Name: Bottlenose Dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoi: raccolta, crioconservazione e fecondazione In Vitro eterologa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Scopri la raccolta, la crioconservazione e la fecondazione in vitro eterologa di spermatozoi di delfino Tursiops truncatus. Questo metodo consente di valutare la funzionalità dello sperma criopreservato.

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il suo lavoro è stato finanziato dal Ministero spagnolo dell'economia e competitività (AGL2015-70140-R a D. Rizos), AGL2015-66145R a A. Gutierrez-Adan e J.p. F. Pérez-Gutiérrez · e Seneca Foundation di Murcia (Grant 20040/GERM/16 a F. García-Vázquez)

Dichiarazione etica: tutte le procedure sperimentali sono stata esaminate e approvate dal comitato di uso del Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA) e istituzionali Animal Care. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con la guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio, come adottato dalla società per la studio di riproduzione e per l'Animal Welfare Act per la cura di mammiferi marini.
 1. raccolta di sperma di dolphin e crioconservazione <ol><li>preparazione <ol><li>rendere FERT medio (eparina - e ipotaurina-free). Preparare il supporto di FERT-TALP completato con bicarbonato di 25mm, lattato di sodio 22 mM, piruvato di sodio di 1 mM, 6 mg/mL BSA privo di acidi grassi ed eparina 10 mg/mL (pH 7,4). 
		Nota: Preparare questo mezzo il giorno di utilizzo e tenerlo a 38,5 ° C, in un'atmosfera di 5% CO 2 e in aria con umidità massima per almeno 2 h prima dell'uso.</li>
		Tampone di base di tuorlo del uovo preparare TRIS <li>. Sciogliere 30,28 g/L Tris, 16,75 g/L di acido citrico, fruttosio 12,5 g/L e streptomicina 0,5 g/L in acqua ultrapura (pH 7,3, osmolalità = 310 mOsm/kg). Aggiungere il tuorlo d'uovo di 20% (v/v).</li>
	</ol></li> <li>Treno un tursiope maschio di allevamento provata a mentire in dorsale recumbence vicino al bordo della piscina per la raccolta dello sperma volontaria. 
	Nota: Il delfino maschio deve essere addestrato oltre 6 mesi di rinforzo positivo, come descritto in precedenza 4.</li>
	<li>Eseguire varie stimolazioni tattili premendo delicatamente sulla zona cranica della scanalatura genitale del delfino di suscitare volontaria estrusione del pene dalla scanalatura genitale.</li>
	<li>Dopo il raggiungimento di un'erezione completa, dirigere la punta del pene in un contenitore sterile per ottenere ejaculate.</li>
	<li>Mantenere il campione di sperma a 37 ° C fino all'analisi. Ripetere i passaggi da 1.3 e 1.4 per eiaculare successive raccolte, utilizzando un nuovo vetro di propilene ogni volta.</li>
	<li>Immediatamente dopo il prelievo, determinare il volume utilizzando un cilindro graduato in vetro precedentemente riscaldato a 37 ° C. Evaluate il colore, pH e osmolarità (utilizzando un micro-Osmometro) del liquido seminale.</li>
	<li>Di valutare la concentrazione di spermatozoi nel liquido seminale, aggiungere 10 µ l della sospensione di sperma in una provetta eppendorf contenente 90 µ l di acqua distillata. Determinare la concentrazione di spermatozoi utilizzando uno spermatozoo contando camera. 
	Nota: Durante la valutazione, mantenere il resto del liquido seminale a 37 ° C.</li>
	<li>Valutare i parametri di motilità.
	<ol><li>Prendere 10 µ l di campione di sperma e metterlo in una camera di sperma pre-riscaldato.</li>
		<li>Valutare la motilità utilizzando un sistema di analisi computerizzata dello sperma, precedentemente convalidato per il tursiope, valutare oggettivamente la motilità dello sperma 2. 
		Nota: Se necessario, è possibile diluire il campione di sperma con il mezzo di FERT (eparina - e ipotaurina-free) per un'adeguata visualizzazione della motilità degli spermatozoi. Durante la valutazione, mantenere il campione a 37 ° C su una fase di microscopio riscaldata.</li>
	</ol></li> <li>Prendere 20 µ l di campione di sperma e valutare la morfologia di attuabilità e sperma come descritto in precedenza 5.</li>
	<li>Trasferire il campione di sperma per una provetta da centrifuga. Centrifugare il campione di sperma a 250 x g per 5 min. Dopo determinare la concentrazione di spermatozoi utilizzando una camera di conteggio, regolare la concentrazione di spermatozoi a 400 x 10 6 spermatozoi/mL. 
	Nota: Se necessario, è possibile diluire il pellet dal concentrato eiacula con plasma seminale isolato da un volume in eccesso di liquido seminale stesso mediante centrifugazione (250 x g, 10 min).
	<ol><li>Nel corso di 5 min, diluire lentamente lo sperma campione 1:1 (v/v) con un tampone TRIS, uovo tuorlo-base 1,5% glicerolo. Collocare la provetta contenente la sospensione di sperma a 5 ° C per 1 h 30 min.</li>
		<li>Eseguire una seconda diluizione della sospensione di sperma con un TRIS uovo tuorlo-base tampone contenente glicerolo per ottenere una concentrazione di glicerolo finale del 3% e una concentrazione finale di 200 x 10 6 spermatozoi/mL. Mantenere la sospensione di sperma a 5 ° C per 10 min.</li>
	</ol></li> <li>Caricare la sospensione di sperma nelle cannule di 0,25 mL. Saldatura a caldo le cannucce. Posto le cannucce in un rack da 4,5 cm di sopra dell'azoto liquido per 10 min. tuffano le cannucce l'azoto liquido e memorizzare fino a valutazione.</li>
</ol> 2. Eterologa In Vitro fertilizzazione usando Zona intatta bovina ovociti soluzione <ol><li>preparazione <ol><li>preparare la colorazione e il mezzo di montaggio.
		<ol><li>Soluzione di riserva di Hoechst preparare sciogliendo 1 mg di Hoechst in 1 mL di acqua distillata. Fare 30 aliquote µ l e tenerli al buio a-20 ° C fino all'utilizzo. Preparare soluzione colorante aggiungendo 25 µ l di soluzione madre di Hoechst a 5 mL di tampone fosfato salino (PBS) completato con 1 g/L PVA. Mescolare bene e tenere al buio a 4 ° C fino all'utilizzo.</li>
			Mezzo di montaggio <li>preparare mescolando 6,25 mL di PBS con 6,25 mL di glicerolo e 6,25 µ l di soluzione madre di Hoechst. Mescolare bene e tenere al buio a 4 ° C fino all'utilizzo.</li>
		</ol></li> <li>Preparare il supporto per la fertilizzazione di collezione e in vitro degli ovociti.
		<ol><li>Preparare soluzione salina aggiungendo 0,5 mL della gentamicina a 0,9% NaCl distillata acqua.</li>
			<li>Preparare il supporto di maturazione stock aggiungendo 10 ng/mL il fattore di crescita epidermico (EGF) e 10% di siero fetale di vitello (FCS) a 10 mL di TCM-199. Mantenere entrambi i media a 38,5 ° C, in un'atmosfera di 5% CO 2 e in aria con umidità massima per almeno 2 h prima dell'uso.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Raccogliere le ovaie al macello in soluzione salina a 33-35 ° C e loro trasporto al laboratorio entro 4 ore dalla raccolta.</li>
	<li>Una volta in laboratorio, lavare le ovaie tre volte per rimuovere i detriti e sangue utilizzando soluzione salina precedentemente riscaldato a 37 ° C. mantenere le ovaie in soluzione salina a 37 ° C durante il processo di.</li>
	<li>Aspirato follicoli di 2 a 8 mm con un G 18 ago e una siringa da 10 mL. Raccogliere il liquido follicolare aspirato in provette da 50 mL.</li>
	<li>Consentire il liquido follicolare contenente gli ovociti a riposare per circa 15 min a 37 ° C, fino a che il sedimento di cellule. Rimuovere il surnatante del tubo con una pipetta Pasteur e risospendere il pellet in PBS.</li>
	<li>Recuperare i complessi cumulo-ovocita (COC) in piastre da 90 mm sotto un microscopio stereoscopico.</li>
	<li>Lavare il COC tre volte in PBS e una volta in mezzo maturazione.</li>
	<li>Trasferimento morfologicamente normale COC a piatti 4 pozzetti, ciascuno contenente ben 500 mL di terreno di maturazione, in gruppi di 50 COC per pozzetto. 
	Nota: Qui, tre pozzi &#8211; un pozzetto per eterologa FIVET, un controllo bene per FIVET omologhe e uno ben contenente solo maturato COC come controllo partenogenetico &#8211; sono stati usati.</li>
	<li>Incubare il CoC per 24 h a 38,5 ° C, in un'atmosfera di 5% CO 2 e in aria con umidità massima.</li>
	<li>Preparare il mezzo ed il gradiente di densità.
	<ol><li>Di preparare il supporto di fertilizzazione (FERT), integrare medium FERT-TALP con bicarbonato di 25 mM, lattato di sodio 22 mM, piruvato di sodio di 1 mM, 6 mg/mL BSA privo di acidi grassi e l'eparina 10 mg/mL. Mantenere a 38,5 ° C, in un'atmosfera di 5% CO 2 e in aria con umidità massima per almeno 2 h prima dell'uso.</li>
		<li>Preparare il gradiente di densità aggiungendo 1 mL di terreno gradiente di densità in una provetta da 15 mL e 3 mL di soluzione in una provetta da 15 mL di lavaggio. Mantenerli a 38,5 ° C per almeno 1 h.</li>
	</ol></li> <li>Lavare la in vitro maturato ovociti due volte nel mezzo FERT.</li>
	<li>Trasferire gli ovociti alle 4 pozzetti piatti, ciascuno contenente ben 50 COC in 250 mL di FERT. Mantenere i piatti 4 pozzetti a 38,5 ° C, in un'atmosfera di 5% CO 2 e in aria con umidità massima durante la preparazione dello sperma per fertilizzazione.</li>
	<li>Scongelare una cannuccia congelata contenenti gli spermatozoi delfino in un bagno di acqua a 37 ° C per 50 s. 
	Nota: Sperma bovino per la FIVET omologa dovrà essere elaborato in parallelo, seguendo il protocollo standard per IVF bovino omologo.</li>
	<li>Prendere 10 µ l di sperma campione e posizionarlo in un pre-riscaldato sperma camera di conteggio. Valutare la motilità utilizzando un sistema di analisi computerizzata dello sperma, precedentemente convalidato per le specie, valutare oggettivamente la motilità dello sperma. Durante questo tempo, mantenere il campione di sperma a 38,5 ° C.</li>
	<li>Aggiungere il campione di sperma per il tubo del gradiente di densità (passo 2.10.2). Centrifugare per 10 min 250 x g.</li>
	<li>Attentamente rimuovere il surnatante con una pipetta Pasteur. Aggiungere 3 mL di soluzione di lavaggio nella provetta contenente il pellet. Risospendere il pellet miscelando delicatamente.</li>
	<li>Centrifuga per 5 min a 250 x g. eliminare il surnatante con una pipetta Pasteur ad un volume di sperma di 300 µ l.</li>
	<li>Aggiungere 5 µ l della sospensione di sperma in una microcentrifuga contenente 95 µ l di acqua distillata. Mantenere la sospensione di sperma a 38,5 ° C. Inserire il conteggio delle cellule dell'alloggiamento con 10 µ l del 01:20 misura la concentrazione e diluizione dello sperma. Calcolare la quantità di mezzo FERT che deve essere aggiunto a 100 µ l degli spermatozoi per ottenere spermatozoi/mL di 2 x 10 6.</li>
	<li>Aggiungere il volume calcolato di FERT e sperma in una provetta da 15 mL e mescolare delicatamente utilizzando una pipetta Pasteur.</li>
	<li>Aggiungere 250 µ l della sospensione di sperma-FERT in ciascun pozzetto del piatto 4 pozzetti contenenti il mezzo FERT con gli ovociti stagionati per ottenere una concentrazione finale di 1 x 10 6 spermatozoi/mL.</li>
	<li>Co-Incubare i gameti per 18 h a 38,5 ° C, in un'atmosfera di 5% CO 2 e in aria con umidità massima.</li>
	<li>Preparare il terreno di coltura basato sul sintetico liquido oviduttali completato con 5% FCS. Preparare 25 µ l di gocce di coltura fluidi oviduttali sintetico in 35mm piatti coperti con 3 mL di olio minerale. Mantenere a 38,5 ° C, in un'atmosfera di 5% CO 2 e in aria con umidità massima per almeno 2 h prima dell'uso.</li>
	<li>a 2,5 h post co-incubazione, rimuovere 20 ovociti dal piatto; mantenere gli ovociti rimanenti nell'incubatrice alle stesse condizioni.
	<ol><li>Pipettare vigorosamente la metà degli ovociti attraverso una pipetta di Pasteur stretto-foro 10 volte per rimuovere gli spermatozoi senza bloccare allegati.</li>
		<li>Difficoltà 20 ovociti in 50 µ l di 0,5% glutaraldeide per 30 min. lavare gli ovociti in PBS per 5 min, trasferire gli ovociti a 50-µ l di soluzione colorante Hoechst per 15 min e lavare gli ovociti in PBS per 5 min.</li>
		<li>Trasferire gli ovociti individualmente alle 2 µ l gocce di mezzo di montaggio a un tasso di 10 ovociti per ogni diapositiva. Delicatamente, coprire con un vetrino coprioggetto e sigillare con smalto.</li>
		<li>Contare il numero di spermatozoi associata agli ovociti bovini utilizzando un microscopio a contrasto di fase dotato di ottica epifluorescente e un filtro di eccitazione 361 nm a 40 ingrandimenti.</li>
	</ol></li> <li>Dopo 12 h di co-incubazione, rimuovere 10 zigoti presuntiva dai piatti 4 pozzetti; mantenere gli zigoti presuntivi rimanenti nell'incubatrice alle stesse condizioni.
	<ol><li>Trasferimento 10 zigoti presuntiva di una centrifuga 15 mL tubo da 2 mL di PBS e vortice delicatamente per 2 minuti per rimuovere le cellule del cumulo. Lavare due volte in PBS, correzione e macchia, come precedentemente descritto (passo 2.23.2.)</li>
	</ol></li> <li>Dopo 18, 20, 22 e 24 h di co-incubazione, rimuovere 10 zigoti presuntiva dal 4 pozzetti piatti e vortice, difficoltà e macchiare loro come descritto in precedenza (passo 2.23.2). Mantenere il resto degli zigoti presuntiva in incubatrice alle stesse condizioni.
	<ol><li>Valutare formazione pronuclei e gamete sotto un microscopio di fase-contrasto/epifluorescente in entrambi i gruppi di FIVET omologhi ed eterologi macchiando con Hoechst.</li>
		<li>Valutare pronuclei formazione in 10 zigoti scelti a caso ibrido presuntiva per campione. Confermare pronuclei formazione sotto un laser confocale scansione microscopio all'eccitazione del laser di argon a 488 nm e rilevamento di 515 a 530 nm.</li>
		<li>Sezione otticamente zigoti presuntiva in sequenza (2 mm) e raccogliere immagini utilizzando un software di imaging. Visualizzare utilizzando un pacchetto di software di analisi 3D.</li>
		<li>Dopo 24 h di co-incubazione, lavare 50 zigoti presuntiva quattro volte in PBS e due volte nel mezzo di coltura.</li>
	</ol></li> <li>Trasferirli in gruppi di 25 microgocce di terreno di coltura precedentemente preparato e i.</li>
	<li>Maintain a 38,5 ° C in un'atmosfera di 5% O 2 / 5% CO 2 e in aria con umidità massima.</li>
	<li>Dopo 26 e 28 h di co-incubazione, rimuovere 10 zigoti presuntiva dai piatti e il vortice, la correzione e macchiare la loro, come descritto in precedenza (passo 2.23.2).</li>
	<li>Dopo 48 h di cultura, osservare il clivaggio sotto uno stereomicroscopio.</li>
	<li>Trasferimento degli embrioni per una soluzione di proteasi di 5 mg/mL per rimuovere la zona pellucida (ZP).</li>
	<li>Lavare singolarmente ogni embrione tre volte in PBS. Snap-freeze li in azoto liquido in provette da 0,2 mL microcentrifuga. Conservarli a-80 ° C fino all'analisi.</li>
</ol> 3. PCR <ol><li>materiali e reagenti Nota: I reagenti, materiali e attrezzature utilizzate per eseguire il protocollo PCR sono dettagliati nella tabella materiali e includono una cremagliera del tubo PCR e un set di micropipette (P2, P20, P200, P1000), 1,5 mL microcentrifuga, provette per PCR e tappi, un termociclatore, un illuminatore UV gel di agarosio e tampone (Tris Borato EDTA (TBE)).
	<ol><li>Scongelare delicatamente tutti i reagenti sul ghiaccio. Mantenerle in ghiaccio in tutto l'esperimento. Utilizzare deossinucleotidi (dNTPs; dATP, dCTP, dTTP e dGTP), target primer su riferimento gene codificante per la proteina ribosomale delfino 18 S (DQ404537.1); R1: TTGGACACACCCACGGTGCGG e F2: CAGAAGGACGTGAAGGATGGA), DNA polimerasi, 5 X buffer per il modello della polimerasi del DNA, DNA, acqua sterile e cloruro di magnesio (MgCl 2 ad una concentrazione finale di 5,0 mM).</li>
		<li>Dell'agarosi gel e preparazione di campioni.
		Campioni <ol><li>preparare delfino e bovino DNA spermatico.
			<ol><li>Disgelo una cannuccia congelata di ogni specie in un bagno di acqua a 37 ° C per 50 s. aggiungere 3 mL di soluzione di lavaggio. Centrifuga a 250 x g per 10 min. eliminare il surnatante. Aggiungere 30 µ l di tampone di lisi STES (50 mM Tris-HCl, pH 8; 20 mM NaCl; e 1 mM 0,1% SDS), 2 µ l di proteinasi K (20 mg/mL) e 5 µ l di ditiotreitolo (DTT); concentrazione finale: 150 mM. Mantenere durante la notte a 55 ° C. aggiungere 200 µ l di acqua ultrapura. Centrifuga a 250 x g per 5 min, tenere il supernatante. Misurare la concentrazione di DNA usando uno spettrofotometro.</li>
			</ol></li> <li>Eseguire diluizioni seriali di DNA da spermatozoi Delfino (cioè, 40, 4 e 0,4 ng/mL) con acqua ultrapura per verificare che le condizioni PCR sono in grado di rilevare una piccola quantità di delfino DNA.</li>
			<li>Eseguire diluizioni seriali di sperma di bovini del DNA (cioè, 4.000, 400, 40 e 4 ng/mL) con acqua ultrapura per verificare che le condizioni PCR sono in grado di rilevare una piccola quantità di DNA bovino.</li>
			<li>Preparare gli embrioni dei delfini e bovino. Scongelare gli embrioni su ghiaccio. Aggiungere 8 µ l di proteinasi di 100 µ g/mL K e mantenere durante la notte a 55 ° C. Per interrompere la reazione, posizionare i campioni a 96 ° C per 5 min.</li>
			<li>Preparare buffer di TBE del gel di agarosio 2% e aggiungere 20 µ l di acido nucleico macchia utilizzando tecniche standard.</li>
		</ol></li> <li>Preparazione di PCR.
		<ol><li>Provette PCR etichetta: diluizioni seriali del delfino (40, 4 e 0,4 ng/mL), bovini diluizioni seriali (4.000, 400, 40 e 4 ng/mL), omologo bovino embrione di due cellule, embrioni eterologi presuntivi di due celle e controllo negativo.</li>
			<li>Preparare un master in una microcentrifuga da 1,5 mL sterile ad un volume finale di 25 µ l per reazione.
			<ol><li>Aggiungere 5 µ l di tampone di flexi 5 di polimerasi del DNA di X, 0,5 µ l di dNTP (10 mM) 1,5 µ l di MgCl 2 (25 mM), 0,5 µ l di primer forward e reverse (10 µM), 1,5 µ l della mascherina del DNA (sperma) o 8 µ l della mascherina del DNA (due-cellula embrioni) , 0,07 µ l della Taq polimerasi e sterile distillata fino ad un volume finale di 25 µ l. Mescolare bene.</li>
			</ol></li></ol></li></ol></li> <li>Protocollo di amplificazione <ol><li>posizionare i tubi nel termociclatore. Selezionare il seguente programma: 94 ° C per 3 min; 40 cicli di 94 ° C per 15 s, 59 ° C per 25 s, 72 ° C per 20 s; e 72 ° C per 5 min, avviare il programma.</li>
		<li>Conservare le provette a 4 ° C. aggiungere 2,5 µ l di tampone di caricamento per ogni prodotto PCR a 4 ° C e carico 15 µ l della miscela nei pozzetti del gel di agarosio al 2%. Utilizzare un marcatore di scala del DNA per la stima precisa dimensione dei frammenti PCR.</li>
		<li>Eseguire l'elettroforesi per 15 minuti consentire la migrazione del DNA. Visualizzate bande utilizzando un illuminatore UV.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Per molte diverse specie di mammiferi, ci sono diversi vantaggi nell'utilizzo di spermatozoi congelati. Questi includono la capacità di trasferire il prezioso materiale genetico, il potenziale per la distribuzione in tutto il mondo, il basso rischio di contaminazione e la capacità di conservare i gameti maschili per decenni. L'utilizzo di spermatozoi crioconservati è essenziale per il tursiope, perché questa specie è protetta in appendice II della CITES, che limita il trasporto e lo scambio di animali tra diversi parchi ...

Tecnologie di riproduzione assistita sono scarsamente sviluppate negli animali selvatici, tra cui mammiferi marini. La mancanza di metodi sensibili per valutare il successo di fertilizzazione dello sperma contribuisce allo sviluppo lento delle tecnologie riproduttive in specie come il delfino. Non era fino a poco tempo che il base parametri seminali di tursiope (Tursiops truncatus) sono stati segnalati1,2. Tuttavia, le variabili come motilità e morfologia, sebbene ampiamente usato, dare informazioni limitate sull'efficienza riproduttiva. Il migliore indicatore della qualità dello sperma è la valutazione del potenziale fecondante.
Recentemente, il nostro gruppo ha utilizzato un metodo per valutare sperma delfino potenziale di fertilizzazione valutando formazione pronuclei maschile e/o formazione dell'embrione ibrido dopo FIVET eterologa utilizzando ovociti bovina intatta zona3. L'uso della FIVET eterologa delfino-bovino ha importanti vantaggi rispetto alle FIVET omologa, come supera la difficoltà di ottenere ovociti delfino e facilita l'uso dei sistemi di maturazione ben testati in vitro degli ovociti bovini. Al fine di evitare la specificità di specie, la fecondazione eterologa è generalmente svolta in assenza di ZP. Anche se esso consente per la valutazione della capacità degli spermatozoi ha reagito acrosomiale di fondersi con la membrana vitellina, si altera la valutazione di altre caratteristiche legate alla fertilizzazione. La procedura descritta utilizza zona intatta ovociti e permette la valutazione dei seguenti parametri: associazione di zona di sperma e allegato, penetrazione, gamete, formazione pronuclei e fenditura dell'embrione ibrido.
Qui, presentiamo diversi protocolli per la raccolta dello sperma, sperma base analisi, congelamento di spermatozoi così come la valutazione della funzionalità degli spermatozoi delfino valutando formazione maschile dell'embrione di pronuclei e/o ibrido dopo FIVET eterologa utilizzando zona intatta ovociti bovini.

<table><tbody><tr><td>FERT-TALP medio</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TCM-199</td><td>Sigma</td><td>M-4530</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma</td><td>B-2261</td><td></td></tr><tr><td>Piastre a 4 pozzetti</td><td>Nunc</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>Gradiente di densità BoviPure</td><td>Nidacon International</td><td>BP-100</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di lavaggio Boviwash</td><td>Nidacon International</td><td>BW-100</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio</td><td>Promega</td><td>A35 1H</td><td></td></tr><tr><td>Acqua sterile</td><td>Mili Q sintesis A10 Millipore</td><td>A35 1H</td><td></td></tr><tr><td>Tampone Tris Borato EDTA</td><td>Sigma</td><td>T4415</td><td></td></tr><tr><td>MB agarosio</td><td>Biotools</td><td>20.012</td><td></td></tr><tr><td>5X GoTaq flexi buffer</td><td>Mili Q sintesis A10 Millipore</td><td>M 890 A</td><td></td></tr><tr><td>MB agarosio</td><td>Biotools</td><td>20.012</td><td></td></tr><tr><td>Taq polimerasi</td><td>Promega</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SafeView</td><td>NBS Biologicals Ltd.</td><td>M 890 A</td><td></td></tr><tr><td>Camera di conteggio Makler</td><td>Camera Thoma Sefi Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Camera</td><td>Hecht-Assistant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pHmetro MicropH 2000</td><td>Crison Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Osmometro Micro osmometro avanzato 3300</td><td>Norwood</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema di analisi dello sperma assistito da computer</td><td>Projectes y Serveis R+D</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio MZ 95</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ottica epifluorescente Eclipse Te300</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Assistente confocale 4.02 Software</td><td>Bio-Rad</td><td>Software di analisi</td><td></td>3D</tr><tr><td>Microscopia confocale a scansione laser</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropippetes (P2. P20, P200, P1000)</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luminatore UV</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR Termociclatore Primus 96 Plus</td><td>MWG AG Biotech</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

bottlenose dolphin (tursiops truncatus) spermatozoi: raccolta, crioconservazione e fecondazione in vitro eterologa

Bottlenose Dolphin (Tursiops truncatus) Spermatozoa: Collection, Cryopreservation, and Heterologous In Vitro Fertilization

L'uso degli spermatozoi crioconservati delfino facilita lo scambio di materiale genetico tra parchi acquatici e rende gli spermatozoi accessibile ai laboratori per studi per avanzare la nostra comprensione della riproduzione di mammiferi marini. FIVET eterologa, un sostituto per la FIVET omologa, potrebbe fornire un mezzo per testare la fertilità dello sperma potenziali; per studiare la fisiologia dei gameti e sviluppo iniziale dell'embrione; e per evitare l'uso di ovociti prezioso dei delfini, che sono difficili da ottenere. Qui, presentiamo i protocolli che sono stati utilizzati con successo per raccogliere e crioconservare gli spermatozoi delfino. La raccolta di sperma viene eseguita da stimolazione manuale su delfini addestrati. Crioconservazione avviene utilizzando un extender di tuorlo d'uovo basata TRIS con glicerolo. Inoltre, vi presentiamo un protocollo che descrive la FIVET eterologa utilizzando delfino gli spermatozoi e gli ovociti bovini e che verifica la natura ibrida dell'embrione risultante usando la PCR. Fecondazione eterologa solleva interrogativi sulla fecondazione e può essere utilizzata come strumento per studiare la fisiologia dei gameti e sviluppo iniziale dell'embrione. Inoltre, il successo della FIVET eterologa dimostra il potenziale di questa tecnica per testare le capacità, che vale la pena di ulteriore esame di fecondante dello spermatozoo di delfino.

Tutti i risultati, tabelle e figure (1 e 2) qui presentate sono stati riprodotti con autorizzazione3.
Gli spermatozoi dei delfini hanno alta motilità dopo congelamento e scongelamento
Il delfino congelati eiacula ha mostrato percentuali (% ± SD) di 84,5 ± 5,3 totale motili e 69,1 ± 5.1 spermatozoi mobili progressivi. In termini di motilità, questi ...

Qui, presentiamo i protocolli che sono stati utilizzati con successo per la collezione di spermatozoi di dolphin, crioconservazione e prestazioni di FIVET eterologa usando i oocytes bovina.

Bottlenose Dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoi: raccolta, crioconservazione e fecondazione In Vitro eterologa

The use of cryopreserved dolphin spermatozoa facilitates the exchange of genetic material between aquatic parks and makes spermatozoa accessible to ...

L'obiettivo generale di questa tecnica è valutare la funzionalità dello sperma di delfino criopreservato mediante fecondazione in vitro eterologa, utilizzando spermatozoi di delfino criopreservati e ovociti bovini con zona pellucida integra. In questo video, mostreremo come raccogliere, valutare e criopreservare gli spermatozoi di delfino. Successivamente, valuteremo l'interazione e la penetrazione dello sperma fino alla zona pellucida.Formazione del pronucleo maschile e scissione dell'embrione ibrido. Un problema fondamentale nello sviluppo delle tecnologie riproduttive assistite è la valutazione della funzione spermatica, che viene meglio indicata dalla capacità dello spermatozoo di fecondare. Le tecniche di fecondazione in vitro omologa sono comunemente utilizzate per valutare la funzione spermatica, ma l'ottenimento di ovociti di delfino è molto difficile.Il principale vantaggio della fecondazione in vitro eterologa è la sua semplicità. Gli ovociti bovini sono facilmente ottenibili e possono essere processati in vitro mediante protocolli ben collaudati. Illustreremmo inoltre come criopreservare gli spermatozoi del delfino utilizzando vapori di azoto liquido.Una tecnica semplice che non richiede attrezzature per il congelamento altamente specializzate. Per questa procedura, il delfino maschio dovrebbe essere stato precedentemente addestrato per sei mesi utilizzando il rinforzo positivo. Far sdraiare l'animale in posizione supina vicino al bordo della vasca.Eseguire varie stimolazioni tattili premendo delicatamente sulla regione craniale del solco genitale per indurre l'estroflessione volontaria del pene. Dopo aver ottenuto un'erezione completa, indirizzare la punta del pene verso un contenitore sterile. Mantenere l'eiaculato a 37 gradi Celsius fino all'analisi.Ripetere, se necessario, la stimolazione tattile per raccolte successive di eiaculato utilizzando ogni volta un nuovo vetro di polipropilene. Valutare immediatamente dopo la raccolta gli eiaculati mantenendoli a 37 gradi Celsius per tutto il tempo. Determinare il volume, il colore, il pH e l'osmolarità degli eiaculati.Quindi, da un'aliquote di 10 microlitri, determinare la concentrazione di spermatozoi in una camera di conteggio. Posizionare l'eiaculato su un vetrino su un palchetto microscopico riscaldato a 37 gradi Celsius. Valutare la motilità degli spermatozoi mediante un sistema di analisi assistita al computer.Se necessario, diluire lo sperma con mezzo di fecondazione per una migliore visualizzazione. Successivamente, utilizzando un'aliquota di 20 microlitri di eiaculato, valutare la vitalità e la morfologia degli spermatozoi mediante colorazione convenzionale con Eosina Nigrosina e Spermac. Per la crioconservazione, trasferire innanzitutto il campione di sperma in una provetta per centrifuga.Quindi centrifugare gli spermatozoi a 250 G per cinque minuti. Ora, nell'arco di cinque minuti, effettuare lentamente una diluizione 1:1 del campione di sperma con un buffer a base di tuorlo d'uovo in tracce contenente il 1,5% di glicerolo. Successivamente, raffreddare il campione al 5% di Celsius per 1,5 ore.Un'ora dopo, ripetere la diluizione 1:1 con lo stesso tampone e quindi mantenere la sospensione degli spermatozoi a cinque gradi Celsius per 10 minuti. Successivamente, caricare la sospensione in capillari da 0,25 millilitri e sigillarli a caldo. Caricare i capillari in un portacapillari e sospendere il portacapillari a 4,5 centimetri sopra l'azoto liquido per 10 minuti.Quindi immergere immediatamente le cannucciole nell'azoto liquido per la conservazione a lungo termine. Per questo protocollo, utilizzare ovaie bovine conservate in soluzione salina calda, raccolte entro le ultime tre ore. Iniziare lavando le ovaie tre volte con soluzione salina.Mantenendoli sempre a 37 gradi Celsius. Successivamente aspirare tutti i follicoli da due millimetri a otto millimetri utilizzando un ago da 18 gauge e una siringa. Trasferire in un tubo da 50 millilitri e lasciare sedimentare gli oociti per 15 minuti.Quindi rimuovere il soprannatante e ri-sospendere i follicoli in PBS. Recuperare i COC al microscopio stereoscopico in piatti da 90 millimetri. Selezionare gli oociti di grado uno e due, che presentano un citoplasma omogeneo e sono circondati da almeno tre strati di cellule del cumulo.Trasferire questi ovociti nel PBS in una piastra da 35 millimetri. Successivamente, lavare i COC tre volte nel PBS e una volta nel mezzo di maturazione. Quindi, caricare i COC in piastre a quattro pozzetti con 50 COC e 500 millilitri di mezzo di maturazione per pozzetto, quindi incubare i COC per 24 ore.Una volta che gli oociti presentano cellule del cumulo espanso, sono maturi. Lavare quindi gli oociti due volte nel mezzo di fecondazione e trasferirli in piatti da quattro pozzetti, in gruppi di 50, con 250 millilitri di mezzo di fecondazione per pozzetto. A questo punto, riporre i COC nell'incubatore e preparare lo sperma per la fecondazione.Riempire una cannuccia congelata contenente spermatozoi di delfino e una cannuccia contenente spermatozoi bovini in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per 50 secondi. Quindi valutare la loro motilità in modo soggettivo utilizzando un microscopio a contrasto di fase. Successivamente trasferire il campione di sperma in un tubo con gradiente di densità e centrifugarlo per 10 minuti a 250 G. Rimuovere con attenzione il soprannatante.Aggiungere nuovamente tre millilitri della soluzione di lavaggio. Successivamente, risospendere gli spermatozoi con un'accurata miscelazione. Centrifugare nuovamente il tubo ed eliminare la maggior parte del soprannatante, lasciando gli spermatozoi in 300 microlitri.Ora conta gli spermatozoi e regola la concentrazione a due milioni per millilitro, diluiti con mezzo di fecondazione. Aggiungi 250 microlitri della sospensione in ogni pozzetto contenente ovociti, in modo da ottenere una concentrazione finale di spermatozoi di un milione per millilitro. Al microscopio stereoscopico, osserva gli ovociti maturi espansi circondati da spermatozoi mobili di bovino o di delfino, che sono più piccoli rispetto agli spermatozoi bovini.Coincubare i gameti per 18 ore. Per valutare l'interazione degli spermatozoi con la zona pellucida, rimuovere 20 ovociti dalla piastra a 2,5 ore dalla coincubazione. Rimuovere gli spermatozoi legati in modo lasso pipettando vigorosamente attraverso una pipetta di Pasteur a foro stretto.Successivamente fissare e colorare gli oociti con gli uncini a 3342. Trasferire singolarmente gli oociti colorati in gocce di due microlitri di mezzo di montaggio e contare il numero di spermatozoi attaccati agli oociti utilizzando un microscopio a contrasto di fase. A partire da 18 ore di co-incubazione, trasferire i 10 zigoti presuntivi in una provetta da centrifuga da 15 millilitri contenente due millilitri di PBS ed eseguire un'agitazione delicata con vortex per tre minuti per rimuovere le cellule del cumulo.Lavare due volte in PBS e fissare e colorare come precedentemente descritto. Inoltre, a 18 ore di co-incubazione, raccogliere 50 zigoti per la coltura. Vortexare per tre minuti in PBS, quindi lavarli due volte in PBS.Dopo aver lavato i zigoti selezionati con citoplasma omogeneo per la coltura, trasferirli in gruppi di 25 in gocce da 25 microlitri di fluido oviduttale sintetico integrato con siero fetale bovino al 5%. Successivamente coltivare gli zigoti presuntivi per 48 ore e valutarne la percentuale di scissione utilizzando un microscopio stereoscopico.Successivamente, valutare ulteriormente il loro patrimonio genetico mediante PCR secondo il protocollo descritto nel testo. Gli spermatozoi provenienti da ejaculati di delfino scongelati erano mobili per circa l'85% e progressivamente mobili per il 70%. Questi valori sono rappresentativi di spermatozoi criopreservati di alta qualità.Gli spermatozoi di delfino si sono attaccati alla zona pellucida bovina dopo 2,5 ore di coincubazione in una percentuale più elevata rispetto agli spermatozoi bovini. Gli spermatozoi di delfino sono stati in grado di penetrare gli ovociti bovini con zona pellucida integra, portando alla formazione del pronucleo e alla segmentazione. Nel gruppo di fecondazione in vitro eterologa non è stata osservata polispermia.La formazione dei pronuclei ha raggiunto la percentuale massima a 24 ore. La formazione dei pronuclei è stata più rapida nel gruppo omeologo. Il tasso di scissione a 48 ore è stato inferiore nelle fecondazioni eterologhe rispetto a quelle omeologhe.La PCR ha confermato la presenza di materiale genetico di delfino negli embrioni ibridi. Sono stati testati primer per il gene del ribosoma 18 s del delfino, che producono un prodotto di 190 paia di basi. Le corsie da 1 a 30 sono ibridi delfino-bovino.I controlli erano costituiti da DNA di delfino nei pozzetti S e da due embrioni bovini nelle corsie C. Il protocollo presentato per la fecondazione in vitro autologa ha dimostrato che i delfini tursiopi sono in grado di fecondare ovociti bovini integri, generando embrioni eterozigoti.Un'ulteriore evoluzione e ottimizzazione di questa tecnica faciliterà la valutazione della funzionalità dello sperma del delfino. La criopreservazione degli spermatozoi del delfino mediante vapori di azoto liquido è un metodo economico, rapido e semplice che fornisce buoni parametri di motilità profonda e consente una fecondazione in vitro eterologa di successo. L'osservazione che gli spermatozoi del delfino sono in grado di fecondare ovociti bovini apre nuove prospettive di ricerca sulla riproduzione del delfino e di altri animali marini.Solleva inoltre domande sui meccanismi della fecondazione che rimangono in gran parte senza risposta.

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Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

In questo video-articolo vi presentiamo un passo-passo dimostrazione su come raccogliere e crioconservare gli ovociti di criceto con elevate post-disgelo tassi di sopravvivenza. La stessa procedura può anche essere applicato con successo per congelare e scongelare embrioni di topo a diversi stadi di sviluppo preimpianto.

Raccolta e Crioconservazione degli ovociti e di embrioni di topo criceto

Si tratta di un high-throughput protocollo di crioconservazione degli spermatozoi per zebrafish. Spermatozoi crioconservati utilizzando questo protocollo ha una media del 25% la fertilità fertilizzazione in vitro successive ed è stabile per molti anni.

A High-Throughput Metodo per la crioconservazione dello sperma e Zebrafish In Vitro Fecondazione

Un glicole etilenico metodo basato vetrificazione per embrioni di topo è descritto. E 'vantaggioso per altri metodi nella sua semplicità e bassa tossicità embrionale, e quindi può essere ampiamente applicabile a molti ceppi di topi, compresi topi inbred e geni modificati.

Crioconservazione di embrioni di topo da glicole etilenico-Based Vetrificazione

Qui mostriamo il nuovo • I kit per la crioconservazione degli spermatozoi Cryo mouse. Stadio di due cellule sviluppo dell'embrione con decongelati sperma era migliorato costantemente in 5 ceppi di topi con l'utilizzo di questo kit. Nel corso di un periodo di 1,5 anni, 49 linee di topi geneticamente modificati sono stati archiviati dalla crioconservazione degli spermatozoi con la Cryo • I kit e poi recuperato con successo da fecondazione in vitro.

Crioconservazione del mouse Sperm and Recovery utilizzando il Kit · I Cryo

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Un protocollo modificato per la manipolazione ploidia utilizza uno shock termico per indurre una stalla di un ciclo in cytokinesis in embrione precoce. Questo protocollo è illustrato nel zebrafish, ma può essere applicabile ad altre specie.

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Lo scopo principale di questo studio era di adattare l'ago immerso procedura di vitrificazione (NIV) per crioconservare intero zebrafish testicoli. Inoltre, è stata testata la ripetibilità del metodo in cinque zebrafish diversi ceppi.

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Il presente protocollo descrive una procedura di valutazione di sperma di pesce mediante analisi computerizzata dello sperma e dispositivi di raffreddamento. Il software dà un rapido, accurato e l'analisi quantitativa della qualità dello sperma di pesce basata sulla motilità degli spermatozoi, che può essere un utile strumento nel settore dell'acquacoltura per migliorare il successo di riproduzione.

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Questo protocollo descrive un percorso semi-automatizzato per migliorare l'efficienza e la capacità di elaborazione e crioconservazione dello sperma proveniente da specie di coralli minacciate, con l'obiettivo di garantire la diversità genetica e sostenere gli sforzi di ripristino della barriera corallina.

Un flusso di lavoro semi-automatizzato per la crioconservazione di sperma di corallo a supporto del biobanking e dell'acquacoltura

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Scopri la raccolta, la crioconservazione e la fecondazione in vitro eterologa di spermatozoi di delfino Tursiops truncatus. Questo metodo consente di valutare la funzionalità dello sperma criopreservato.

Bottlenose Dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoi: raccolta, crioconservazione e fecondazione In Vitro eterologa

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