Quantificazione del comportamento del grooming di Drosophila

L'obiettivo generale di questo metodo è misurare il comportamento di toelettatura di Drosophila quantificando e confrontando il resto di colorante giallo brillante colorato sul corpo degli animali in condizioni di toelettatura e non toelettatura. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della neurobiologia e della genetica comportamentale, come il coordinamento delle abilità locomotive fini e i regolatori e i circuiti molecolari associati. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è rapida, robusta e facile da eseguire da molti sperimentatori e studenti con una varietà di livelli di abilità.

A dimostrare questa procedura sarà Frankie Barradale, uno studente del mio laboratorio. Per iniziare l'esperimento, preparare un aspiratore per spostare la Drosophila viva da una fiala di coltura alla camera di toelettatura. Usando le forbici, taglia 1.5 piedi di tubo Tygon.

Tagliare almeno un pollice della punta di una micropipetta monouso da un millilitro e tenere il pezzo di rete quadrato di un centimetro sopra l'apertura di 196 pollici della punta tagliata. Posizionare comodamente una punta per micropipetta fresca da un millilitro sulla rete e tagliare la punta per creare una camera di contenimento per le mosche. Tagliare la punta estrema del nuovo puntale della micropipetta per allargare l'apertura quanto basta per consentire il passaggio di una singola mosca.

Il foro corrisponderà all'incirca all'apertura della camera di toelettatura. Montare perfettamente le punte nidificate sull'estremità del tubo Tygon. Spingere le punte nel tubo per garantire una perfetta aderenza per consentire la pressione del vuoto.

All'altra estremità del tubo, tagliare la punta di una punta per micropipetta da 200 millilitri e inserire l'estremità tagliata stretta nel tubo per formare il lato della bocca dell'aspiratore. Per preparare i tubi di aliquote per la polvere, pesare cinque milligrammi di colorante giallo brillante su carta per pesare. Versare la polvere in una provetta da microcentrifuga da 8 millilitri e chiudere bene il tappo.

Successivamente, per preparare le provette di etanolo, pipettare un millilitro di etanolo al 100% in provette da microcentrifuga da 15 millilitri. Etichettare le provette, tappare e conservare le provette di etanolo per il completamento del test di toelettatura. Includere anche almeno un campione bianco con solo un millilitro di etanolo senza mosca per i controlli negativi.

Assemblare ogni camera di toelettatura avvitando la piastra superiore scorrevole con i fori più piccoli, ma lasciando la piastra inferiore con i fori più grandi rimossi per l'aggiunta della polvere. Posizionare ogni camera di toelettatura necessaria su un tavolo con la parte superiore rivolta verso il basso. Caricare cinque milligrammi di aliquota di colorante giallo brillante in ciascuna camera, picchiettando il tubo contro la superficie della camera sopra il pozzetto desiderato.

Battere la camera contro il tavolo per assicurarsi che tutta la polvere cada attraverso la rete fino alla parte superiore della piastra. Quindi avvitare la piastra inferiore su ciascuna camera, in modo che le estremità più larghe delle aperture coniche siano rivolte verso l'esterno e i fori non poggino sopra i pozzetti. Fissare saldamente la piastra inferiore, in modo che non scivoli e non rilasci il colorante.

Capovolgere la camera e sbatterla contro il tavolo alcune volte in modo che la polvere cada attraverso la rete per appoggiarsi sulla piastra inferiore. Far scorrere la piastra superiore della camera nelle posizioni aperte in modo che i piccoli fori si allineino con i 15 pozzetti, consentendo l'introduzione di mosche nei singoli pozzetti. Caricare una mosca nell'aspiratore orale aspirando delicatamente attraverso un'estremità dell'aspiratore come se si usasse una cannuccia.

Deposita le mosche soffiando leggermente e dirigendo l'apertura verso il bersaglio. Dopo aver caricato un pozzetto, far scorrere la piastra superiore in modo che la mosca sia intrappolata nella camera e posizionare del nastro adesivo sull'apertura del pozzetto durante il caricamento della camera del foro, per evitare la fuoriuscita della mosca durante il caricamento degli altri pozzetti. Se più mosche vengono aspirate in un singolo pozzo, lasciare l'apertura scoperta fino a quando non rimane una sola mosca.

Dopo che tutti i pozzetti necessari sono stati riempiti di mosche, capovolgere la camera in modo che la piastra inferiore sia rivolta verso l'alto e la polvere abbia il potenziale per ricoprire le mosche cadendo attraverso la rete. Fissare saldamente le piastre superiore e inferiore serrando le viti e agitare la camera per spolverare le mosche per quattro secondi. Sbattere due volte la camera, la piastra superiore a faccia in giù contro il tavolo, in modo che il colorante cada dall'altro lato.

Quindi, capovolgere la camera, la piastra superiore a faccia in su e battere la camera due volte, per assicurarsi che il colorante si depositi sul pavimento della camera inferiore, lontano dalla mosca, trattenuta nella camera superiore. Per le mosche di controllo, a cui non è permesso pulirsi, procedere immediatamente alla preparazione del campione. Appoggiare la camera sul tavolo o sul piano di lavoro, con la piastra superiore rivolta verso l'alto per 30 minuti per consentire alle mosche di pulirsi.

Posiziona la camera in uno spazio privo di vibrazioni rumorose, per mantenere l'ambiente costante per tutti gli esperimenti di toelettatura. Mantenendo la camera a livello della piastra superiore verso l'alto, svitare delicatamente la piastra inferiore e rimuoverla dalla camera, facendo attenzione a non perdere colorante. Posizionare la camera su un tampone di CO2 con un flusso d'aria basso fino a quando le mosche non vengono anestetizzate.

Svitare la piastra superiore dalla camera, usare con cautela una pinza per afferrare una gamba e rimuovere una mosca spolverata da ciascuna camera e depositarla in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri contenente etanolo. Una volta che ogni provetta per microcentrifuga contiene una mosca, chiudere il tappo e capovolgere le provette tre volte per agitare e mescolare la soluzione di colorante ed etanolo. Incubare le provette contenenti etanolo e mosche per cinque ore a temperatura ambiente per garantire la completa rimozione del colorante dalla mosca in soluzione.

Dopo cinque ore, agitare brevemente ogni tubo per due secondi per garantire l'eliminazione dei coloranti dalle mosche. Aliquotare 50 microlitri della provetta sperimentale da 1,5 millilitri in un pozzetto di una piastra da 96 pozzetti, prendendo nota della posizione di ciascun campione sulla piastra. Aggiungere 200 microlitri di etanolo per diluire il campione cinque volte per evitare gli effetti di sigillatura di mosche molto spolverate o grandi difetti di toelettatura.

Utilizzare un lettore di piastre per analizzare ogni campione a 397 nanometri. Registrare il campione tramite il lettore di piastre e salvare il foglio di calcolo con i campioni registrati sulla piastra. Abbiamo usato questo metodo per studiare la DopR confrontando le prestazioni di toelettatura di un ipomorfo forte e di mutanti DopR nulli con un ceppo wild type.

I mutanti DopR conservavano significativamente più colorante rispetto alle loro controparti selvatiche salvate, indicando che i mutanti DopR erano meno efficienti nel comportamento di toelettatura. In un esperimento parallelo di mosche Rutabaga, i mutanti mostrano i livelli di accumulo di colorante più elevati rispetto ai mutanti DopR, suggerendo un ruolo significativo di DopR nel comportamento di toelettatura. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come gestire le mosche per i test comportamentali e misurare anche il comportamento di toelettatura.