Quantificazione del comportamento del grooming di Drosophila

L'obiettivo generale di questo metodo è misurare il comportamento di toeletta di Drosophila quantificando e confrontando il residuo di colorante giallo brillante colorato sul corpo degli animali in condizioni di toeletta e senza toeletta. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo della neurobiologia e della genetica del comportamento, come la coordinazione delle abilità locomotorie fini e i relativi regolatori molecolari e circuiti associati. Il principale vantaggio di questa tecnica è che è rapida, robusta e facile da eseguire da parte di molti sperimentatori e studenti con diversi livelli di competenza.

La dimostrazione di questa procedura sarà effettuata da Frankie Barradale, uno studente del mio laboratorio. Per iniziare l'esperimento, preparare un aspiratore per trasferire Drosophila vive da un vial di coltura alla camera per la toelettatura. Utilizzando delle forbici, tagliare 1,5 piedi di tubo in Tygon.

Tagliare almeno un centimetro dalla punta di una punta monouso da un millilitro e tenere il pezzo quadrato di rete (di un centimetro per lato) sopra l'apertura da 196 pollici della punta tagliata. Posizionare saldamente una nuova punta da un millilitro sopra la rete e la punta tagliata per creare una camera di contenimento per i moscerini. Tagliare l'estremità più fine della nuova punta per allargare l'apertura a sufficienza da permettere il passaggio di un singolo moscerino.

Il foro sarà approssimativamente corrispondente all'apertura della camera per la toelettatura. Inserire saldamente le punte nidificate all'estremità del tubo in Tygon. Spingere le punte all'interno del tubo per garantire un'aderenza stretta che permetta la pressione sotto vuoto.

All'estremità opposta del tubo, tagliare la punta di una pipetta microlitrica da 200 millilitri e inserire l'estremità tagliata nel tubo per formare il lato bocca dell'aspiratore. Per preparare i tubi con aliquote di polvere, pesare cinque milligrammi di colorante giallo brillante su carta da pesata. Versare la polvere in un tubo microcentrifuga da 8 millilitri e chiudere saldamente il cappuccio.

Successivamente, per preparare le provette di etanolo, pipettare un millilitro di etanolo al 100% in provette microcentrifuga da 15 millilitri. Etichettare le provette, chiuderle con il cappuccio e conservarle per il completamento del saggio di toeletta. Includere inoltre almeno un campione bianco contenente soltanto un millilitro di etanolo senza moscerino, come controllo negativo.

Assemblare ogni camera per la toelettatura avvitando la piastra superiore scorrevole con i fori più piccoli, lasciando però rimossa la piastra inferiore con i fori più grandi per consentire l'aggiunta della polvere. Posizionare ogni camera per la toelettatura necessaria piatta su un tavolo con la parte superiore rivolta verso il basso. Caricare cinque milligrammi di aliquota di colorante giallo brillante in ogni camera, battendo il tubo contro la superficie della camera sopra il pozzetto desiderato.

Battere delicatamente la camera sul tavolo per assicurarsi che tutta la polvere cada attraverso la maglia fino alla sommità della piastra. Quindi avvitare la piastra inferiore su ciascuna camera, in modo che le estremità più larghe delle aperture coniche siano rivolte verso l'esterno e i fori non si trovino sopra le pozzette. Fissare saldamente la piastra inferiore, in modo che non scivoli e non rilasci il colorante.

Rovesciare la camera e batterla delicatamente contro il tavolo alcune volte in modo che la polvere passi attraverso la maglia e si depositi sulla piastra inferiore. Far scorrere la piastra superiore della camera nelle posizioni aperte in modo che i piccoli fori siano allineati con le 15 pozzette, permettendo l'introduzione delle mosche nelle singole pozzette. Caricare una mosca nel cannello aspiratore succhiando delicatamente da un'estremità del dispositivo, come se si stesse utilizzando una cannuccia.

Depositi le mosche soffiando leggermente e indirizzando l'apertura verso il bersaglio. Dopo aver caricato una pozzetta, sposti la piastra superiore in modo che la mosca venga intrappolata nella camera e applichi del nastro sull'apertura della pozzetta durante il caricamento della camera forata, per evitare la fuga della mosca mentre si caricano le altre pozzette. Se più mosche vengono aspirate in un'unica pozzetta, lasci quell'apertura scoperta finché non ne rimane soltanto una.

Dopo aver riempito tutte le pozzette necessarie con le mosche, capovolgere la camera in modo che la piastra inferiore sia rivolta verso l'alto e la polvere possa ricoprire le mosche cadendo attraverso la maglia. Fissare saldamente le piastre superiore e inferiore stringendo le viti e agitare la camera con un vorticoso per quattro secondi. Battere la camera, con la piastra superiore rivolta verso il basso, due volte sul tavolo, in modo che il colorante cada dall'altro lato.

Quindi, capovolgere la camera con la piastra superiore rivolta verso l'alto e battere due volte sulla camera, per assicurarsi che il colorante si depositi sul fondo della camera inferiore, lontano dalla mosca, trattenuta nella camera superiore. Per le mosche di controllo, a cui non è permesso groomarsi, procedere immediatamente alla preparazione del campione. Appoggiare la camera in posizione orizzontale sul tavolo o sul piano di lavoro, con la piastra superiore rivolta verso l'alto, per 30 minuti, consentendo alle mosche di groomarsi.

Posizionare la camera in un ambiente privo di rumore e vibrazioni, per mantenere costante l'ambiente durante tutti gli esperimenti di toelettatura. Mantenendo la camera in posizione orizzontale con la piastra superiore rivolta verso l'alto, svitare delicatamente la piastra inferiore e rimuoverla dalla camera, avendo cura di non perdere alcun colorante. Posizionare la camera su un tappetino a CO2 con flusso d'aria ridotto fino a quando i moscerini non sono anestetizzati.

Svitare la piastra superiore dalla camera, utilizzare con attenzione una pinzetta per afferrare una zampa e rimuovere una mosca polverizzata da ciascuna camera, depositandola in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri contenente etanolo. Una volta che ogni tubo microcentrifuga contiene una mosca, chiudere il coperchio e capovolgere i tubi tre volte per agitare e mescolare la soluzione di colorante ed etanolo. Incubare i tubi contenenti etanolo e mosche per cinque ore a temperatura ambiente per garantire la completa rimozione del colorante dalla mosca nella soluzione.

Dopo cinque ore, vortexare brevemente ogni provetta per due secondi per assicurare la rimozione dei coloranti dalle mosche. Aliquotare 50 microlitri della provetta sperimentale da 1,5 millilitri in una pozzetta di una piastra a 96 pozzette, annotando la posizione di ogni campione sulla piastra. Aggiungere 200 microlitri di etanolo per diluire il campione di cinque volte, evitando effetti di sigillatura dovuti a mosche eccessivamente polverose o a gravi difetti di toeletta.

Utilizzare un lettore di piastre per analizzare ogni campione a 397 nanometri. Registrare il campione tramite il lettore di piastre e salvare il foglio di calcolo con i campioni registrati sulla piastra. Abbiamo utilizzato questo metodo per studiare DopR confrontando le prestazioni di toelettatura di un ipomorfo forte e di mutanti null per DopR con una ceppo di tipo selvatico.

I mutanti di DopR hanno trattenuto una quantità significativamente maggiore di colorante rispetto ai rispettivi controlli di tipo selvaggio o recuperati, indicando che i mutanti di DopR erano meno efficienti nel comportamento di toelettatura. In un esperimento parallelo con moscerini Rutabaga, i mutanti mostrano livelli più elevati di accumulo del colorante rispetto ai mutanti di DopR, suggerendo un ruolo significativo di DopR nel comportamento di toelettatura. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come manipolare i moscerini per saggi comportamentali e di come misurare il comportamento di toelettatura.