Tandem Affinity Purification di complessi proteici da cellule eucariotiche
January 26th, 2017
Descriviamo qui un nuovo, robusto ed efficiente metodo di purificazione di affinità tandem (TAP) per l'espressione, l'isolamento e la caratterizzazione di complessi proteici da cellule eucariotiche. Questo protocollo potrebbe essere utilizzato per la caratterizzazione biochimica di complessi discreti e per l'identificazione di nuovi interattori e modificazioni post-traduzionali che ne regolano la funzione.
L'obiettivo generale di questo metodo di purificazione ad affinità tandem è quello di isolare complessi proteici espressi da cellule eucariotiche per la caratterizzazione biochimica e gli assemblaggi molecolari e l'identificazione di nuovi interattori e modifiche post-traduzionali che regolano la loro funzione. Questo metodo rende possibile la purificazione di complessi proteici intatti da cellule eucariotiche, per identificare nuovi interattori e modificazioni regolatorie post-traduzionali che ne regolano la funzione. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente un'elevata purezza e resa di complessi proteici per applicazioni in vitro a valle per studiarne la funzione e l'attività.
Le cellule vengono raccolte dalla purificazione per affinità STREP 48 ore dopo la trasfezione. Rimuovere il supporto e aggiungere otto millilitri di PBS freddo. Pipettare su e giù per staccare le cellule dalla piastra.
Raccogliere e trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 millilitri e far girare le cellule a 800 volte g per quattro minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere il surnatante PBS. Centrifugare a 800 volte g per un minuto a quattro gradi Celsius per eliminare eventuali residui di PBS.
Per iniziare questa procedura, risospendere ogni pellet cellulare in cinque volte il volume del pellet cellulare del tampone di lisi passiva, o PLB. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Agitare brevemente la sospensione e nutire per 30 minuti a quattro gradi Celsius.
Far girare la sospensione cellulare a 10.000 volte g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire il lisato solubile in una nuova provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri e scartare il pellet cellulare. Conservare il 10% del volume finale del lisato solubile come input STREP-AP e conservarlo a quattro gradi Celsius.
È importante utilizzare le perle STREP per la prima fase di purificazione dell'affinità perché i complessi tirati verso il basso con le perle STREP recuperano significativamente più proteine rispetto a quelli tirati giù con le perle FLAG. Utilizzando una punta per pipetta a bocca larga, rimuovere la quantità appropriata di liquame di perle STREP al 50% per la purificazione dell'affinità. Centrifugare a 1.500 volte g per due minuti a quattro gradi Celsius.
Rimuovere il surnatante e aggiungere 500 microlitri di PLB alle perline. Nutare la miscela di perline per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Gira di nuovo verso il basso.
Dopo il terzo lavaggio, rimuovere il surnatante e risospendere le perle in PLB fino a un volume finale di n volte 40 microlitri, dove n è il numero di campioni. Aggiungere 40 microlitri di impasto perlato STREP al 50% a ciascun campione di lisato cellulare e nutato per due ore a quattro gradi Celsius. Durante questa produzione e recupero di proteine possono essere utilizzate più piastre di cellule e gli stessi campioni di proteine lisati da piastre diverse possono essere combinati con una porzione di perle durante la purificazione per affinità STREP.
Dopo che il lisato cellulare e le miscele di liquami di perle STREP sono state incubate per due ore, centrifugarle a 1.500 volte g per due minuti a quattro gradi Celsius. Conservare il surnatante mentre STREP AP scorre e conservarlo a quattro gradi Celsius. Aggiungere 500 microlitri di tampone di lavaggio STREP AP one alle perline.
Nutare le perle in una miscela tampone per cinque minuti a quattro gradi Celsius e centrifugare a 1.500 volte g per due minuti a quattro gradi Celsius. Scartare il surnatante e lavare nuovamente con 500 microlitri di tampone di lavaggio STREP AP. Dopo il terzo lavaggio, trasferire la soluzione di microsfere in una nuova provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri per ridurre lo sfondo proteico.
Lavare una quarta volta con il tampone di lavaggio STREP AP uno. Dopo la centrifuga, rimuovere il surnatante e aggiungere 500 microlitri di burro lavato due. Equilibrare le perle capovolgendo i tubi e poi centrifugare a 1.500 volte g per due minuti a quattro gradi Celsius.
Scartare il surnatante. Eluire la proteina di interesse con 50 microlitri di tampone di eluizione STREP. Vortice a 800 giri/min per 15 minuti a quattro gradi Celsius.
Centrifugare le perline a 1.500 volte g per un minuto a quattro gradi Celsius. Raccogli il surnatante. Questa frazione corrisponde al campione di eluizione STREP AP.
Conservare la frazione di perle a quattro gradi Celsius per una seconda eluizione. Aliquotare il 10% dell'eluizione STREP AP per la colorazione con argento e/o Western blotting. Per aumentare la quantità di materiale di partenza per la successiva immunoprecipitazione FLAG, la prima e la seconda eluizione STREP possono essere raggruppate per un recupero più efficiente dell'eluizione FLAG.
Iniziare questa procedura utilizzando un puntale per pipetta a bocca larga per trasferire la quantità appropriata di soluzione di perline FLAG in una provetta per microcentrifuga. Centrifugare a 1.500 volte g per due minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere il surnatante e aggiungere 500 microlitri di tampone di lavaggio FLAG alle perline.
Centrifugare a 1.500 volte g per due minuti a quattro gradi Celsius. Eliminare il surnatante e lavare nuovamente con il tampone di lavaggio FLAG. Dopo il terzo lavaggio, rimuovere il surnatante e risospendere le perle nel tampone di lavaggio FLAG fino a un volume finale di n volte 16 microlitri, dove n è il numero di campioni.
Aggiungere 16 microlitri di liquame di perle FLAG all'eluizione STREP AP rimanente e nutare per una notte a quattro gradi Celsius. Dopo un'incubazione notturna dell'impasto di perle FLAG e dell'eluizione STREP AP, procedere con l'immunoprecipitazione FLAG. Abbassa la sospensione del tallone FLAG a 1.500 volte g per due minuti a quattro gradi Celsius.
Salvare il surnatante durante il flusso IP FLAG e memorizzarlo a quattro gradi Celsius. Aggiungere 500 microlitri di tampone di lavaggio FLAG alle perline. Nutare per cinque minuti a quattro gradi Celsius e centrifugare a 1.500 volte g per due minuti a quattro gradi Celsius.
Eliminare il surnatante e lavare nuovamente con 500 microlitri di tampone di lavaggio FLAG. Dopo il terzo lavaggio, trasferire la soluzione di perline proteiche in una nuova provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri per ridurre lo sfondo. Lavare una quarta volta con il tampone di lavaggio FLAG.
Rimuovere il surnatante dalla centrifuga finale e aggiungere alle perle 30 microlitri di tampone di lavaggio FLAG contenente 200 nanogrammi per microlitro di peptide FLAG. Vortice a 800 giri/min per due ore a quattro gradi Celsius. Dopo due ore, far girare la sospensione a 1.500 volte g per due minuti a quattro gradi Celsius.
Raccogliere il surnatante e conservarlo a quattro gradi Celsius come eluizione IP FLAG. In questo video, la purificazione di affinità Tandem, o metodo TAP, è stata applicata al complesso Cyclin-T1 CDK9. La ciclina-T1 marcata STREP e la CKD9 marcata con FLAG erano sovraespresse nelle cellule T HEK293.
È stato inoltre eseguito un esperimento reciproco con CDK9 marcato STREP e Cyclin-T1 marcato con FLAG. L'analisi del western blot mostra che CKD9 marcato FLAG coeluito con Ciclina-T1 marcata STREP dalle perle STREP, ma non nel controllo negativo, AP privo di STREP marcato Ciclina-T1. Entrambe le proteine sono state rilevate nell'eluizione FLAG, che ha ulteriormente confermato la formazione del complesso.
I risultati reciproci di TAP mostrano che la ciclina-T1 marcata con FLAG è coeluita con CDK9 marcata con STREP, convalidando ulteriormente che l'interazione ciclina-T1 CDK9 è indipendente dagli epitopi utilizzati. I risultati del TAP e del TAP reciproco sono stati analizzati anche mediante colorazione con argento. Gli asterischi indicano le impurità diluite.
FLAG taggato CKD9 coeluito con STREP taggato Cyclin-T1 dalle perle STREP, ma non dal controllo AP.In successiva eluizione FLAG, STREP taggato Cyclin-T1 coeluito con FLAG taggato CDK9 dalle perle FLAG. Allo stesso modo, la ciclina-T1 marcata FLAG coeluita con CDK9 marcata STREP dalle perle STREP, ma non dall'AP di controllo. E il complesso proteina-proteina è stato recuperato in modo efficiente dopo la seconda fase IP FLAG. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due giorni, a partire da quando le cellule sono pronte per essere raccolte se eseguita correttamente.
Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di aumentare di conseguenza il numero di piastre cellulari per esperimento per garantire che una quantità sufficiente di proteine possa essere recuperata e rilevata. Ad esempio, identificare le nuove subunità regolatorie e/o studiare le modificazioni post-traduzionali su subunità complesse. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori che studiano le interazioni proteina-proteina per esplorare nuovi interattori e modifiche post-traduzionali nelle cellule eucariotiche.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare e caratterizzare le proteine utilizzando i tag STREP e FLAG.
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Panoramica
Questo articolo presenta un nuovo metodo di purificazione tandem ad alta affinità (TAP) progettato per l'isolamento e la caratterizzazione efficiente dei complessi proteici dalle cellule eucariotiche. Il metodo consente l'identificazione di nuovi interatori e modifiche post-traduzionali che influenzano la funzione proteica.
Componenti principali dello studio
Area della scienza
- Biochimica
- Biologia cellulare
- Interazioni proteiche
Sfondo
- La purificazione tandem ad alta affinità è una tecnica utilizzata per isolare complessi proteici.
- Comprendere le interazioni proteiche è fondamentale per chiarire le funzioni cellulari.
- Le modifiche post-traduzionali svolgono un ruolo significativo nella regolazione dell'attività proteica.
- Questo metodo migliora la purezza e la resa dei complessi proteici per ulteriori analisi.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare un metodo TAP robusto per l'isolamento di complessi proteici.
- Facilitare la caratterizzazione biochimica dei complessi proteici.
- Identificare nuovi interatori e modifiche regolatorie.
Metodi utilizzati
- Isolamento di complessi proteici da cellule eucariotiche.
- Utilizzo della purificazione ad alta affinità STREP 48 ore dopo la trasfezione.
- Applicazione di PBS freddo per il distacco cellulare.
- Applicazioni in vitro a valle per lo studio della funzione proteica.
Risultati principali
- Sono state raggiunte alta purezza e resa dei complessi proteici isolati.
- È stata facilitata l'identificazione di nuovi interatori.
- Sono state caratterizzate le modifiche post-traduzionali che regolano la funzione proteica.
- Il metodo si è dimostrato efficace per la caratterizzazione biochimica.
Conclusioni
- Il metodo TAP è uno strumento prezioso per studiare i complessi proteici.
- Consente l'identificazione di interazioni regolatorie chiave.
- Questo approccio può migliorare la nostra comprensione della funzione e dell'attività proteica.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Tandem affinity purification (TAP) using STREP- and FLAG-tagged proteins enables high-purity isolation of eukaryotic protein complexes, supporting target validation and mechanistic de-risking in early discovery. The method facilitates identification of novel interactors and post-translational modifications, improving predictive confidence in protein function and complex assembly. This approach reduces biological ambiguity in target selection and supports scalable workflows for lead identification and preclinical characterization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating intact protein complexes from eukaryotic cells for functional characterization.
- Operational Value: Supports biological de-risking through high-yield purification of complexes containing transiently expressed regulatory subunits.
- Predictive Value: Enhances target confidence by enabling detection of co-purifying interactors and regulatory modifications via mass spectrometry.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated eukaryotic protein complexes for downstream biochemical assays measuring enzymatic activity or binding kinetics.
- Operational Value: Enables assay standardization through reproducible isolation of complexes with defined subunit composition and modification status.
- Scalability: Supports platform reuse across multiple targets by combining lysates from different cell plates during STREP bead incubation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Characterizes disease-relevant protein complexes formed by eukaryotic or pathogenic components, enabling mechanistic insight into host-pathogen interactions.
- Operational Value: Provides continuity from discovery through preclinical validation by generating complexes suitable for structural and functional studies.
- Risk Mitigation: Informs risk-adjusted advancement decisions by identifying novel regulatory subunits and post-translational modifications that fine-tune complex function.
Pipeline & Workflow Integration
The TAP method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification, enabling biochemical characterization of protein complexes prior to compound screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating complexes to identify novel interactors and regulatory post-translational modifications.
- Screening: Enables assay readiness by producing purified complexes suitable for in vitro activity and binding assays.
- Analytics: Generates quantitative outputs via mass spectrometry and Western blot analysis to compare complex composition under different conditions.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity by characterizing complexes from eukaryotic or pathogenic systems for mechanistic de-risking.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for multiple targets, as the same STREP and FLAG bead workflow can be applied across different epitope-tagged constructs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity, and identification of novel regulatory mechanisms.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of protein complex isolation across multiple experimental conditions.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions through improved target validation, capital efficiency in early discovery, and reduced late-stage biological failure risk.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of targets based on validated complex composition and modification status.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, eukaryotic cell culture, and affinity purification techniques.
- Depends on access to centrifugation equipment, microcentrifuge tubes, and STREP and FLAG affinity resins.
- Necessitates cross-team standardization of tag placement, lysis buffer composition, and wash stringency for reproducible results.
- Requires adaptation considerations when applying to different eukaryotic cell lines or pathogenic protein expression systems.
- Practical limitation: Efficiency depends on transfection efficiency and expression levels of epitope-tagged constructs in eukaryotic cells.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:52
Collecting the Cells
1:39
Lysing the Cells
6:01
Equilibrating the FLAG Beads
2:32
Equilibrating the STREP Beads
3:56
STREP Affinity Purification (AP)
7:04
FLAG Immunoprecipitation (IP)
8:39
Results: A Cyclin-CDK Complex is Successfully Purified by Tandem Affinity Purification (TAP)
10:26
Conclusion
