Name: Tandem Affinity Purification di complessi proteici da cellule eucariotiche (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: Impara il metodo TAP per isolare complessi proteici da cellule eucariotiche con elevata purezza e resa. Questa tecnica consente di identificare nuovi interattori e modifiche post-traduzionali che regolano la funzione proteica.

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La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata supportata dal National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) del NIH con il numero di premio R01AI114362 e dalla sovvenzione della Welch Foundation I-1782 a Iván D'Orso.

1. Cellule placcatura <ol><li> Un giorno prima della trasfezione, piastra di 3,5 x 10 6 cellule HEK293T in 10 mL di Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) supplementato con 10% (v / v) di siero fetale bovino (FBS) e 1% (v / v) di penicillina / streptomicina (10.000 U / ml magazzino) per ogni piatto a 100 mm. Tavola 3 - 5 100 piatti mm per esperimento / condizione per garantire il recupero di proteine ​​sufficiente. NOTA: Il numero di lastre deve essere determinato per ogni esperimento / condizione, che si baserà sui livelli di espressione e la solubilità del complesso proteina di interesse. In alternativa, se è necessaria la purificazione scala ingrandita, linee cellulari possono essere adattati a crescere in sospensione in fiaschi filatore 2, ma questo metodo non funziona per trasfezioni transitorie. </li></ol> 2. transfecting cellule o indurre linee cellulari stabili <ol><li> Il giorno seguente, controllare le cellule sotto il microscopio. Le cellule devono essere 70 - 80% confluenti prima proceEding. </li><li> Trasfezione delle cellule con una miscela totale di 7 mg di DNA plasmidico e 21 ml di reagente per trasfezione piatto a 100 mm. Cellule trasfezione con un vettore che esprime GFP (Tabella 1) come controllo per l&#39;efficienza di trasfezione. NOTA: Se si utilizza un HEK293-T-Rex o simile linea cellulare stabile che induce l&#39;espressione di due o più complessi subunità in risposta alla doxiciclina 14, 15, l&#39;induttore dovrà essere aggiunto alle cellule e incubate per 48 ore. Analogamente, una linea cellulare stabile che induce l&#39;espressione di GFP dopo l&#39;aggiunta del induttore sarebbe necessaria anche per scopi di convalida. Passare al punto 2.7. </li><li> Preparare la miscela di trasfezione per ogni piatto a 100 mm. In una provetta da 1,5 ml microcentrifuga, miscelare 500 ml di DMEM senza supplementi con 7 mg di DNA plasmidico totale (corrispondente a due o più plasmidi). In una provetta separata, mescolare 500 ml di DMEM senza supplementi with 21 ml di reagente di trasfezione. Ripetere l&#39;operazione per ogni reazione trasfezione. </li><li> Pipetta la soluzione di trasfezione del reagente nella soluzione plasmide DNA (non mescolare soluzioni in ordine inverso). Mescolare pipettando almeno 4 volte. </li><li> Incubare la miscela a temperatura ambiente per 10 - 15 min, ma non più di 15 min. </li><li> La piastra per creare un serbatoio media e accuratamente pipetta la miscela di trasfezione goccia a goccia sul lato interno della piastra senza disturbare le cellule. Riportare il piatto nella posizione piatta originale e miscelare delicatamente per distribuire il composto. </li><li> Incubare le cellule a 37 ° C in un incubatore umidificato coltura cellulare con 5% di CO 2 (questa condizione è seguito indicato come &quot;coltura tissutale incubatore&quot;). Sostituire i media 5 ore dopo la trasfezione (opzionale). </li></ol> 3. Controllo Transfection o induzione efficienza <ol><li> A 24 ore dopo la trasfezione, visualizzare le cellule in una influenzaMicroscopio orescent per verificare l&#39;efficienza di trasfezione (o induzione di controllo HEK293T-Rex linea cellulare stabile che esprimono GFP). Incubare per altre 24 ore. </li></ol> 4. STREP Affinity Purification (STREP AP) <ol><li> Raccogliere le cellule <ol><li> A 48 ore dopo la trasfezione, rimuovere il supporto e aggiungere 8 ml di soluzione fisiologica fredda 1x tampone fosfato (PBS). Pipettare su e giù per staccare le cellule dalla piastra. </li><li> Raccogliere e trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 ml e girare le celle in basso a 800 xg per 4 minuti a 4 ° C. </li><li> Rimuovere il surnatante PBS. Ripetere la rotazione verso il basso (800 xg per 1 min a 4 ° C) per eliminare eventuali residui di PBS. Conservare il pellet a -80 ° C per un uso futuro o seguire la procedura qui sotto per continuare purificazione della proteina. </li></ol></li><li> Lisi delle cellule <ol><li> Risospendere il pellet di cellule utilizzando 5 × volume pellet cellulare (~ 250 microlitri per piastra) di Passive Lysis Buffer(PLB: 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 1,5 mM MgCl 2, 1 mM DTT, proteasi tablet inibitore cocktail, 5% v / v di glicerolo, e 1,0% NP-40) e trasferire la sospensione cellulare in un 1,5 ml provetta. </li><li> Brevemente vortice sospensione e nutate per 30 minuti a 4 ° C. </li><li> Centrifugare la sospensione cellulare a 10.000 xg per 10 min a 4 ° C. </li><li> Trasferire i lisati solubili in una nuova provetta da 1,5 ml e scartare il pellet di cellule. Risparmi 10% del volume finale del lisato solubile &quot;STREP AP Input.&quot; Conservare a 4 ° C. </li></ol></li><li> Equilibrando le perline STREP NOTA: Utilizzare STREP perline per il primo passo di AP! Complessi tirato giù con perline STREP recuperare significativamente più proteine ​​di quelle abbattute con perline FLAG. <ol><li> Estrarre (n × 40 ml) + n ml di STREP tallone slurry 50% (n = numero di campioni) e spin down a 1.500 xg per 2 minuti a 4 ° C. NOTA: utilizzare in tutto il mpunte outhed a perline pipetta. </li><li> Rimuovere il surnatante e aggiungere 500 ml di PLB ai talloni. Nutate la miscela perline per 5 minuti a 4 ° C. Spin down a 1.500 xg per 2 minuti a 4 ° C. <ol><li> Ripetere per un totale di 3 lavaggi. Risospendere le sfere in PLB ad un volume finale di n × 40 microlitri. </li></ol></li><li> Aggiungere 40 ml di 50% STREP tallone slurry per ogni campione lisato cellulare e nutate per 2 ore a 4 ° C. </li></ol></li><li> STREP AP <ol><li> Spin down soluzione a 1.500 xg per 2 minuti a 4 ° C. </li><li> Rimuovere il surnatante e conservare come &quot;STREP AP flusso-through (FT)&quot; a 4 ° C. </li><li> Aggiungere 500 pl di STREP AP Wash Buffer I (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 250 mM NaCl, 1,5 mM MgCl 2, 1 mM DTT, 5% glicerolo e 0,2% NP-40) ai talloni. Nutate la miscela perline per 5 minuti a 4 ° C e centrifugare a 1500 xg per 2 minuti a 4 ° C. Eliminare il surnatante. <ol><li> Ripetere per un totale di 4 lavaggi. <br/&gt; NOTA: Prima quarto lavaggio, trasferire la soluzione perline in una nuova provetta da 1,5 ml ridurre lo sfondo proteine. Questo passaggio è fondamentale. </li></ol></li><li> Aggiungere 500 microlitri di tampone di lavaggio II (100 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, e 1 mM EDTA) ed equilibrare le perline invertendo i tubi. Spin down a 1.500 xg per 2 minuti a 4 ° C e scartare il surnatante. </li><li> Eluire la proteina di interesse con 50 ml di tampone di eluizione STREP (100 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA e 2,5 mM Desthiobiotin). Vortex a 800 rpm per 15 min a 4 ° C. </li><li> Spin giù le perline a 1.500 xg per 1 min a 4 ° C. Raccogliere il surnatante. Tale quota corrisponde al campione &quot;STREP AP Elution&quot;. </li><li> Salvare la frazione perline a 4 ° C per una seconda eluizione, che potrebbe produrre fino a metà della quantità di proteina ottenuta con la prima eluizione. Aliquotare 10% del STREP AP Elution per la colorazione argento e / o western blotting16. </li></ol></li><li> Equilibrando le perline FLAG <ol><li> Estrarre (nx 16 ml) + n ml di soluzione di FLAG perline (n = numero di campioni) e spin down a 1.500 xg per 2 minuti a 4 ° C. NOTA: utilizzare punte bocca larga per perline pipetta. </li><li> Rimuovere il surnatante e aggiungere 500 ml di tampone di lavaggio FLAG (100 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA e 0,1% NP-40) ai talloni. Spin down a 1.500 xg per 2 minuti a 4 ° C. Ripetere per un totale di 3 lavaggi. </li><li> Risospendere le sfere in tampone di lavaggio FLAG ad un volume finale di nx 16 ml. </li><li> Aggiungere 16 ml di liquame FLAG tallone per il restante eluizione STREP AP e pernottamento nutate a 4 ° C. </li></ol></li></ol> 5. FLAG IP <ol><li> Spin giù la sospensione perline FLAG a 1.500 xg per 2 minuti a 4 ° C. Salvare il surnatante e conservare come la &quot;FLAG IP Flow-through&quot; (FT) a 4 ° C. </li><li> Aggiungere 50081; l di tampone di lavaggio FLAG alla soluzione. Nutate per 5 minuti a 4 ° C e centrifugare a 1500 xg per 2 minuti a 4 ° C. Ripetere per un totale di 4 lavaggi e rimuovere il surnatante dopo ogni lavaggio. NOTA: prima il quarto lavaggio, trasferire la soluzione proteica-perline in una nuova provetta da 1,5 ml per ridurre sfondo. Questo passaggio è fondamentale. </li><li> Rimuovere il surnatante dalla centrifuga finale e aggiungere 30 ml di tampone di lavaggio FLAG contenente 200 ng / ml di FLAG peptide nelle perline. Vortex a 800 rpm per 2 ore a 4 ° C. </li><li> Centrifugare la sospensione a 1.500 xg per 2 minuti a 4 ° C. Raccogliere il surnatante e conservare a 4 ° C come la &quot;FLAG IP eluizione.&quot; NOTA: I campioni di eluizione possono essere confermate con macchia d&#39;argento e / o Western Blot utilizzando protocolli standard di 16, e sono pronti per ulteriori analisi di proteine. Quando si imposta un Western Blot, eseguire tutti i seguenti campioni: (1) STREP AP Ingresso, (2) STREP AP FT, (3) STREP AP Elutisu, (4) FLAG IP FT, e (5) bandiera IP eluizione. I volumi caricati dovranno essere determinati per ogni esperimento. Tutti i campioni raccolti e perline possono essere conservati a 4 ° C per una conservazione a breve termine e a -80 ° C per una conservazione a lungo termine. Campioni TAP possono essere analizzati mediante spettrometria di massa per verificare l&#39;identità dei loro componenti, per identificare nuove modificazioni post-traduzionali (PTM), e / o per scoprire ogni interazione proteina romanzo con il complesso purificato 2, 17. A tale scopo, dopo l&#39;esecuzione di un gel Coomassie o argento macchia, bande possono essere tagliate dal gel utilizzando un bisturi pulito. Diversi ottime recensioni che discutono i metodi di spettrometria di massa sono stati pubblicati in precedenza 18, 19. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il protocollo qui descritto per l&#39;espressione e l&#39;isolamento di complessi proteici da cellule eucariotiche non è limitata alla caratterizzazione biochimica di tali complessi molecolari, ma può anche essere utilizzato per l&#39;identificazione di nuovi interattori e modificazioni post-traduzionali che potrebbe regolare la loro funzione. L&#39;utilizzo di tag di affinità non si limita a ciò che è menzionato in questo protocollo; ma la nostra esperienza suggerisce che l&#39;utilizzo STREP come primo passo AP miglio...

<html> Interazioni proteina-proteina (PPI) sono fondamentali per la precisa regolazione dei processi biologici 1, e ulteriori studi su questi inibitori della pompa protonica può dare informazioni relative la loro funzione 2. Diversi approcci sono stati ideati per lo studio e la caratterizzazione di IPP e per l&#39;identificazione de novo di nuove componenti proteici normativi. Nel 1989, Stanley Campi e colleghi hanno riportato il lievito doppio ibrido (Y2H) test 3. Questo approccio consente l&#39;identificazione imparziale e completa di interattori (prede) per una proteina definito di interesse (esche) in Saccharomyces cerevisiae. Oltre alla sua notevole utilità per scoprire IPP, il saggio Y2H può essere utilizzato per caratterizzare coppie di proteine ​​in cellule di lievito, definendo domini interagenti minime, e identificare mutazioni che aboliscono tali interazioni. Modificando il test Y2H, inibitori della pompa protonica può anche essere studiata in cellule di mammiferoclass = &quot;xref&quot;&gt; 4. Variazioni del dosaggio Y2H (ad esempio, il sistema di lievito tre ibrido) possono essere applicate anche a studiare proteina-RNA e proteina-piccola interazioni legante organico nelle cellule. Un altro strumento comunemente utilizzato per studiare PPI in un sistema omologo è il test 5 co-immunoprecipitazione (co-IP). Utilizzando un anticorpo per immunoprecipitare una proteina di interesse, il test di co-IP permette ai ricercatori di monitorare PPI nelle celle per diverse condizioni ambientali e situazioni sperimentali. L&#39;uso di proteine epitopi-tag (ad esempio, la bandiera, Myc, STREP, e HA, tra gli altri) in purificazione di affinità (AP) metodi ha facilitato l&#39;isolamento di proteine da miscele complesse di proteine per diversi saggi a valle, tra cui Western Blot, macchia d&#39;argento , e l&#39;analisi enzimatica. Tuttavia, nessuno di questi approcci precedenti consentire l&#39;isolamento di grandi quantità di complessi proteici per un&#39;ulteriore caratterizzazione compreso in vitro unssays, scoperta di subunità regolatorie mediante spettrometria di massa, e l&#39;identificazione di modificazioni post-traslazionali. Una versione migliorata del metodo AP viene chiamato Tandem AP (TAP), che è una tecnica di purificazione per studiare IPP creando una proteina di fusione con due epitopi che viene purificato mediante due AP successive 6, 7. In questo articolo, vi presentiamo una variante del metodo TAP per purificare complessi proteici in cui due subunità sono contrassegnati con diversi epitopi e poi purificato attraverso due punti di accesso sequenziali (STREP AP seguiti da FLAG IP). In primo luogo abbiamo a disposizione una panoramica minimalista di TAP (figura 1) e poi una descrizione dettagliata di tutte le fasi sperimentali (figura 2), in modo che i ricercatori li possono applicare alla loro complesso proteina di interesse. Per dimostrare l&#39;applicabilità del metodo di TAP, abbiamo scelto un ben caratterizzato ciclina-CDK complesso (di seguito PTEFB chinasi), che è composto della ciclina T1 subunità regolatrice (CycT1) e una chinasi (CDK9), ed è coinvolto nella regolazione della trascrizione di RNA polimerasi II (Pol II) 8, 9, 10. P-TEFb fosforila il dominio C-terminale di Pol II e dei suoi fattori di allungamento negativi associati, che allevia la pausa trascrizionale al promotore e facilita in tal modo la trascrizione allungamento 11, 12, 13. Con questa interazione conosciuta in mente, STREP-tag CycT1 e CDK9 FLAG-tag sono stati oltre espresso in cellule HEK293T. Un esperimento TAP reciproca è stata eseguita con CDK9 STREP-tag e FLAG-tagged CycT1 per convalidare ulteriormente che l&#39;interazione proteina è indipendente dalle epitopi utilizzati. Le cellule sono state raccolte e lisate 48 ore dopo la trasfezione. Il lisato solubile è stato purificato dalla TAP (STREP AP seguito da FLAGIP). Input e proteine purificate sono state analizzate mediante western blot e macchia d&#39;argento (Figura 3).

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>GE Healthcare Life Sciences/Hyclone</td><td>SH3002.2FS</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>GE Healthcare Life Sciences/Hyclone</td><td>SH30071</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td><td>MP Biomedicals</td><td>MP091670049</td><td></td></tr><tr><td>PolyJet</td><td>SignaGen Laboratories</td><td>SL100688</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail di inibitori della proteasi&nbsp;</td><td>Roche&nbsp;</td><td></td><td></td>11836153001</tr><tr><td>STREP-Tactin Superflow</td><td>IBA Lifesciences</td><td>2-1208-010</td><td></td></tr><tr><td>Tampone di eluizione STREP-tag</td><td>IBA Lifesciences</td><td>2-1000-025</td><td></td></tr><tr><td>EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2426</td><td></td></tr><tr><td>Corning 100 mm & volte; 20 mm stile piatto coltura cellulare trattato polistirene apirogeno 20/manica</td><td>Corning&nbsp;</td><td></td><td></td>430167</tr><tr><td>Protein Lo-Bind Eppendorf Eppendorf</td><td></td><td>022431081</td><td></td></tr><tr><td>Miscelatore a vortice digitale</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>02-215-370</td><td></td></tr><tr><td>Rack in schiuma per microtubi a 48 fori</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-215-386</td><td></td></tr><tr><td>Girarrosto per agitatore Labquake&nbsp;</td><td>Termo&nbsp;</td><td>Numero 415110</td><td></td></tr></tbody></table>

tandem affinity purification di complessi proteici da cellule eucariotiche

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

La purificazione della proteina-proteina attiva e complessi acido nucleico-proteina è cruciale per la caratterizzazione delle attività enzimatiche e de novo identificazione di nuovi subunità e modificazioni post-traduzionali. sistemi batterici permettono l&#39;espressione e la purificazione di una grande varietà di singoli polipeptidi e proteine ​​complessi. Tuttavia, questo sistema non consente la purificazione di subunità proteiche che contengono modificazioni post-traduzionali (ad esempio, fosforilazione e acetilazione), e l&#39;identificazione di nuovi subunità regolatorie che sono presenti solo / espressi nel sistema eucariotico. Qui, forniamo una descrizione dettagliata di un romanzo, robusto, ed efficiente metodo di purificazione tandem affinità (TAP) utilizzando STREP- e le proteine ​​FLAG-tag che facilita la purificazione di complessi proteici con transitoriamente o stabilmente espresso proteine ​​epitopi-tag da cellule eucariotiche. Questo protocollo può essere applicata per caratterizzare protEin funzionalità complesse, alla scoperta di modificazioni post-traduzionali su subunità complesse, e per identificare nuovi componenti complessi normativi mediante spettrometria di massa. In particolare, questo metodo TAP può essere applicato per studiare complessi proteici formati da componenti eucariotiche o patogeni (virali e batteriche), ottenendo così una vasta gamma di possibilità sperimentali valle. Proponiamo che i ricercatori che lavorano con i complessi proteici potrebbero utilizzare questo approccio in molti modi diversi.

In questo articolo, abbiamo dimostrato l&#39;applicabilità del metodo TAP per il ben caratterizzato CycT1-CDK9 complesso (noto anche come P-TEFb chinasi). I plasmidi codificanti ciclina T1-STREP (CycT1: S) e CDK9-FLAG (CDK9: F), o CDK9-STREP (CDK9: S) e ciclina T1-FLAG (CycT1: F) (Tabella 1), sono state trasfettate in cellule HEK293T . I controlli negativi inclusi trasfezioni con un vettore vuoto e il CDK9: F ...

Descriviamo qui un nuovo, robusto ed efficiente metodo di purificazione di affinità tandem (TAP) per l'espressione, l'isolamento e la caratterizzazione di complessi proteici da cellule eucariotiche. Questo protocollo potrebbe essere utilizzato per la caratterizzazione biochimica di complessi discreti e per l'identificazione di nuovi interattori e modificazioni post-traduzionali che ne regolano la funzione.

Tandem Affinity Purification di complessi proteici da cellule eucariotiche

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

L'obiettivo generale di questo metodo di purificazione in affinità in tandem è isolare complessi proteici espressi da cellule eucariotiche per la caratterizzazione biochimica e lo studio degli assemblaggi molecolari, nonché per l'identificazione di nuovi interattori e di modifiche post-traduzionali che regolano la loro funzione. Questo metodo consente la purificazione di complessi proteici integri da cellule eucariotiche, al fine di identificare nuovi interattori e modifiche post-traduzionali regolatorie che modulano finemente la loro attività. Il principale vantaggio di questa tecnica è che permette di ottenere complessi proteici con elevata purezza e resa, idonei per applicazioni in vitro successive allo studio della loro funzione e attività.Le cellule vengono raccolte dalla purificazione con affinità STREP a 48 ore dal transfezionamento. Rimuovere il mezzo e aggiungere otto millilitri di PBS freddo. Pipettare su e giù per staccare le cellule dalla piastra.Raccogliere e trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 15 millilitri e centrifugare le cellule a 800 ×g per quattro minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere il soprannatante di PBS. Centrifugare nuovamente a 800 ×g per un minuto a quattro gradi Celsius per eliminare eventuali residui di PBS.Per iniziare questa procedura, risospendere ogni pellet cellulare in un volume di buffer di lisi passiva, o PLB, pari a cinque volte il volume del pellet cellulare. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta microcentrifuga da 1,5 millilitro. Vortexare brevemente la sospensione e nutare per 30 minuti a quattro gradi Celsius.Centrifugare la sospensione cellulare a 10.000 × g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire il lisato solubile in un nuovo tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri e scartare il pellet cellulare. Conservare il 10% del volume finale del lisato solubile come input STREP-AP e mantenerlo a quattro gradi Celsius.È importante utilizzare le perle STREP per il primo passaggio di purificazione per affinità perché i complessi ottenuti con le perle STREP recuperano una quantità significativamente maggiore di proteina rispetto a quelli ottenuti con le perle FLAG. Utilizzando una punta di pipetta a bocca larga, rimuovere la quantità appropriata della sospensione al 50% di perle STREP necessaria per la purificazione per affinità. Centrifugare a 1.500 ×g per due minuti a quattro gradi Celsius.Rimuovere il soprannatante e aggiungere 500 microlitri di PLB alle perle. Incubare la miscela di perle per cinque minuti a quattro gradi Celsius con agitazione lenta. Centrifugare nuovamente.Dopo il terzo lavaggio, rimuovere il surnatante e risospendere le perle in PLB fino a un volume finale di n volte 40 microlitri, dove n è il numero di campioni. Aggiungere 40 microlitri di sospensione al 50% di perle STREP a ciascun campione di lisato cellulare e incubare in agitazione lenta per due ore a quattro gradi Celsius. Durante questa fase di produzione e recupero delle proteine, possono essere utilizzate più piastre di cellule, e campioni della stessa proteina ottenuti da piastre diverse possono essere combinati con una singola porzione di perle durante la purificazione per affinità STREP.Dopo aver fatto incubare le miscele di lisato cellulare e sospensione di perline STREP per due ore, centrifugare a 1.500 × g per due minuti a quattro gradi Celsius. Conservare il soprannatante come "flusso attraverso STREP AP" e mantenerlo a quattro gradi Celsius. Aggiungere 500 microlitri di buffer di lavaggio STREP AP uno alle perline.Ruotare delicatamente le perle nella miscela di tampone per cinque minuti a quattro gradi Celsius e centrifugare a 1.500 ×g per due minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere il soprannatante e lavare nuovamente con 500 µL di tampone di lavaggio STREP AP uno. Dopo il terzo lavaggio, trasferire la soluzione di perle in un nuovo tubo microcentrifuga da 1,5 mL per ridurre lo sfondo proteico.Lavare una quarta volta con il buffer di lavaggio STREP AP uno. Dopo la centrifugazione, rimuovere il soprannatante e aggiungere 500 microlitri di buffer di lavaggio due. Equilibrare le perle capovolgendo i tubi, quindi centrifugare a 1.500 × g per due minuti a quattro gradi Celsius.Eliminare il soprannatante. Eluire la proteina di interesse con 50 microlitri di buffer di eluizione STREP. Vortexare a 800 giri/min per 15 minuti a quattro gradi Celsius.Centrifugare le perle a 1.500 ×g per un minuto a quattro gradi Celsius. Raccogliere il soprannatante. Questa frazione corrisponde al campione di eluizione STREP AP.Conservare la frazione delle perle a quattro gradi Celsius per una seconda eluizione. Aliquotare il 10% dell'eluizione STREP AP per la colorazione argentica e/o il Western blot. Per aumentare la quantità di materiale iniziale per l'immunoprecipitazione successiva con FLAG, le prime e seconde eluizioni STREP possono essere unite per un recupero più efficiente dell'eluizione FLAG.Iniziare questa procedura utilizzando una punta pipetta a bocca larga per trasferire la quantità appropriata di soluzione di perline FLAG in un tubo da microcentrifuga. Centrifugare a 1.500 ×g per due minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere il soprannatante e aggiungere 500 microlitri di buffer di lavaggio FLAG sulle perline.Centrifugare a 1.500 ×g per due minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere il soprannatante e lavare nuovamente con il buffer di lavaggio FLAG. Dopo il terzo lavaggio, eliminare il soprannatante e risospendere le perle nel buffer di lavaggio FLAG fino a un volume finale di n volte 16 microlitri, dove n è il numero di campioni.Aggiungere 16 microlitri della sospensione di perle FLAG all'eluito STREP AP rimanente e agitare delicatamente per tutta la notte a quattro gradi Celsius. Dopo un'incubazione notturna della sospensione di perle FLAG e dell'eluito STREP AP, procedere con l'immunoprecipitazione FLAG. Centrifugare la sospensione di perle FLAG a 1.500 ×g per due minuti a quattro gradi Celsius.Conservare il surnatante come flusso passante dell'IP per FLAG e conservarlo a quattro gradi Celsius. Aggiungere 500 microlitri di buffer di lavaggio per FLAG alle perle. Incubare in agitazione lenta per cinque minuti a quattro gradi Celsius e centrifugare a 1.500 ×g per due minuti a quattro gradi Celsius.Eliminare il surnatante e lavare nuovamente con 500 microlitri di buffer di lavaggio per FLAG. Dopo il terzo lavaggio, trasferire la soluzione di perle proteiche in un nuovo tubo microcentrifugo da 1,5 millilitri per ridurre il rumore di fondo. Effettuare un quarto lavaggio con il buffer di lavaggio per FLAG.Rimuovere il soprannatante dall'ultima centrifugazione e aggiungere alle perle 30 microlitri di buffer di lavaggio FLAG contenente 200 nanogrammi per microlitro di peptide FLAG. Vortexare a 800 giri/min per due ore a quattro gradi Celsius. Dopo due ore, centrifugare la sospensione a 1.500 ×g per due minuti a quattro gradi Celsius.Raccogliere il sopranatante e conservarlo a quattro gradi Celsius come eluato dell'immunoprecipitazione con FLAG. In questo video, il metodo di purificazione per affinità in tandem, o metodo TAP, è stato applicato al complesso Cyclin-T1 CDK9. Cyclin-T1 con tag STREP e CDK9 con tag FLAG sono state sovraespressi in cellule HEK293 T.È stato inoltre eseguito un esperimento inverso con CDK9 marcato con STREP e Ciclina-T1 marcata con FLAG. L'analisi mediante Western blot mostra che CDK9 marcato con FLAG è stato coeluito insieme alla Ciclina-T1 marcata con STREP dalle perle STREP, ma non nel controllo negativo, in cui era assente la Ciclina-T1 marcata con STREP. Entrambe le proteine sono state rilevate nell'eluito FLAG, confermando ulteriormente la formazione del complesso.I risultati del TAP inverso mostrano che la Ciclina-T1 marcata con FLAG è stata coeluita con CDK9 marcato con STREP, confermando ulteriormente che l'interazione tra Ciclina-T1 e CDK9 è indipendente dagli epitopi utilizzati. I risultati del TAP e del TAP inverso sono stati inoltre analizzati mediante colorazione con argento. Gli asterischi indicano impurezze coeluite.CDK9 marcati con FLAG sono stati coeluiti insieme a Ciclina-T1 marcata con STREP dalle perle STREP, ma non dall'AP di controllo. Nella successiva eluizione con FLAG, la Ciclina-T1 marcata con STREP è stata coeluita insieme al CDK9 marcato con FLAG dalle perle anti-FLAG. Analogamente, la Ciclina-T1 marcata con FLAG è stata coeluita insieme al CDK9 marcato con STREP dalle perle STREP, ma non dall'AP di controllo. Il complesso proteina-proteina è stato recuperato in modo efficiente dopo il secondo passaggio di IP con FLAG. Una volta acquisita padronanza, questa tecnica può essere eseguita in due giorni, a partire dal momento in cui le cellule sono pronte per essere raccolte, se eseguita correttamente.Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di aumentare il numero di piastre cellulari per esperimento in modo proporzionale, al fine di garantire un recupero e un rilevamento adeguati delle proteine. Ad esempio, identificare le nuove subunità regolatorie e/o studiare le modifiche post-traduzionali sulle subunità del complesso. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori che studiano le interazioni proteina-proteina, permettendo di esplorare nuovi interattori e modifiche post-traduzionali nelle cellule eucariotiche.Dopo aver guardato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare e caratterizzare le proteine utilizzando i marcatori STREP e FLAG.

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Tandem purificazione per affinità è un valido approccio per l'individuazione di partner di legame proteico. Come prova di concetto, questa metodologia è stata applicata al ben caratterizzato eIF4E fattore di inizio traduzione di co-precipitato i fattori coinvolti in cellule ospiti di inizio di traduzione. Questo metodo è facilmente adattabile a qualsiasi proteina cellulare o virale.

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Purificazione di affinità di proteine ​​marcate, in combinazione con la spettrometria di massa (APMS) è un potente metodo per la mappatura sistematica delle reti di interazione di proteine ​​e per indagare la base meccanicistica dei processi biologici. Qui, descriviamo un ottimizzato sequenziale peptide affinità (SPA) APMS procedura sviluppata per il...

Identificazione di complessi proteici in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Con sequenziale purificazione per affinità Peptide in combinazione con Tandem Mass Spectrometry

Questo video dimostra la purificazione di affinità tandem, una tecnica per purificare complessi proteici da cellule eucariotiche per studiare l'interazione proteina-proteina. Il complesso contiene due proteine marcate con diversi tag epitopici. Dopo la purificazione del complesso utilizzando due resine con un'affinità per i due diversi tag in modo sequenziale, la presenza di entrambe le proteine nell'eluito conferma l'interazione tra le due.

Saggio di purificazione di affinità tandem per studiare le interazioni proteina-proteina

Complessi proteici catalizzano le funzioni cellulari fondamentali. Caratterizzazione funzionale e strutturale dettagliata di molti complessi essenziali richiede la produzione ricombinante. MultiBac è un sistema di celle di baculovirus / insetto particolarmente adattato per esprimere proteine ​​eucariotiche e dei loro complessi. MultiBac è stato implementato come una piattaforma open-access, e le procedure operative standard sviluppati per massimizzare la sua utilità.

Il MultiBac Protein Complex Piattaforma di produzione al EMBL

Drosophila è famosa per la sua manipolazione genetica potente, ma non per la sua idoneità di analisi biochimica in profondità. Qui vi presentiamo una procedura basata TAP-per identificare interagiscono partner di qualsiasi proteina di interesse da parte del cervello della mosca. Questa procedura può potenzialmente portare a nuove vie di ricerca.

Identificare proteina-proteina interazione in<em&gt; Drosophila</em&gt; Adult capi di Tandem Affinity Purification (TAP)

Il metodo di purificazione per affinità tandem (TAP) è stato ampiamente utilizzato per isolare complessi nativi da estratti cellulari, principalmente eucariotici, per la proteomica. Qui, presentiamo un protocollo del metodo TAP ottimizzato per la purificazione di complessi nativi per studi strutturali.

Purificazione di Native Complessi di studio strutturale utilizzando un metodo Tag Tandem Affinity

Qui si descrivono i protocolli di perturbare le cellule di mammifero mediante fresatura a stato solido ad una temperatura criogenica, la produzione di un estratto cellulare dalla polvere di cellule risultante, e isolare complessi proteici di interesse per cattura affinità su perline paramagnetici micron scala anticorpi accoppiati.

Proteine ​​Complesso affinità Acquisizione da cellule di mammifero Cryomilled

Presentiamo qui protocolli per purificazione per affinità di complessi proteici e la loro separazione dal blu PAGE nativa, seguiti da proteine ​​correlazione profilatura mediante un'etichetta disponibile spettrometria di massa quantitativa. Questo metodo è utile per risolvere interattomi in distinti complessi proteici.

Risoluzione purificato per affinità complessi proteici di Blue Native PAGE e proteine ​​correlazione Profiling

Interazioni proteina-proteina e proteina-metabolita sono cruciali per tutte le funzioni cellulari. Qui, descriviamo un protocollo che permette l'analisi parallela di queste interazioni con una proteina di scelta. Il nostro protocollo è stato ottimizzato per colture di cellule vegetali e combina purificazione di affinità con proteina basati sulla spettrometria di massa e rilevamento di metabolita.

2 in 1: purificazione di affinità per l'analisi parallela di proteina-proteina e proteina-metabolita complessi in un unico passaggio

Qui presentiamo un protocollo collaudato e testato per la purificazione del cloroplasto complessi di importazione della proteina (complesso di TOC-TIC) utilizzando il rubinetto-tag. Il protocollo di affinità-isolamento di uno stadio potenzialmente può essere applicato a qualsiasi proteina ed essere utilizzato per identificare nuovi partners di interazione mediante spettrometria di massa.

Purificazione di affinità del cloroplasto Translocon proteina complessi usando il Tag di rubinetto

Questo articolo fornisce una procedura per la purificazione per affinità di una proteina ricombinante umana, l'endonucleasi del lembo 1 (FEN1), che è stata marcata con un tag 6X-istidina. Il protocollo prevede l'utilizzo di due distinte colonne ioniche metalliche immobilizzate per la purificazione della proteina marcata.

Purificazione per affinità di una proteina marcata 6X-His-Tagged utilizzando un sistema di cromatografia liquida proteica veloce 

Impara il metodo TAP per isolare complessi proteici da cellule eucariotiche con elevata purezza e resa. Questa tecnica consente di identificare nuovi interattori e modifiche post-traduzionali che regolano la funzione proteica.

Tandem Affinity Purification di complessi proteici da cellule eucariotiche

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