Name: Utilizzando modelli di Zebrafish di umana virus infezioni allo schermo farmaci antivirali e caratterizzare host immune cellulo Risposte (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Scopri modelli di infezione sistemica e localizzata in zebrafish per studiare il virus dell'influenza A umana. Questo metodo consente di testare farmaci antivirali e analizzare le risposte immunitarie delle cellule ospiti in vivo.

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Gli autori desiderano ringraziare Mark Nilan per la cura e il mantenimento del pesce zebra e Meghan Breitbach e Deborah Bouchard per la propagazione di NS1-GFP e la determinazione dei titoli IAV. Questa ricerca è stata supportata dalla sovvenzione NIGMS, NIH P20GM103534 e dalla Maine Agricultural and Forest Experiment Station (numero di pubblicazione 3493).

Tutti i lavori devono essere eseguiti utilizzando il livello di biosicurezza 2 (o BSL2) standard descritti dai Centri statunitensi per il controllo delle malattie (CDC) e in conformità con le direttive stabilite dalla Institutional Animal Care e sull&#39;uso di comitati (IACUC). Si prega di conferire con i funzionari competenti per garantire la sicurezza e la conformità. 1. Zebrafish Cura e manutenzione <ol><li> Spawn zebrafish e raccogliere il numero necessario di embrioni per gli esperimenti. Quando necessario, vasche di allevamento di massa, come quelli descritti dal Adatto et al. 32, possono essere impiegati per raccogliere un gran numero di embrioni evolutivamente-messa in scena. </li><li> Lasciare embrioni a svilupparsi fino stadio desiderato di sviluppo (48 ore post-fertilizzazione per un&#39;infezione sistemica IAV [sezione 3] o 5 giorni dopo la fecondazione per una, nuotare infezione della vescica localizzata [sezione 4]) in piatti profondi Petri a bassa densità (&lt; 100 embrioni / piatto) a 28 ° C in acqua uovo sterile contenente 60 mg / ml sale marino (es Instant Ocean) in acqua distillata. <ol><li> Rimuovere embrioni morti con pipette di trasferimento in plastica e cambiare uovo acqua al giorno per garantire la salute e lo sviluppo ottimale. </li></ol></li></ol> 2. Preparazione dei Materiali e reagenti <ol><li> Preparare un 4 mg / ml soluzione stock di Tricaine-S (aggiustare il pH a 7,0-7,4) in acqua distillata e autoclave. Conservare a 4 ° C. </li><li> Tirare capillari di vetro borosilicato con filamenti con un estrattore micropipetta (ad es Micropipetta Estrattore con le seguenti impostazioni: impostazione della pressione = 100, il calore = 550, tirare = [nessun valore], velocità = 130, tempo = 110). NOTA: Prima di rifilatura l&#39;ago, la lunghezza da dove l&#39;ago comincia a cono alla punta dell&#39;ago sarebbe di circa 12-15 mm. Questo può variare, tuttavia, in base alle preferenze e applicazione. A lungo, conicità più graduale può essere preferibile a causa della maggiore capacità di perforare l&#39;embrione e la ri ridottask della piegatura dell&#39;ago o rottura. </li><li> Sciogliere 2 g di agarosio in acqua uovo 100 ml usando un forno a microonde. Fai piastre su cui allineare ed iniettare gli embrioni versando fuso agarosio in piatti profondi Petri e permettendogli di solidificare. </li><li> Fare un 10 mg / ml magazzino del Zanamivir in acqua priva di nucleasi. Aliquotare e congelare a -20 ° C. </li><li> Sciogliere 0,5 g di agarosio in acqua uovo 50 ml utilizzando un forno a microonde per rendere il montaggio degli embrioni di agarosio. Mantenere a bagnomaria a 50 ° C fino al momento dell&#39;uso durante l&#39;imaging. </li></ol> 3. sistemica IAV infezione (48 ore post-fecondazione) ATTENZIONE: Tutto il personale di ricerca devono consultarsi con i loro supervisori e medici per quanto riguarda la vaccinazione prima di iniziare il lavoro con IAV. <ol><li> dechorionate manualmente embrioni il giorno dell&#39;esperimento utilizzando # 5 pinze. Fare attenzione a rimuovere e euthanize embrioni che sono stati feriti nel processo a 200 mg / ml di soluzione Tricaine. </li><li> preparazione of IAV per microiniezione NOTA: I ceppi che hanno dimostrato di infettare embrioni di zebrafish sono l&#39;influenza A / PR / 8/34 (H1N1) (APR8), l&#39;influenza A X-31 A / Aichi / 68 (H3N2) (X-31), e il reporter fluorescente ceppo di influenza NS1-GFP 33. Dettagli sulla APR8 e X-31, e altri ceppi, si possono trovare presso il database Influenza Research <ol><li> Propagare il ceppo NS1-GFP di IAV in uova di gallina embrionate come descritto in precedenza 34, 35. Raccogliere, un&#39;aliquota, e titolare del liquido allantoico contenente IAV, e conservare a -80 ° C. Pre-titolati APR8 e X-31 virus possono essere acquistati in commercio. <ol><li> Poco prima infezione, rapidamente scongelare un&#39;aliquota IAV nelle mani guantate e poi rapidamente mettere in ghiaccio per ridurre la perdita di titolo. </li></ol></li><li> diluizione virale <ol><li> Se si utilizza il APR8 o X-31 virus, diluire a 3,3 x 10 6 uova dose infettiva 50% (DIU50) / ml in sterili, ghiacciata PBS supplemENTED con 0,25% di rosso fenolo (per aiutare nella visualizzazione) in una cappa a flusso laminare. Allo stesso tempo impostare un controllo contenente PBS sterile con il 0,25% rosso fenolo. </li><li> Se si utilizza NS1-GFP ceppo 33, diluire a ~ 1,5 x 10 2 formando la placca unità (PFU) per NL in sterile, ghiacciata PBS contenente 0,25% rosso fenolo (per aiutare nella visualizzazione) in una cappa a flusso laminare. Allo stesso tempo impostare un controllo contenente liquido allantoico da uova di gallina infette diluiti come il virus in PBS sterile con lo 0,25% rosso fenolo. </li><li> Mantenere IAV sul ghiaccio fino al momento dell&#39;uso. </li></ol></li><li> soluzione virus pipetta in aghi microiniezione utilizzando punte microloader appena prima dell&#39;uso. Inserire l&#39;ago microiniezione nel supporto adeguato dell&#39;apparato di iniezione (ad es MPPI-3 sistema di iniezione a pressione). </li><li> Durante la visualizzazione al microscopio stereo, clip delicatamente la punta dell&#39;ago microiniezione con taglienti, sterilizzato # 5 pinze. NOTA: E &#39;raccoded che la punta microiniezione essere ritagliato a poco a poco. </li><li> Premere il pedale del sistema di iniezione pressione e iniettare in una goccia di olio microscopio immersione in un vetrino micrometrico di calibrazione. Misurare il diametro della goccia. Calcolare il volume della goccia usando l&#39;equazione V = 4 / 3πr 3, dove V è il volume in nl ed r è il raggio in micron. NOTA: Se il diametro calo è troppo piccolo, vetro supplementare può essere tagliato o impostazioni di pressione e di sincronizzazione può essere regolata. Se il diametro di goccia è troppo grande, impostazioni di pressione e di temporizzazione possono essere regolati. </li><li> Regolare impostazioni di pressione e di temporizzazione sull&#39;iniettore pressione e / o Reclip la punta dell&#39;ago fino a quando il volume di iniezione desiderato si ottiene (tipicamente 1-3 nl). impostazioni di pressione tra 20 e 30 impostazioni psi e durata degli impulsi tra 40 e 80 msec sono tipici. Regolare la contropressione in modo che contrasta pressione capillare, ma non perde IAV (pressione di rete pari a zero). </li></ol></li><li> Allineare embrioni per iniezione <ol><li> Anestetizzare gli embrioni dechorionated a 200 mg / ml Tricaine. </li><li> Una volta che il movimento cessa, trasferire 10-20 embrioni ad una piastra di agarosio al 2% (preparata nella sezione 2.3) con una pipetta di plastica. Utilizzare pipetta di plastica per rimuovere il liquido in eccesso. </li><li> Allineare delicatamente embrioni per la microiniezione con un capillare fuoco lucido e vetro borosilicato sigillato. Utilizzando un microscopio stereo, embrioni delicatamente orientare in modo che il condotto di Cuvier o la vena posteriore cardinale è in linea con l&#39;ago microiniezione (Figura 1A). </li></ol></li><li> IAV microiniezione <ol><li> inserire delicatamente l&#39;ago microiniezione nel condotto di Cuvier o la vena posteriore cardinale. Premere pedale per iniettare il volume desiderato di IAV nel sistema circolatorio dell&#39;embrione (Figura 1A). Gli embrioni possono essere iniettati più di una volta, se necessario. NOTA: Il bolo iniezione deve essere travolti nella circolazione e distribbuite in tutto il corpo. Se il volume di iniezione raccoglie al sito di iniezione, rimuovere embrione da esperimento e Eutanasia. </li><li> Ripetere iniezioni su diversi embrioni con la soluzione di controllo specifica per il ceppo di virus scelti. Per APR8 e X-31, utilizzare il controllo di cui al punto 3.2.2.1; per la NS1-GFP, utilizzare il controllo di cui al punto 3.2.2.2. </li></ol></li><li> Trasferimento degli embrioni a piastre di Petri etichettati contenenti acqua uovo sterile e posto in incubatori a 33 ° C. NOTA: Infected embrioni devono essere coltivate a 33 ° C per sostenere la replicazione virale maggiore. Inoltre, l&#39;incubazione a 33 ° C imita più da vicino la temperatura del tratto respiratorio superiore umana, che è in stretto contatto con temperature più basse in ambiente esterno ed è dove si verificano infezioni IAV. Gli embrioni possono ambientarsi ad un ampio intervallo di temperature 34. </li></ol> 4. localizzato, vescica natatoria IAV infezione a Tg (mpx: mCherry) </em&gt; transgenici Zebrafish (5 giorni dopo la fecondazione) <ol><li> Preparazione di IAV per microiniezione <ol><li> Diluire la tensione e la soluzione di controllo dell&#39;iniezione NS1-GFP come descritto nella sezione 3.2. </li><li> Preparare aghi come descritto nella sezione 2.2. </li><li> Allineare Tg (mpx: mCherry) 35 larve contenente vesciche natatorie gonfiati come descritto nel paragrafo 3.3 con la seguente eccezione. Allineate larve in modo tale che l&#39;ago può forare la vescica natatoria e il virus può essere depositato nel posteriore della vescica natatoria, come precedentemente descritto 36 (Figura 2A). </li></ol></li><li> IAV microiniezione <ol><li> Inserire delicatamente l&#39;ago microiniezione nella vescica natatoria e iniettare il volume desiderato (ad esempio 5 nl) verso la parte posteriore della struttura (Figura 2A). NOTA: Il bolo iniezione deve raccogliere verso il posteriore e bolla d&#39;aria della vescica natatoria dovrebbe be spostato in avanti. espressione GFP dovrebbe iniziare ad essere osservato dopo l&#39;iniezione 3 ore. </li><li> Ripetere l&#39;iniezione con soluzione di controllo specifica per il ceppo di virus scelti, come descritto nella sezione 3.4.2. </li></ol></li><li> Trasferimento larve di piastre di Petri contenenti acqua uovo sterile e posto in incubatori a 33 ° C. </li></ol> 5. Il trattamento farmaco antivirale NOTA: Il protocollo di seguito descrive il trattamento Zanamivir precedentemente mostrato in Gabor et al. 19. Questo protocollo può essere modificato per lo screening altri farmaci antivirali e ha il potenziale per essere modificato per lo screening più composti in un piatto ben 96, formato ad alta produttività. <ol><li> A 3 ore dopo l&#39;infezione, sostituire l&#39;acqua uovo di NS1-GFP e pesce di controllo-infettati con acqua uovo sterile contenente 0, 16,7 o 33,3 ng / ml Zanamivir. NOTA: Queste concentrazioni sono state scelte in modo da tentare di replicare i livelli fisiologici raggiunti FOamministrazione llowing di Zanamivir nei pazienti umani (100, 200, o 600 mg, IV, due volte al giorno o 10 mg per via inalatoria, due volte al giorno). Le concentrazioni sieriche nei pazienti umani variava 9,83-45,3 ng / ml 36. </li><li> Nel corso di 5 giorni, cambiare l&#39;acqua uovo ogni 12 ore e sostituire con acqua uovo sterile contenente la giusta quantità di Zanamivir. </li><li> Traccia corso di infezione. <ol><li> Anestetizzare zebrafish a 200 mg / ml Tricaine. Monitorare l&#39;espressione GFP al microscopio a fluorescenza stereo per osservare visivamente differenze nei modelli di infezione tra i pesci IAV-infetti e di controllo e tra i pesci immersi nelle diverse concentrazioni di farmaci. </li><li> Traccia morbilità e mortalità nel corso di 5 giorni. <ol><li> Registra osservazioni circa le dinamiche di infezione legati alla patologia della malattia, compresi i segni di letargia e prove di edema, differenze di pigmentazione, oculare e deformità cranio-facciali, e lordosi. patologia delle malattietipicamente diventa evidente nel controllo pesci infetti in post-iniezione 24-48, a seconda della quantità di virus iniettato. Raccogliere le immagini post-iniezione 24 ore. </li><li> Ogni 24 ore per 5 giorni dopo l&#39;infezione, registrare il numero di larve morte, morbosa, e sano. La morte è definito dall&#39;assenza di un battito cardiaco discernibile. Tracciare i dati, se lo desideri. Ad esempio, i dati di scena come un grafico a barre in pila, con percentuali di pesci sani, morbosa, o morto tracciati sul l&#39;asse y e il gruppo di trattamento sul l&#39;asse x. 19 NOTA: Le mortalità possono essere segnati da stime di sopravvivenza di Kaplan-Meier. A seconda dell&#39;applicazione, può essere opportuno sviluppare approcci alternativi per la morbilità pesce di punteggio, tra cui una matrice di punteggio che può quantificare i livelli di morbilità in base alle suddette caratteristiche patologiche osservate. </li><li> Consultare uno statistico di applicare le analisi statistiche appropriate. </li></ol></li></ol></li></ol> 6. la migrazione dei neutrofili NOTA: Il protocollo di seguito descrive un metodo per il monitoraggio della migrazione dei neutrofili alla vescica natatoria a seguito di una localizzata, epiteliale infezione IAV. I metodi descritti possono essere modificati per verificare gli effetti di manipolazioni genetiche e chimiche. Usando questa tecnica, sarà possibile caratterizzare i meccanismi sottostanti comportamento neutrofili durante un&#39;infezione IAV. <ol><li> Montaggio Zebrafish per l&#39;imaging <ol><li> Anestetizzare le larve di essere ripreso in 200 mg / ml Tricaine. </li><li> Trasferire un individuo Tg (mpx: mCherry) larva che è stato infettato con NS1-GFP ad un pozzo di un 24 ben, piatto fondo di vetro in una piccola goccia d&#39;acqua uovo (~ 50-100 ml). Ripetere con altri pesci IAV-infetto e di controllo. </li><li> Lentamente aggiungere 1% mezzi di montaggio degli embrioni agarosio a ciascuna (sezione 2.5) e, facendo attenzione a non introdurre bolle di grandi dimensioni. <ol><li> Regolare delicatamente la posizione della larva modo che è montato su un lato.Goody e Henry 37 descrivono come fare le sonde che funzionano bene in questa applicazione utilizzando perni di insetti che sono montati nei capillari di vetro borosilicato con filamenti e superglued a posto. </li></ol></li><li> Una volta che l&#39;agarosio si indurisce, riempire delicatamente i singoli pozzi con acqua uovo contenente 200 mg / ml Tricaine. </li><li> Con un microscopio confocale, cattura az serie pila di immagini campo chiaro e fluorescenza utilizzando un obiettivo 20X incentrata sulla vescica natatoria. <ol><li> Impostare i limiti superiore ed inferiore in modo che catturano tutti visibilmente osservabile fluorescenza verde e rosso. </li><li> catturare immagini a 2.0 msec / pixel con passaggi che sono ≤ 4 micron. Aumentare il tempo per pixel e di ridurre la distanza tra i passaggi (ad esempio 0,5-1,0 micron) aumenta la risoluzione dell&#39;immagine e la qualità. </li><li> Generare una immagine bidimensionale unendo strati. </li><li> Confrontare il numero di neutrofili MPX-mCherry-positive presenti in le vesciche natatorie di IAV-infetti e di controllo a iniezione zebrafish. </li></ol></li></ol></li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Per massimizzare i benefici ottenuti dall&#39;utilizzo di un piccolo animale di modellare interazioni ospite-patogeno umano, è importante per inquadrare domande di ricerca e ipotesi di test che capitalizzare i vantaggi intrinseci del sistema modello. Come modello per l&#39;infezione IAV umana, il pesce zebra ha diversi punti di forza, tra cui ad alta fecondità, chiarezza ottica, subordinazione al vaglio di farmaci, e la disponibilità di linee transgeniche che etichetta le cellule immunitarie come neutrofili. Il zebrafis...

Secondo l&#39;Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS), i virus influenzali infettano il 5-10% degli adulti e il 20-30% dei bambini ogni anno e causano 3-5 milioni di casi di malattie gravi e fino a 500.000 morti in tutto il mondo 1. vaccinazioni annuali contro l&#39;influenza rimangono l&#39;opzione migliore per prevenire la malattia. Gli sforzi come il piano d&#39;azione globale che hanno aumentato l&#39;uso vaccino stagionale, la capacità di produzione di vaccini, e la ricerca e lo sviluppo in più potenti strategie vaccinali al fine di ridurre la morbilità e la mortalità associate con focolai di influenza stagionale 2. I farmaci antivirali come gli inibitori della neuraminidasi (ad esempio Zanamivir e Oseltamivir) sono disponibili in alcuni paesi e si sono dimostrati efficaci nei sintomi attenuanti, quando somministrato entro le prime 48 ore di insorgenza 3, 4, 5. Nonostante gli sforzi a livello mondiale, il contenimento dell&#39;influenza stagionale outbreaks rimane una sfida formidabile in questo momento, come virus dell&#39;influenza deriva antigenica spesso supera capacità attuali di adattarsi al cambiamento genoma del virus 6. strategie vaccinali di targeting di nuovi ceppi di virus devono essere sviluppate in anticipo e sono a volte resi meno di ottimale efficace a causa di cambiamenti imprevisti nei tipi di ceppi che alla fine predominano in una stagione influenzale. Per queste ragioni, vi è una chiara necessità di sviluppare strategie terapeutiche alternative per contenere le infezioni e riducendo la mortalità. Con il raggiungimento di una migliore comprensione delle interazioni ospite-virus, potrebbe essere possibile sviluppare nuovi farmaci anti-influenzali e terapie adiuvanti 7, 8. L&#39;host-influenza umana A interazione virus (IAV) è complessa. Diversi modelli animali di infezione umana IAV sono stati sviluppati in modo da ottenere una visione in l&#39;interazione ospite-virus, inclusa,ing topi, cavie, ratti, criceti cotone, furetti e macachi 9. Oltre a fornire dati importanti che hanno migliorato la comprensione delle dinamiche di accoglienza-IAV, ogni organismo modello possiede svantaggi significativi che devono essere considerati quando si tenta di tradurre le scoperte in medicina umana. Ad esempio, i topi, che sono il modello più diffuso, non facilmente sviluppano sintomi di infezione IAV-indotte quando infettati con il virus dell&#39;influenza umana isolati 9. Questo perché i topi non hanno il trofismo naturale per l&#39;influenza umana isolati da cellule epiteliali del mouse esprimono alfa-2,3 legami acido sialico invece delle α-2,6 collegamenti acido sialico espressi sulle cellule epiteliali umane 10. Le proteine emoagglutinina presenti in IAV ceppi umani favorevolmente legano ed entrano cellule ospiti cuscinetto legami alfa-2,6 acido sialico attraverso endocitosi mediata dai recettori 9, 11, </sup&gt; 12, 13. Di conseguenza, è ormai accettato che nello sviluppo di modelli murini per l&#39;influenza umana, la cura deve essere presa per abbinare la tensione appropriata del mouse con il ceppo di influenza appropriata al fine di ottenere fenotipi di malattia che ricapitolano aspetti della malattia umana. In contrasto, cellule epiteliali del tratto respiratorio superiore furetti possiedono alfa-2,6 legami di acido sialico che assomigliano cellule umane 14. Furetti infetti condividono molte delle caratteristiche patologiche e cliniche osservate nella malattia umana, compresa la patogenicità e trasmissibilità del virus 14 di influenza umana e aviaria, 15. Essi sono anche altamente suscettibili di prove di efficacia del vaccino. Tuttavia, il modello furetto per l&#39;influenza umana ha diversi svantaggi principalmente legati alla loro dimensione e il costo di allevamento che fanno acquisizione di statisticamente signifidati sopraelevazione impegnativi. Inoltre, furetti hanno già mostrato differenze nella farmacocinetica di droga, la biodisponibilità e tossicità che rendono l&#39;efficacia di prova difficile. Ad esempio, i furetti presentano tossicità per il canale ionico M2 amantadina inibitore 16. Pertanto, è chiaro che nella scelta di un modello animale per studiare domande circa infezioni IAV umani, è importante considerare vantaggi e limiti intrinseci, e l&#39;aspetto della interazione ospite-virus che è indagato. Il zebrafish, Danio rerio, è un modello animale che fornisce opportunità uniche per studiare l&#39;infezione microbica, ospiterà la risposta immunitaria, e potenziali terapie farmacologiche 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, &lt;class = sup &quot;xref&quot;&gt; 24, 25, 26, 27, 28. La presenza di acidi sialici α-2,6-legate sulla superficie delle cellule nel zebrafish suggerito la sua suscettibilità al IAV, che è stata confermata in studi infezione e ripreso in vivo utilizzando un ceppo reporter fluorescente di IAV 19. In zebrafish IAV-infetti, un aumento dell&#39;espressione dei antivirali ifnphi1 e MXA trascrizioni indicato che una risposta immunitaria innata era stato stimolato, e la patologia visualizzato da zebrafish IAV-infettati, incluso edema e la distruzione dei tessuti, era simile a quella osservata nelle infezioni influenzali umani . Inoltre, la IAV inibitore della neuraminidasi antivirali Zanamivir mortalità limitata e ridotta la replicazione virale in zebrafish 19. In questo rapporto, un protocollo per l&#39;avvio del sistemainfezioni ic IAV in embrioni di zebrafish è descritto. Utilizzando Zanamivir a dosi clinicamente rilevanti come una prova di principio, è dimostrata l&#39;utilità di questo zebrafish modello di infezione IAV per i composti di screening per l&#39;attività antivirale. Inoltre, un protocollo per la generazione di un localizzata, epiteliale infezione IAV nel zebrafish nuotare vescica, un organo che è considerato anatomicamente e funzionalmente analogo al polmone mammiferi 21, 29, 30, 31, è descritto. Usando questo modello di infezione IAV localizzata, il reclutamento dei neutrofili al sito di infezione possono essere monitorati, consentendo indagini il ruolo della biologia dei neutrofili nelle infezioni IAV e l&#39;infiammazione. Questi modelli zebrafish integrano modelli animali esistenti di infezioni IAV umane e sono particolarmente utili per testare piccole molecole e le risposte delle cellule immunitarie a causa della possibilità di una maggiore spotere Istituti statistici, capacità di moderata a test high-throughput, e le capacità per monitorare il comportamento delle cellule immunitarie e la funzione di luce-microscopia.

<table><tbody><tr><td>Instant Ocean</td><td>Spectrum Brands</td><td>SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri monouso sterili da 100 mm x 25 mm&nbsp;</td><td>VWR</td><td>89107-632</td><td></td></tr><tr><td>Pipette di trasferimento&nbsp;</td><td>Fisherbrand</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine-S (MS-222)</td><td>Capillare in</td> vetro borosilicato chimico <td></td><td></td>occidentale</tr><tr><td>con filamento&nbsp;</td><td>Strumento Sutter&nbsp;</td><td>BF120-69-10</td><td></td></tr><tr><td>Estrattore per micropipette fiammante/marrone&nbsp;</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>Zanamivir</td><td>AK Scientific</td><td>G939</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 pincipe</td><td>Microscopia elettronica Scienze</td><td>72700-D</td><td></td></tr><tr><td>Punte per microloader</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>Olio da immersione per microscopio</td><td>Olympus</td><td>IMMOIL-F30CC</td><td></td></tr><tr><td>Vetrino di calibrazione del tavolino per microscopio&nbsp;</td><td>AmScope</td><td>MR095</td><td></td></tr><tr><td>MPPI-3 iniettore di pressione&nbsp;</td><td>Strumentazione scientifica applicata Stereomicroscopio</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>Unità di contropressione</td><td>Strumentazione scientifica applicata Kit</td><td></td> porta micropipette BPU <td></td></tr><tr><td></td><td>Strumentazione scientifica applicata</td><td>Interruttore</td> a pedale MPIP <td></td></tr><tr><td></td><td>Strumentazione scientifica applicata</td> Micromanipolatore <td>FSW</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Strumentazione Scientifica Applicata</td><td>MM33</td><td></td></tr><tr><td>Base Magnetica</td><td>Strumentazione Scientifica Applicata</td><td>Base Magnetica</td><td></td></tr><tr><td>Rosso Fenolo&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>P-4758</td><td></td></tr><tr><td>Incubatrice a bassa temperatura</td><td>VWR</td><td>2020</td><td></td></tr><tr><td>SteREO Discovery.V12</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Illuminator</td><td>Zeiss</td><td>HXP 200C</td><td></td></tr><tr><td>Sorgente di luce fredda</td><td>Zeiss</td><td>CL6000 LED</td><td></td></tr><tr><td>Piastra multipozzetto con fondo in vetro, 24 pozzetti</td><td>Mattek</td><td>P24G-0-13-F</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale</td><td>Olympus</td><td>IX-81 con sistema confocale a scansione laser FV-1000</td> Software Fluoview Olympus Prism v6 GraphPad Influenza A/PR/8/34 (H1N1) virus&nbsp;<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Charles River&nbsp;</td><td>490710</td><td></td></tr><tr><td>Influenza A X-31, A/Aichi/68 (H3N2)&nbsp;</td><td>Charles River&nbsp;</td><td></td><td></td>490715</tr><tr><td>Influenza NS1-GFP</td><td></td><td></td><td>Referenziato in Manicassamia et al. 2010</td></tr><tr><td>Tg(mpx:mCherry)</td><td></td><td></td><td>Citato in Lam et al. 2013</td></tr></tbody></table>

utilizzando modelli di zebrafish di umana virus infezioni allo schermo farmaci antivirali e caratterizzare host immune cellulo risposte

Using Zebrafish Models of Human Influenza A Virus Infections to Screen Antiviral Drugs and Characterize Host Immune Cell Responses

Ogni anno, le epidemie di influenza stagionale influenzano profondamente le società di tutto il mondo. Nonostante gli sforzi globali, l'influenza rimane un onere sanitario intrattabile. La strategia principale per ridurre le infezioni è la vaccinazione annuale. Nei soggetti che hanno contratto l'influenza, i farmaci antivirali possono mitigare i sintomi. C'è una chiara e insoddisfatta necessità di sviluppare strategie alternative per combattere l'influenza. Diversi modelli animali sono stati creati per modellare le interazioni ospite-influenza. Qui vengono descritti i protocolli per la generazione di modelli di zebrafish per l'infezione sistemica e localizzata da virus dell'influenza umana A (IAV). Utilizzando un modello di infezione sistemica da IAV, è possibile eseguire lo screening di piccole molecole con potenziale attività antivirale. Come prova di principio, viene descritto un protocollo che dimostra l'efficacia del farmaco antivirale Zanamivir nel pesce zebra infetto da IAV. Mostra come i fenotipi della malattia possano essere quantificati per valutare l'efficacia relativa di potenziali antivirali nel pesce zebra infetto da IAV. Negli ultimi anni, c'è stato un crescente apprezzamento per il ruolo critico che i neutrofili svolgono nella risposta dell'ospite umano all'infezione influenzale. Il pesce zebra ha dimostrato di essere un modello indispensabile per lo studio della biologia dei neutrofili, con impatti diretti sulla medicina umana. Viene descritto un protocollo per generare un'infezione localizzata da IAV nella linea di pesce zebra Tg(mpx:mCherry) per studiare la biologia dei neutrofili nel contesto di un'infezione virale localizzata. Il reclutamento di neutrofili in siti di infezione localizzati fornisce un ulteriore fenotipo quantificabile per valutare manipolazioni sperimentali che possono avere applicazioni terapeutiche. Entrambi i protocolli di zebrafish descritti ricapitolano fedelmente gli aspetti dell'infezione umana da IAV. Il modello di zebrafish possiede numerosi vantaggi intrinseci, tra cui l'elevata fecondità, la chiarezza ottica, l'adattabilità allo screening farmacologico e la disponibilità di linee transgeniche, comprese quelle in cui le cellule immunitarie come i neutrofili sono marcate con proteine fluorescenti. I protocolli qui descritti sfruttano questi vantaggi e hanno il potenziale per rivelare intuizioni critiche sulle interazioni ospite-IAV che potrebbero alla fine tradursi nella clinica.

Qui, vengono forniti dati che dimostrano come infezioni sistemiche IAV in zebrafish può essere utilizzato per testare l&#39;efficacia dei farmaci (Figura 1A). Embrioni a 48 ore post-fertilizzazione sono iniettati con APR8 (figure 1C, 1F), X-31 (figure 1D, 1G), o NS1-GFP (Figure 1H-1I) attraverso il condotto di Cuvier di avviare una infezione virale. Un altro coorte di embrioni a 48 ore post-fertilizzazione sono stati ini...

Vengono dimostrati modelli di infezione sistemica e localizzata da zebrafish per il virus dell'influenza umana A. Utilizzando un modello di infezione sistemica, il pesce zebra può essere utilizzato per lo screening di farmaci antivirali. Utilizzando un modello di infezione localizzata, il pesce zebra può essere utilizzato per caratterizzare le risposte delle cellule immunitarie dell'ospite.

Utilizzando modelli di Zebrafish di umana virus infezioni allo schermo farmaci antivirali e caratterizzare host immune cellulo Risposte

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare ...

Gli obiettivi generali di queste procedure sono utilizzare il pesce zebra come modello per l'influenza allo scopo di studiare la risposta immunitaria dell'ospite all'infezione virale e di eseguire lo screening di composti antivirali. Questi metodi possono contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'influenza, come il ruolo dei fagociti nell'immunità e nell'infiammazione durante un'infezione e l'efficacia di potenziali terapie antivirali. Un modello di influenza nel pesce zebra permette di affrontare domande rimaste in sospeso in precedenza, grazie alla trasparenza ottica degli stadi di sviluppo del pesce zebra e alla possibilità di eseguire saggi a media o alta capacità.Dopo aver preparato i reagenti e aver coltivato gli embrioni fino allo stadio desiderato seguendo il protocollo descritto nel testo, nel giorno dell'esperimento utilizzare pinzette numero cinque per rimuovere la coriona dagli embrioni. Se si utilizzano i virus APR-8 o X31, in una cappa a flusso laminare diluire i virus a 3,3 × 10⁶ dose infettiva per uovo 50 percento (EID₅₀) in PBS sterile freddo su ghiaccio, integrato con lo 0,25 percento di rosso fenolo. Se si utilizza il ceppo NS1-GFP, diluire il virus a circa 1,5 × 10² PFU per nanolitro.Nello stesso tempo, preparare un controllo contenente liquido allantocoico proveniente da uova di pollo non infette, diluito in modo analogo al virus. Quindi, utilizzando punte microloader, pipettare la soluzione virale nelle microcapillari per microiniezione e inserire la microcapillare nell'apposito supporto dell'apparato di iniezione. Dopo aver tagliato la punta della capillare secondo il protocollo descritto nel testo, regolare le impostazioni di pressione e temporizzazione sul microinjector e/o ritagliare nuovamente la punta della capillare finché non si raggiunge il volume di iniezione desiderato.Dopo aver anestetizzato gli embrioni, utilizzare una pipetta di plastica per trasferire da 10 a 20 embrioni su una piastra di agarosio al due percento ed eseguire una pipettaggio per rimuovere il liquido in eccesso. Sotto il microscopio stereoscopico, utilizzare una capillare di vetro borosilicato lucidata a fuoco e sigillata per allineare e orientare delicatamente gli embrioni in modo che il dotto di Cuvier o la vena cardinale posteriore siano allineati con l'ago di microiniezione. Per eseguire la microiniezione di IAV, inserire delicatamente l'ago di microiniezione nel dotto di Cuvier o nella vena cardinale posteriore.Quindi, premere il pedale con il piede per iniettare il volume desiderato di IAV nel sistema circolatorio dell'embrione. Per ottenere un'infezione sistemica, è fondamentale che il bolo iniettato venga trascinato nella circolazione e distribuito in tutto il corpo. Se il bolo si accumula nel sito di iniezione, rimuovere l'embrione dall'esperimento ed eutanasizzarlo.Cinque giorni dopo la fecondazione, preparare le siringhe come descritto in precedenza in questo video. Allineare i larve TG MPX mCherry contenenti vesciche natatorie gonfie come appena dimostrato, posizionando però i larvi in modo che l'ago possa perforare la vescica natatoria e il virus possa essere depositato nella parte posteriore della stessa. Inserire delicatamente l'ago di microiniezione nella vescica natatoria e iniettare il volume desiderato verso la regione posteriore dell'organo.La soluzione di iniezione dovrebbe accumularsi nella parte posteriore e la bolla d'aria della vescica natatoria dovrebbe essere spostata in avanti. Per ottenere un'infezione della vescica natatoria, è fondamentale che il bolo iniettato si accumuli nella parte posteriore della vescica natatoria, causando lo spostamento in avanti della bolla d'aria. L'espressione di GFP dovrebbe iniziare a essere osservata già da tre ore dopo l'iniezione.Dopo aver completato le iniezioni, inclusa quella con soluzioni di controllo, trasferire le larve in piastre di Petri contenenti acqua sterile per uova e incubare i pesci a 33 gradi Celsius. Per effettuare il trattamento con farmaci antivirali, a tre ore dall'infezione, sostituire l'acqua per uova dei pesci infettati con NS1-GFP e dei controlli con acqua sterile contenente 0, 16,7 o 33,3 nanogrammi per millilitro di Zanamivir. A partire da 24 a 48 ore dopo l'iniezione, iniziare a registrare osservazioni sulle dinamiche dell'infezione relative alla patologia della malattia, inclusi segni di letargia ed evidenze di edema, differenze nella pigmentazione, deformità oculari e facciali craniche e lordosi.Ogni 24 ore per cinque giorni dopo l'infezione, registrare il numero di larve morte, malate e sane. Riportare i dati in un grafico a barre sovrapposte con le percentuali di pesci sani, malati o morti sull'asse Y e il gruppo di trattamento sull'asse X. Per montare i zebrafish per l'analisi di imaging, trasferire una singola larva transgenica MPX mCherry infettata con NS1-GFP in una pozzetta di una piastra da 24 pozzette con fondo in vetro e aggiungere una piccola goccia di acqua per uova.Ripetere con altri pesci infettati dal virus dell'influenza A e pesci di controllo. Aggiungere lentamente il mezzo di montaggio per embrioni al 1% in agarosio in ciascun pozzetto, avendo cura di non introdurre bolle di grandi dimensioni. Regolare delicatamente la posizione della larva in modo che ciascuna venga montata di lato.Una volta che l'agarosio si è solidificato, utilizzare acqua per uova contenente 200 microgrammi per litro di tricaina per riempire delicatamente le singole pozzette. Con un microscopio confocale e un obiettivo da 20 volte focalizzato sulla vescica natatoria, acquisire una serie di immagini in campo chiaro e in fluorescenza in modalità z stack. Quantificare e confrontare il numero di neutrofili positivi per MPX mCherry presenti nelle vesciche natatorie dei zebrafish infettati con IAV e di quelli iniettati come controllo.Qui vengono mostrati dati che rappresentano come l'infezione sistemica da IAV nel pesce zebra possa essere utilizzata per testare l'efficacia di farmaci. Gli embrioni a 48 HPF sono stati iniettati con APR8, X31 o NS1-GFP attraverso il dotto di Cuvier per indurre un'infezione virale. Gli embrioni utilizzati come controlli per l'infezione virale sono stati iniettati a 48 HPF.A 48 ore post-infezione, i zebrafish inoculati con IAV hanno mostrato segni di edema pericardico e arresto circolatorio, con eritrociti presenti in tutta la cavità pericardica. I pesci infettati non esposti alla zanamivir hanno manifestato segni di edema nell'espressione sistemica di GFP. Una riduzione della patologia macroscopica nell'espressione di GFP è stata osservata nei larve infettate con NS1-GFP e trattate con zanamivir.In questo esperimento di un modello localizzato di infezione della vescica natatoria nel pesce zebra, il virus NS1-GFP è stato iniettato nella vescica natatoria di larve transgeniche MPX mCherry a cinque giorni dalla fecondazione e il reclutamento di neutrofili marcati con mCherry nella vescica natatoria è stato monitorato. A 20 ore dall'infezione, è stata osservata una migrazione considerevole di neutrofili nella vescica natatoria dei pesci infettati con IAV rispetto ai controlli iniettati con PBS, indicando che l'IAV è in grado di reclutare neutrofili nella vescica natatoria, proprio come recluta neutrofili nel polmone umano. Le implicazioni di queste tecniche si estendono alle terapie antivirali poiché hanno il potenziale di rivelare informazioni fondamentali sulle interazioni tra l'ospite e il virus dell'influenza di tipo A (IAV) che potrebbero in ultima analisi tradursi in applicazioni cliniche.Non dimenticare che lavorare con l'influenza può essere estremamente pericoloso e che è sempre necessario adottare precauzioni, tra cui la vaccinazione e l'uso dei dispositivi di protezione individuale (DPI) appropriati, durante l'esecuzione di questa procedura.

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