Utilizzando modelli di Zebrafish di umana virus infezioni allo schermo farmaci antivirali e caratterizzare host immune cellulo Risposte

Gli obiettivi generali di queste procedure sono utilizzare il pesce zebra come modello per l'influenza allo scopo di studiare la risposta immunitaria dell'ospite all'infezione virale e di eseguire lo screening di composti antivirali. Questi metodi possono contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'influenza, come il ruolo dei fagociti nell'immunità e nell'infiammazione durante un'infezione e l'efficacia di potenziali terapie antivirali. Un modello di influenza nel pesce zebra permette di affrontare domande rimaste in sospeso in precedenza, grazie alla trasparenza ottica degli stadi di sviluppo del pesce zebra e alla possibilità di eseguire saggi a media o alta capacità.

Dopo aver preparato i reagenti e aver coltivato gli embrioni fino allo stadio desiderato seguendo il protocollo descritto nel testo, nel giorno dell'esperimento utilizzare pinzette numero cinque per rimuovere la coriona dagli embrioni. Se si utilizzano i virus APR-8 o X31, in una cappa a flusso laminare diluire i virus a 3,3 × 10⁶ dose infettiva per uovo 50 percento (EID₅₀) in PBS sterile freddo su ghiaccio, integrato con lo 0,25 percento di rosso fenolo. Se si utilizza il ceppo NS1-GFP, diluire il virus a circa 1,5 × 10² PFU per nanolitro.

Nello stesso tempo, preparare un controllo contenente liquido allantocoico proveniente da uova di pollo non infette, diluito in modo analogo al virus. Quindi, utilizzando punte microloader, pipettare la soluzione virale nelle microcapillari per microiniezione e inserire la microcapillare nell'apposito supporto dell'apparato di iniezione. Dopo aver tagliato la punta della capillare secondo il protocollo descritto nel testo, regolare le impostazioni di pressione e temporizzazione sul microinjector e/o ritagliare nuovamente la punta della capillare finché non si raggiunge il volume di iniezione desiderato.

Dopo aver anestetizzato gli embrioni, utilizzare una pipetta di plastica per trasferire da 10 a 20 embrioni su una piastra di agarosio al due percento ed eseguire una pipettaggio per rimuovere il liquido in eccesso. Sotto il microscopio stereoscopico, utilizzare una capillare di vetro borosilicato lucidata a fuoco e sigillata per allineare e orientare delicatamente gli embrioni in modo che il dotto di Cuvier o la vena cardinale posteriore siano allineati con l'ago di microiniezione. Per eseguire la microiniezione di IAV, inserire delicatamente l'ago di microiniezione nel dotto di Cuvier o nella vena cardinale posteriore.

Quindi, premere il pedale con il piede per iniettare il volume desiderato di IAV nel sistema circolatorio dell'embrione. Per ottenere un'infezione sistemica, è fondamentale che il bolo iniettato venga trascinato nella circolazione e distribuito in tutto il corpo. Se il bolo si accumula nel sito di iniezione, rimuovere l'embrione dall'esperimento ed eutanasizzarlo.

Cinque giorni dopo la fecondazione, preparare le siringhe come descritto in precedenza in questo video. Allineare i larve TG MPX mCherry contenenti vesciche natatorie gonfie come appena dimostrato, posizionando però i larvi in modo che l'ago possa perforare la vescica natatoria e il virus possa essere depositato nella parte posteriore della stessa. Inserire delicatamente l'ago di microiniezione nella vescica natatoria e iniettare il volume desiderato verso la regione posteriore dell'organo.

La soluzione di iniezione dovrebbe accumularsi nella parte posteriore e la bolla d'aria della vescica natatoria dovrebbe essere spostata in avanti. Per ottenere un'infezione della vescica natatoria, è fondamentale che il bolo iniettato si accumuli nella parte posteriore della vescica natatoria, causando lo spostamento in avanti della bolla d'aria. L'espressione di GFP dovrebbe iniziare a essere osservata già da tre ore dopo l'iniezione.

Dopo aver completato le iniezioni, inclusa quella con soluzioni di controllo, trasferire le larve in piastre di Petri contenenti acqua sterile per uova e incubare i pesci a 33 gradi Celsius. Per effettuare il trattamento con farmaci antivirali, a tre ore dall'infezione, sostituire l'acqua per uova dei pesci infettati con NS1-GFP e dei controlli con acqua sterile contenente 0, 16,7 o 33,3 nanogrammi per millilitro di Zanamivir. A partire da 24 a 48 ore dopo l'iniezione, iniziare a registrare osservazioni sulle dinamiche dell'infezione relative alla patologia della malattia, inclusi segni di letargia ed evidenze di edema, differenze nella pigmentazione, deformità oculari e facciali craniche e lordosi.

Ogni 24 ore per cinque giorni dopo l'infezione, registrare il numero di larve morte, malate e sane. Riportare i dati in un grafico a barre sovrapposte con le percentuali di pesci sani, malati o morti sull'asse Y e il gruppo di trattamento sull'asse X. Per montare i zebrafish per l'analisi di imaging, trasferire una singola larva transgenica MPX mCherry infettata con NS1-GFP in una pozzetta di una piastra da 24 pozzette con fondo in vetro e aggiungere una piccola goccia di acqua per uova.

Ripetere con altri pesci infettati dal virus dell'influenza A e pesci di controllo. Aggiungere lentamente il mezzo di montaggio per embrioni al 1% in agarosio in ciascun pozzetto, avendo cura di non introdurre bolle di grandi dimensioni. Regolare delicatamente la posizione della larva in modo che ciascuna venga montata di lato.

Una volta che l'agarosio si è solidificato, utilizzare acqua per uova contenente 200 microgrammi per litro di tricaina per riempire delicatamente le singole pozzette. Con un microscopio confocale e un obiettivo da 20 volte focalizzato sulla vescica natatoria, acquisire una serie di immagini in campo chiaro e in fluorescenza in modalità z stack. Quantificare e confrontare il numero di neutrofili positivi per MPX mCherry presenti nelle vesciche natatorie dei zebrafish infettati con IAV e di quelli iniettati come controllo.

Qui vengono mostrati dati che rappresentano come l'infezione sistemica da IAV nel pesce zebra possa essere utilizzata per testare l'efficacia di farmaci. Gli embrioni a 48 HPF sono stati iniettati con APR8, X31 o NS1-GFP attraverso il dotto di Cuvier per indurre un'infezione virale. Gli embrioni utilizzati come controlli per l'infezione virale sono stati iniettati a 48 HPF.

A 48 ore post-infezione, i zebrafish inoculati con IAV hanno mostrato segni di edema pericardico e arresto circolatorio, con eritrociti presenti in tutta la cavità pericardica. I pesci infettati non esposti alla zanamivir hanno manifestato segni di edema nell'espressione sistemica di GFP. Una riduzione della patologia macroscopica nell'espressione di GFP è stata osservata nei larve infettate con NS1-GFP e trattate con zanamivir.

In questo esperimento di un modello localizzato di infezione della vescica natatoria nel pesce zebra, il virus NS1-GFP è stato iniettato nella vescica natatoria di larve transgeniche MPX mCherry a cinque giorni dalla fecondazione e il reclutamento di neutrofili marcati con mCherry nella vescica natatoria è stato monitorato. A 20 ore dall'infezione, è stata osservata una migrazione considerevole di neutrofili nella vescica natatoria dei pesci infettati con IAV rispetto ai controlli iniettati con PBS, indicando che l'IAV è in grado di reclutare neutrofili nella vescica natatoria, proprio come recluta neutrofili nel polmone umano. Le implicazioni di queste tecniche si estendono alle terapie antivirali poiché hanno il potenziale di rivelare informazioni fondamentali sulle interazioni tra l'ospite e il virus dell'influenza di tipo A (IAV) che potrebbero in ultima analisi tradursi in applicazioni cliniche.

Non dimenticare che lavorare con l'influenza può essere estremamente pericoloso e che è sempre necessario adottare precauzioni, tra cui la vaccinazione e l'uso dei dispositivi di protezione individuale (DPI) appropriati, durante l'esecuzione di questa procedura.