce rispetto al modo tradizionale di isolamento del midollo spinale per laminectomia, riducendo i tempi di tessuto-movimentazione e quindi diminuendo il rischio di danni proteine. Perfusione con un fissatore prima di isolare il midollo spinale laminectomia può ridurre il rischio di danni ai tessuti durante la dissezione e durante la rimozione finale delmidollo spinale dalla colonna vertebrale. Tuttavia, la fissazione dei tessuti preclude l&#39;applicabilità di analisi come la Western blotting. I rendimenti di estrusione idraulici tessuto strutturalmente integro 3 adatto per una gamma più ampia di analisi. individuazione coerente di DRG può essere difficile. Tuttavia, questo è essenziale per l&#39;analisi dei tessuti, ad esempio in seguito lesione del nervo sciatico. Numerando i DRG in base alla loro localizzazione rispetto al costae, DRG possono essere identificati in modo coerente. La colorazione di tessuto del midollo spinale e della DRG può essere ottimizzata eseguendo le variazioni di trattamento del tessuto illustrate descritte nel passaggio 7 di protocollo.

L&#39;obiettivo generale di questo metodo è quello di isolare il midollo spinale e per identificare e isolare DRG 1, 2. Estrusione idraulica del midollo spinale è un metodo molto più veloce rispetto al modo tradizionale di isolamento del midollo spinale per laminectomia, cioè rompendo vertebre spinali uno alla volta, e questo metodo riduce il rischio di danni ai tessuti causati dal processo di dissezione 3, 4 . DRG può essere difficile da individuare. La corretta identificazione è molto importante per l&#39;analisi dei tessuti, ad esempio in seguito lesione del nervo sciatico. Numerando i DRG in base alla loro localizzazione rispetto al costae, DRG possono essere identificati in modo coerente. Tissue isolato mediante tecniche dimostrate qui può essere applicato ad un&#39;ampia gamma di analisi inclusi occidentale blotting 5,6, 7 e qPCR colorazione immunoistochimica 8. Nell&#39;individuazione DRG, è importante prendere in considerazione che il numero dei segmenti spinali si caratterizza per variare con il tipo di animale e ceppo 9, 10, 11. I vantaggi di eseguire questo metodo nei topi sono l&#39;elevato numero di varianti geneticamente modificati disponibili e le spese relativamente basse abitazioni. I vantaggi nell&#39;utilizzo di ratti sono la resa dei tessuti relativamente alta e se coinvolge lesioni nervose, la procedura sarà facilitato con dimensioni.

<table><tbody><tr><td>Forbici Bonn, extra fini, dritte, 8,5 cm</td><td>F.S.C. (Fine Science Tools)</td><td># 14084-08</td><td>Per tagliare il midollo spinale prima dell'isolamento dei DRG (topo adulto, ratto adulto); Possono essere utilizzati altri produttori</td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Eppendorf</td><td># 5427 R</td><td>Per la centrifugazione di tessuti omogeneizzati</td></tr><tr><td>Microtomo criostato</td><td>Leica Biosystems</td><td># CM 3050 S</td><td>Per il taglio del tessuto incorporato prima della colorazione; Possono essere utilizzati altri modelli e produttori</td></tr><tr><td>Pinze, Dumont, # 3</td><td>F.S.C. (Fine Science Tools)</td><td># 11231-30</td><td>Per la manipolazione del midollo spinale dopo l'estrusione; Possono essere utilizzati altri produttori/tipi</td></tr><tr><td>Pinze, Dumont, # 5</td><td>F.S.C. (Fine Science Tools)</td><td># 11252-20</td><td>Per l'isolamento di DRG (topo adulto, ratto adulto, cucciolo); Altri produttori possono essere utilizzati</td></tr><tr><td>Isoflurano (furano) IsoFlo Vet 100%</td> <td>Abbott</td> <td># 002185</td><td>Per l'eutanasia; Possono essere utilizzati altri produttori; ATTENZIONE: sostanze chimiche tossiche</td></tr><tr><td>Iso-pentano GPR rectapur</td><td>VWR</td> <td># 24872.298</td><td>Per il congelamento rapido dei tessuti; Possono essere utilizzati altri produttori; ATTENZIONE:</td></tr><tr><td>Microtomo</td> tossico <td>Leica Biosystems</td><td># RM 2155</td><td>Per il sezionamento di tessuti inclusi in paraffina; Altri modelli e produttori possono essere utilizzati</td></tr><tr><td>Pellet di cera di paraffina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td># 76243</td><td>Per l'inclusione di paraffina; Possono essere utilizzati altri produttori</td></tr><tr><td>Stazione di inclusione di tessuti in paraffina</td><td>Leica Biosystems</td><td># EG1160</td><td>Per l'inclusione di tessuti in paraffina per il successivo sezionamento; Possono essere utilizzati altri modelli e produttori</td></tr><tr><td>Pestello a pellet, motore a batteria</td><td>Sigma-Aldrich</td><td># Z359971-1EA</td><td>Per l'omogeneizzazione meccanica di tessuti isolati prima del Western blotting; Possono essere utilizzati altri produttori</td></tr><tr><td>Piastra di Petri, 35 mm</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td># 121V</td><td>Per lo stoccaggio di DRG isolati; Piastra di Petri di altro produttore e dimensioni</td></tr><tr><td>, 100 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td># P7741</td><td>Per l'estrusione del midollo spinale; Possono essere utilizzati altri produttori e dimensioni</td></tr><tr><td>: Inibitore della fosfatasi, Phosstop</td><td>Sigma-Aldrich</td><td># 04906845001</td><td>Cocktail di inibitori della fosfatasi da aggiungere al tampone di lisi TNE, se necessario; Possono essere utilizzati altri produttori</td></tr><tr><td>Puntale per pipette, 1-200 &mu; L, senza filtro</td><td>Sarstedt</td><td># 70.1189.105</td><td>Per estrusione idraulica; Altri produttori possono essere utilizzati</td></tr><tr><td>Inibitore della proteasi, Complete</td><td>Sigma-Aldrich</td><td># 05892791001</td><td>Cocktail di inibitori della proteasi per l'aggiunta al tampone di lisi TNE, se necessario; Altro produttore può essere utilizzato</td></tr><tr><td>Soluzione RNAlater</td><td>Sigma-Aldrich</td><td># R0901</td><td>Per la stabilizzazione dell'RNA per la conservazione; Altri produttori possono essere utilizzati</td></tr><tr><td>Rneasy Protect Mini KiT</td><td>Qiagen</td> <td># 74124</td><td>per l'isolamento dell'RNA; Altri produttori possono essere utilizzati</td></tr><tr><td>bisturi; Lama chirurgica Swann-Morton n. 11</td><td>Swann-Morton</td><td># REF0203</td><td>Per l'isolamento della zona lombare del midollo spinale; Possono essere utilizzati altri produttori/tipi</td></tr><tr><td>Forbici, dritte, tipo 3, tagliente da 25 mm</td><td>Bochem</td><td># 4070</td><td>Per l'isolamento della colonna vertebrale; Possono essere utilizzate altre forbici/tipi</td></tr> di <tr><td>forbici, tagliente da 130 mm</td><td>Hounisen</td><td># 1902.0130</td><td>Per l'isolamento del midollo spinale (ratto adulto)</td></tr><tr><td>Forbici a molla, diritte, tagliente da 8 mm</td><td>F.S.C. (Fine Science Tools)</td><td># 15009-08</td><td>Per aprire la colonna vertebrale prima dell'isolamento dei DRG (cucciolo) e per l'isolamento dei DRG (topo adulto, ratto adulto, cucciolo); Possono essere utilizzate</td></tr><tr><td>siringhe standard da 2,5 mL, 5 mL, 10 mL</td><td>Terumo</td><td># SS02SE1; # SS05SE1; # SS10SE1</td><td>Per estrusione idraulica; Possono essere utilizzati altri produttori</td></tr><tr><td>Stereomicroscopio MZ12.5 con obiettivo 1X e oculare 10X</td><td>Leica</td><td># 10446370</td><td>Possono essere utilizzati altri produttori/tipi</td></tr><tr><td>Sterile PBS</td><td>GIBCO#</td> <td>10010-015</td><td>Per estrusione idraulica; Può essere realizzato anche secondo i protocolli standard</td></tr><tr><td>Ago per siringa 23 G x 1", 0,6 x 25 mm</td><td>Terumo Neolus</td><td># NN-2325R</td><td>Per estrusione idraulica nei cuccioli; Altro produttore/tipo può essere utilizzato</td></tr><tr><td>Ago per siringa 18 G x 1 1/2, 1,2 x 40 mm</td><td>Terumo Neolus</td><td># NN-1838S</td><td>Alternativa alla punta della pipetta per l'estrusione idraulica nei topi adulti; Altro produttore può essere utilizzato</td></tr><tr><td>Tissue-Tek</td><td>Sakura</td> <td># 4583</td><td>Tssue materiale di inclusione per la successiva criosezione</td></tr><tr><td>TNE-lisi tampone</td><td>VWR prodotti chimici</td> <td># 10128-582</td><td>Per la lisi dei tessuti prima del Western blotting; Possono essere utilizzati altri produttori; Può essere realizzato anche secondo i protocolli standard</td></tr></tbody></table>

estrusione idraulica del midollo spinale e isolamento dei gangli dorsali nei roditori

Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents

Tradizionalmente, il midollo spinale viene isolato mediante laminectomia, cioè aprendo le vertebre spinali una alla volta. Questo richiede tempo e può causare danni al midollo spinale causati dal processo di dissezione. Qui mostriamo come il midollo spinale può essere estruso utilizzando la pressione idraulica. Il tempo di manipolazione è significativamente ridotto a pochi minuti, probabilmente diminuendo il danno proteico. Il basso rischio di danni al tessuto del midollo spinale migliora la successiva analisi immunoistochimica. Eseguendo l'estrusione idraulica del midollo spinale invece della tradizionale laminectomia, i roditori possono essere ulteriormente utilizzati per l'isolamento dei DRG, riducendo così il numero di animali e consentendo l'analisi tra i tessuti dello stesso roditore. Dimostriamo un metodo coerente per identificare e isolare i DRG in base alla loro localizzazione rispetto alle coste. Tuttavia, è importante adattare questo metodo al particolare animale utilizzato, poiché il numero di segmenti del midollo spinale, sia toracici che lombari, può variare a seconda del tipo di animale e del ceppo. Inoltre, illustriamo ulteriori esempi di lavorazione dei tessuti isolati.

Midollo spinale idraulico estruso mostrano una superficie liscia intatta mostrato in Figura 1. L&#39;allargamento lombare può essere facilmente identificato come area ispessita del midollo spinale, inscatolato in Figura 1. Le dorsali e ventrali lati del midollo spinale possono essere identificati da occhio secondo la morfologia. Nella figura 1, il lato ventrale è rivolto verso lo spettatore, identificabili da una linea mediana chiaro, lungo l&#39;intero midollo spinale. Due linee più ampie lungo il midollo spinale consentono l&#39;identificazione del lato dorsale. Al distale-più fine, la cauda equina a volte può rimanere attaccato in ratti adulti e topi adulti. DRG individuali possono essere identificati solo mentre si trova nella colonna vertebrale, Figura 2. Dopo aver isolato, figura 3, i singoli DRG non possono essere identificati in base all&#39;aspetto. Se necessario, è quindiimportante per tenerli separati chiaramente su di isolamento. Dopo l&#39;isolamento, il midollo spinale e DRG possono essere elaborati e colorati come indicato al punto 7.3 e rappresentata nella figura 4. La figura 4a mostra una colorazione immunoistochimica di una sezione DRG cui i neuroni e le cellule gliali satelliti circostante sono chiaramente visibili. Con corretta identificazione del DRG è possibile analizzare l&#39;effetto di lesioni del nervo sciatico sul soma del neurone lesa nonché sulle loro cellule gliali satellitare circostanti. La figura 4b mostra una colorazione Nissl di un midollo spinale estruso idraulicamente dove il tessuto è intatto come risulta dai bordi lisci della sezione. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55226/55226fig4.jpg" /> Figura 4: sezioni di tessuto rappresentativi. A. La colorazione immunoistochimica della sezione DRG. B. Nissl macchiato section del midollo spinale estruso idraulicamente. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55226/55226fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

Qui, presentiamo un protocollo per l'estrusione idraulica del midollo spinale, nonché l'identificazione e l'isolamento di specifici gangli della radice dorsale (DRG) nello stesso roditore. Rispetto ai metodi standard di isolamento del midollo spinale, questo metodo è significativamente più veloce e riduce il rischio di danni ai tessuti.

Estrusione idraulica del midollo spinale e isolamento dei gangli dorsali nei roditori

Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may ...

L'obiettivo generale di questo metodo è isolare il midollo spinale mediante estrusione idraulica, nonché identificare e isolare i gangli delle radici dorsali nei topi e nei ratti. Questo viene ottenuto innanzitutto praticando l'eutanasia al roditore, seguita da decapitazione. La pelle viene incisa lungo la spina dorsale e separata dai tessuti sottostanti.Successivamente, la colonna vertebrale viene separata dal tessuto circostante praticando dei tagli lungo entrambi i lati della colonna vertebrale in direzione distale oltre l'osso pelvico. Quindi, la colonna vertebrale viene recisa in posizione distale rispetto all'osso pelvico. Una siringa con una punta di pipetta adattata viene inserita all'estremità più distale del midollo spinale.Applicando una pressione costante, il midollo spinale viene estruso nella piastra di Petri posta sul ghiaccio utilizzando PBS sterile freddo. Con forbici a molla, la colonna vertebrale viene divisa longitudinalmente. Successivamente, vengono individuati i siti di inserzione della costa più distale.Questo permette l'identificazione dei DRG toracici più distali su ciascun lato, indicati come T13. A questo punto è possibile identificare i DRG successivi. I DRG corrispondenti all'ingrossamento lombare del midollo spinale si trovano in posizione distale.Utilizzando forbici a molla, si tagliano le radici dorsali e ventrali e i gangli della radice dorsale (DRG) vengono delicatamente prelevati dalla cavità e trasferiti in piatti di Petri etichettati contenenti PBS sterile posto sul ghiaccio. L'estrazione idraulica del midollo spinale è un metodo significativamente più rapido rispetto alla laminectomia tradizionale, in cui le vertebre spinali vengono frantumate una alla volta. Questo metodo riduce il rischio di danni ai tessuti causati dal processo di dissezione e fornisce tessuti adatti a un'ampia gamma di analisi.I gangli delle radici dorsali possono generalmente risultare difficili da identificare. Tuttavia, un'identificazione corretta è di fondamentale importanza per ulteriori analisi del tessuto, ad esempio dopo una lesione del nervo sciatico. Numerando i gangli delle radici dorsali in base alla loro localizzazione rispetto alla costa, è possibile identificare i gangli delle radici dorsali in modo costante.Preparare una siringa per l'estruzione del midollo spinale tagliando l'estremit&agrave; grande di una punta di pipetta non filtrata. La punta si adatter&agrave; perfettamente quando posizionata correttamente. Aspirare PBS sterile freddo con ghiaccio e lasciare la siringa sul ghiaccio fino all'uso successivo.Per i roditori adulti, praticare l'eutanasia con gas come CO2 o isoflurano, seguita da decapitazione. Non eseguire la dislocazione cervicale poiché ciò danneggerebbe le vertebre spinali rendendo impossibile l'estrazione del midollo spinale. I piccoli possono essere sottoposti a eutanasia mediante decapitazione diretta.Spargere acqua sul pelo per controllarlo. Successivamente, tagliare il pelo lungo la colonna vertebrale in direzione distale. Isolare la colonna vertebrale tagliando su entrambi i lati lungo la colonna stessa oltre l'osso pelvico e recidere la colonna vertebrale in prossimità della pelvi.Tagliare la colonna vertebrale evitando le aree più prossimali e quelle più distali, poiché potrebbero rendere la colonna vertebrale troppo a forma di S, ostacolando l'estrazione del midollo spinale. Assicurarsi che il midollo spinale sia visibile a entrambe le estremità. Se il midollo spinale non è visibile, tagliare ulteriormente la colonna vertebrale finché il midollo spinale non diventa visibile.Posizionare una piastra di Petri contenente PBS sul ghiaccio. Raddrizzare la colonna vertebrale appoggiando l'indice sulla parte curva all'estremità prossimale della colonna vertebrale. Inserire la punta della pipetta all'estremità distale del midollo spinale.Applicare una pressione costante ed estrarre il midollo spinale nella piastra di Petri. Aprire la colonna vertebrale. Recidere alcune vertebre sul lato ventrale della colonna e quindi passare a recidere alcune vertebre sul lato dorsale.Continuare ad alternare i lati lungo tutta la colonna vertebrale. Posizionare il midollo spinale aperto sotto un microscopio. Identificare il segmento della vertebra T13 localizzando il sito di attacco della costa più distale nella colonna vertebrale.Attenzione a non confondere la costa più distale con i nervi intercostali vicini. La costa più distale è attaccata alla parte prossimale del segmento della vertebra T13 e i gangli della radice dorsale (DRG) T13 si trovano in posizione distale rispetto alla vertebra T13 e prossimale rispetto alla vertebra L1. Identificare i DRG concomitanti in direzione distale. Preparare delle capsule di Petri numerate contenenti PBS sterile freddo su ghiaccio.Per evitare danni al ganglio della radice dorsale durante il prelievo, afferrare le radici dorsale e ventrale piuttosto che il ganglio stesso con una pinzetta da microchirurgia. Utilizzando forbici microchirurgiche, tagliare prima il nervo periferico, seguito dalle radici dorsale e ventrale. Nei piccoli, questi nervi non sono visibili con la stessa chiarezza che nei roditori adulti.Per recidere i nervi il più vicino possibile al ganglio della radice dorsale (DRG), far scivolare delicatamente la punta delle forbici lungo il DRG per posizionare correttamente la punta prima di effettuare il taglio. Utilizzando la punta di pinzette chiuse, estrarre delicatamente i DRG e trasferirli nella relativa piastra di Petri. Nei ratti adulti e nei topi adulti, i DRG sono di colore bianco con radici dorsali e ventrali chiaramente visibili, mentre nei cuccioli appaiono come sfere trasparenti.Per la blotting western, isolare il tessuto di interesse e porre il tessuto in un buffer di lisi. Successivamente, omogeneizzare il tessuto, centrifugare, raccogliere il soprannatante ed eseguire la blotting western secondo protocolli standard. Per l'analisi dell'RNA, isolare il tessuto di interesse e porre immediatamente il tessuto in una soluzione di stabilizzazione dell'RNA.Successivamente, eseguire la qPCR seguendo protocolli standard. Per l'immunohistochimica su tessuto congelato rapidamente, preparare della polvere di ghiaccio secco su un pezzo di carta argentata. Posizionare il tessuto sulla polvere di ghiaccio secco per congelarlo rapidamente.Quindi trasferire il tessuto in un criostato e includere il tessuto per il taglio. Postfissare il tessuto in PFA al 4% per 10 minuti a temperatura ambiente ed eseguire la colorazione immunohistochimica secondo protocolli standard. Per l'immunohistochimica su sezioni criogeniche, fissare il tessuto in PFA al 4% a quattro gradi e trasferire il tessuto in saccarosio al 25% peso/volume durante la notte a quattro gradi.Posizionare il tessuto nel materiale di inclusione e congelare il tessuto utilizzando 2-metilbutano refrigerato. Tagliare il tessuto al criostato ed eseguire la colorazione immunohistochimica seguendo protocolli standard. Per l'immunohistochimica su sezioni in paraffina, fissare il tessuto in PFA al 4% a quattro gradi e trasferire il tessuto in soluzione di saccarosio al 25% peso/volume, lasciando in incubazione tutta la notte a quattro gradi.Includere il tessuto in paraffina, tagliare il tessuto al microtomo ed eseguire la colorazione immunohistochemica secondo protocolli standard. A seconda degli anticorpi utilizzati per la colorazione immunohistochemica, potrebbe risultare applicabile uno dei metodi di trattamento del tessuto qui illustrati. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come isolare il midollo spinale mediante estrusione idraulica e di come identificare e isolare i gangli delle radici dorsali in maniera riproducibile.I metodi qui mostrati sono applicabili a topi e ratti di ogni età e il tessuto isolato può essere utilizzato per un'ampia gamma di analisi, inclusi metodi che richiedono un isolamento rapido di tessuto non fissato.

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Studio genetico della rigenerazione assonale con colture di neuroni adulti Root dorsali gangliari

In questo video, dimostriamo l'estrazione del ganglio della radice dorsale o DRG da una spina dorsale di ratto raccolta per applicazioni a valle.

Raccolta di DRG dalla colonna vertebrale del ratto: una procedura per estrarre il ganglio della radice dorsale dalla colonna vertebrale di un modello di ratto

In questo video, descriviamo un protocollo passo-passo per isolare il midollo spinale da un modello murino per studi in vitro.

Estrazione del midollo spinale: un protocollo per isolare il midollo spinale murino per studi in vitro

Questo video mostra una procedura per isolare i neuroni del ganglio della radice dorsale (DRG) da embrioni di ratto e co-coltivarli con i precursori delle cellule di Schwann per generare cellule di Schwann mature. I DRG isolati vengono elaborati per isolare i neuroni e le cellule gliali. Le cellule isolate vengono coltivate per purificare i neuroni, che vengono poi co-coltivati con cellule simili a cellule di Schwann (SCLC) in un terreno di co-coltura. L'interazione con i neuroni DRG porta alla...

Isolamento di neuroni DRG e cocoltura con precursori cellulari di Schwann per generare cellule di Schwann

Questo video presenta un metodo per isolare le cellule staminali/progenitrici neurali dal tessuto periventricolare del midollo spinale nei ratti adulti. La tecnica prevede l'incubazione dei frammenti di tessuto in una soluzione contenente enzimi proteolitici per interrompere la matrice extracellulare e rilasciare le cellule. Successivamente, le cellule rilasciate vengono piastrate in un mezzo contenente specifici fattori di crescita che migliorano la proliferazione staminale/progenitrice...

Isolamento delle cellule progenitrici dello staminali neurale dalla regione periventricolare del midollo spinale di un ratto adulto

Questo video mostra una tecnica per isolare e coltivare le cellule dei gangli della radice dorsale (DRG) dalla colonna vertebrale del ratto. I DRG asportati dalla colonna vertebrale vengono trattati con enzimi e dissociati meccanicamente per ottenere una sospensione unicellulare. Le cellule vengono coltivate in un terreno contenente inibitori e fattori di crescita che limitano la proliferazione delle cellule gliali e promuovono la crescita neuronale, rispettivamente.

Stabilire una coltura cellulare primaria di gangli della radice dorsale da una colonna vertebrale di ratto

Il midollo spinale adulto dei mammiferi contiene cellule staminali/progenitrici neurali (NSPC) che possono essere isolate ed espanse in coltura. Questo protocollo descrive la raccolta, l'isolamento, la coltura e il passaggio di NSPC generate dalla regione periventricolare del midollo spinale adulto dal ratto e da donatori di trapianto di organi umani.

Isolamento di Neural cellule staminali / progenitrici dalla Regione periventricolare del ratto adulto e midollo spinale umano

Questo protocollo descrive l'isolamento dei neuroni del ganglio della radice dorsale (DRG) isolati dai ratti e la coltura dei neuroni DRG su un sistema statico di coltura cellulare pre-allungata per migliorare l'allineamento degli assoni, con successiva co-coltura di cellule di Schwann (SC) per promuovere la mielinizzazione.

Un approccio per migliorare l&#39;allineamento e la mielinizzazione dorsale Root Ganglion neuroni

Questo protocollo presenta l'uso di un'iniezione di ganglio della radice dorsale (DRG) con un vettore virale e una concomitante lesione da schiacciamento della radice dorsale in un ratto adulto come modello per studiare la rigenerazione sensoriale degli assoni. Questo modello è adatto per studiare l'uso della terapia genica per promuovere la rigenerazione sensoriale degli assoni.

Radice dorsale Ganglion iniezione e dorsale radice Lesioni Crush come un modello per sensoriale Axon Regeneration

Questo protocollo fornisce una tecnica per raccogliere e coltivare il ganglio radicale dorsale (DRG) espiantato da ratti Sprague Dawley adulti in un dispositivo multicompartimentale (MC).

Raccolta, inclusione e coltura dei gangli della radice dorsale in dispositivi multicompartimentali per studiare le caratteristiche neuronali periferiche

I gangli della radice dorsale (DRG) contengono i corpi cellulari dei neuroni sensoriali primari e trasmettono segnali sensoriali periferici al midollo spinale. Questo protocollo descrive un metodo per la dissezione DRG del muro che supporta l'isolamento standardizzato dei gangli strutturalmente intatti, l'identificazione anatomica segmentale, una guida intuitiva per gli utenti principianti e la riduzione del danno procedurale ai tessuti.

Dissezione e isolamento dei gangli dorsali della radice del topo

Scopri l'estrusione idraulica del midollo spinale per isolare i gangli dorsali nei roditori. Questo metodo rapido riduce i danni tissutali e facilita la ricerca neurobiologica su modelli murini.

Estrusione idraulica del midollo spinale e isolamento dei gangli dorsali nei roditori

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