Bottlenose Dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoi: raccolta, crioconservazione e fecondazione In Vitro eterologa

L'obiettivo generale di questa tecnica è valutare la funzionalità dello sperma di delfino criopreservato mediante fecondazione in vitro eterologa, utilizzando spermatozoi di delfino criopreservati e ovociti bovini con zona pellucida integra. In questo video, mostreremo come raccogliere, valutare e criopreservare gli spermatozoi di delfino. Successivamente, valuteremo l'interazione e la penetrazione dello sperma fino alla zona pellucida.

Formazione del pronucleo maschile e scissione dell'embrione ibrido. Un problema fondamentale nello sviluppo delle tecnologie riproduttive assistite è la valutazione della funzione spermatica, che viene meglio indicata dalla capacità dello spermatozoo di fecondare. Le tecniche di fecondazione in vitro omologa sono comunemente utilizzate per valutare la funzione spermatica, ma l'ottenimento di ovociti di delfino è molto difficile.

Il principale vantaggio della fecondazione in vitro eterologa è la sua semplicità. Gli ovociti bovini sono facilmente ottenibili e possono essere processati in vitro mediante protocolli ben collaudati. Illustreremmo inoltre come criopreservare gli spermatozoi del delfino utilizzando vapori di azoto liquido.

Una tecnica semplice che non richiede attrezzature per il congelamento altamente specializzate. Per questa procedura, il delfino maschio dovrebbe essere stato precedentemente addestrato per sei mesi utilizzando il rinforzo positivo. Far sdraiare l'animale in posizione supina vicino al bordo della vasca.

Eseguire varie stimolazioni tattili premendo delicatamente sulla regione craniale del solco genitale per indurre l'estroflessione volontaria del pene. Dopo aver ottenuto un'erezione completa, indirizzare la punta del pene verso un contenitore sterile. Mantenere l'eiaculato a 37 gradi Celsius fino all'analisi.

Ripetere, se necessario, la stimolazione tattile per raccolte successive di eiaculato utilizzando ogni volta un nuovo vetro di polipropilene. Valutare immediatamente dopo la raccolta gli eiaculati mantenendoli a 37 gradi Celsius per tutto il tempo. Determinare il volume, il colore, il pH e l'osmolarità degli eiaculati.

Quindi, da un'aliquote di 10 microlitri, determinare la concentrazione di spermatozoi in una camera di conteggio. Posizionare l'eiaculato su un vetrino su un palchetto microscopico riscaldato a 37 gradi Celsius. Valutare la motilità degli spermatozoi mediante un sistema di analisi assistita al computer.

Se necessario, diluire lo sperma con mezzo di fecondazione per una migliore visualizzazione. Successivamente, utilizzando un'aliquota di 20 microlitri di eiaculato, valutare la vitalità e la morfologia degli spermatozoi mediante colorazione convenzionale con Eosina Nigrosina e Spermac. Per la crioconservazione, trasferire innanzitutto il campione di sperma in una provetta per centrifuga.

Quindi centrifugare gli spermatozoi a 250 G per cinque minuti. Ora, nell'arco di cinque minuti, effettuare lentamente una diluizione 1:1 del campione di sperma con un buffer a base di tuorlo d'uovo in tracce contenente il 1,5% di glicerolo. Successivamente, raffreddare il campione al 5% di Celsius per 1,5 ore.

Un'ora dopo, ripetere la diluizione 1:1 con lo stesso tampone e quindi mantenere la sospensione degli spermatozoi a cinque gradi Celsius per 10 minuti. Successivamente, caricare la sospensione in capillari da 0,25 millilitri e sigillarli a caldo. Caricare i capillari in un portacapillari e sospendere il portacapillari a 4,5 centimetri sopra l'azoto liquido per 10 minuti.

Quindi immergere immediatamente le cannucciole nell'azoto liquido per la conservazione a lungo termine. Per questo protocollo, utilizzare ovaie bovine conservate in soluzione salina calda, raccolte entro le ultime tre ore. Iniziare lavando le ovaie tre volte con soluzione salina.

Mantenendoli sempre a 37 gradi Celsius. Successivamente aspirare tutti i follicoli da due millimetri a otto millimetri utilizzando un ago da 18 gauge e una siringa. Trasferire in un tubo da 50 millilitri e lasciare sedimentare gli oociti per 15 minuti.

Quindi rimuovere il soprannatante e ri-sospendere i follicoli in PBS. Recuperare i COC al microscopio stereoscopico in piatti da 90 millimetri. Selezionare gli oociti di grado uno e due, che presentano un citoplasma omogeneo e sono circondati da almeno tre strati di cellule del cumulo.

Trasferire questi ovociti nel PBS in una piastra da 35 millimetri. Successivamente, lavare i COC tre volte nel PBS e una volta nel mezzo di maturazione. Quindi, caricare i COC in piastre a quattro pozzetti con 50 COC e 500 millilitri di mezzo di maturazione per pozzetto, quindi incubare i COC per 24 ore.

Una volta che gli oociti presentano cellule del cumulo espanso, sono maturi. Lavare quindi gli oociti due volte nel mezzo di fecondazione e trasferirli in piatti da quattro pozzetti, in gruppi di 50, con 250 millilitri di mezzo di fecondazione per pozzetto. A questo punto, riporre i COC nell'incubatore e preparare lo sperma per la fecondazione.

Riempire una cannuccia congelata contenente spermatozoi di delfino e una cannuccia contenente spermatozoi bovini in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per 50 secondi. Quindi valutare la loro motilità in modo soggettivo utilizzando un microscopio a contrasto di fase. Successivamente trasferire il campione di sperma in un tubo con gradiente di densità e centrifugarlo per 10 minuti a 250 G. Rimuovere con attenzione il soprannatante.

Aggiungere nuovamente tre millilitri della soluzione di lavaggio. Successivamente, risospendere gli spermatozoi con un'accurata miscelazione. Centrifugare nuovamente il tubo ed eliminare la maggior parte del soprannatante, lasciando gli spermatozoi in 300 microlitri.

Ora conta gli spermatozoi e regola la concentrazione a due milioni per millilitro, diluiti con mezzo di fecondazione. Aggiungi 250 microlitri della sospensione in ogni pozzetto contenente ovociti, in modo da ottenere una concentrazione finale di spermatozoi di un milione per millilitro. Al microscopio stereoscopico, osserva gli ovociti maturi espansi circondati da spermatozoi mobili di bovino o di delfino, che sono più piccoli rispetto agli spermatozoi bovini.

Coincubare i gameti per 18 ore. Per valutare l'interazione degli spermatozoi con la zona pellucida, rimuovere 20 ovociti dalla piastra a 2,5 ore dalla coincubazione. Rimuovere gli spermatozoi legati in modo lasso pipettando vigorosamente attraverso una pipetta di Pasteur a foro stretto.

Successivamente fissare e colorare gli oociti con gli uncini a 3342. Trasferire singolarmente gli oociti colorati in gocce di due microlitri di mezzo di montaggio e contare il numero di spermatozoi attaccati agli oociti utilizzando un microscopio a contrasto di fase. A partire da 18 ore di co-incubazione, trasferire i 10 zigoti presuntivi in una provetta da centrifuga da 15 millilitri contenente due millilitri di PBS ed eseguire un'agitazione delicata con vortex per tre minuti per rimuovere le cellule del cumulo.

Lavare due volte in PBS e fissare e colorare come precedentemente descritto. Inoltre, a 18 ore di co-incubazione, raccogliere 50 zigoti per la coltura. Vortexare per tre minuti in PBS, quindi lavarli due volte in PBS.

Dopo aver lavato i zigoti selezionati con citoplasma omogeneo per la coltura, trasferirli in gruppi di 25 in gocce da 25 microlitri di fluido oviduttale sintetico integrato con siero fetale bovino al 5%. Successivamente coltivare gli zigoti presuntivi per 48 ore e valutarne la percentuale di scissione utilizzando un microscopio stereoscopico.

Successivamente, valutare ulteriormente il loro patrimonio genetico mediante PCR secondo il protocollo descritto nel testo. Gli spermatozoi provenienti da ejaculati di delfino scongelati erano mobili per circa l'85% e progressivamente mobili per il 70%. Questi valori sono rappresentativi di spermatozoi criopreservati di alta qualità.

Gli spermatozoi di delfino si sono attaccati alla zona pellucida bovina dopo 2,5 ore di coincubazione in una percentuale più elevata rispetto agli spermatozoi bovini. Gli spermatozoi di delfino sono stati in grado di penetrare gli ovociti bovini con zona pellucida integra, portando alla formazione del pronucleo e alla segmentazione. Nel gruppo di fecondazione in vitro eterologa non è stata osservata polispermia.

La formazione dei pronuclei ha raggiunto la percentuale massima a 24 ore. La formazione dei pronuclei è stata più rapida nel gruppo omeologo. Il tasso di scissione a 48 ore è stato inferiore nelle fecondazioni eterologhe rispetto a quelle omeologhe.

La PCR ha confermato la presenza di materiale genetico di delfino negli embrioni ibridi. Sono stati testati primer per il gene del ribosoma 18 s del delfino, che producono un prodotto di 190 paia di basi. Le corsie da 1 a 30 sono ibridi delfino-bovino.

I controlli erano costituiti da DNA di delfino nei pozzetti S e da due embrioni bovini nelle corsie C. Il protocollo presentato per la fecondazione in vitro autologa ha dimostrato che i delfini tursiopi sono in grado di fecondare ovociti bovini integri, generando embrioni eterozigoti.

Un'ulteriore evoluzione e ottimizzazione di questa tecnica faciliterà la valutazione della funzionalità dello sperma del delfino. La criopreservazione degli spermatozoi del delfino mediante vapori di azoto liquido è un metodo economico, rapido e semplice che fornisce buoni parametri di motilità profonda e consente una fecondazione in vitro eterologa di successo. L'osservazione che gli spermatozoi del delfino sono in grado di fecondare ovociti bovini apre nuove prospettive di ricerca sulla riproduzione del delfino e di altri animali marini.

Solleva inoltre domande sui meccanismi della fecondazione che rimangono in gran parte senza risposta.