Name: Produzione rapida del taglio nei funghi via Agrobacterium Trasformazione mediata di componenti di eliminazione OSCAR (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: Scopri come generare mutanti di delezione genica precisi nei funghi usando il metodo OSCAR e la trasformazione mediata da Agrobacterium. Questa tecnica accelera la costruzione di plasmidi per studi di genetica funzionale.

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Gli autori ringraziano i seguenti studenti universitari e scuole superiori per il loro lavoro per generare mutanti OSCAR nei verticillioidi di Fusarium : Anjellica Miller, Athar Naseer, Xiu Lin, Katelyn Woodburry, Chelsea Patterson, Kathleen Robertson, Krystina Bradley, Ashton Rogers, Alexis McKensie, Manny Hernandez Cookie, Jake Goodman, Sampriti De, Oge Okoye, Alyssa Beckstead, Garrett Hibbs, Nick Goldstein, Caroline Twum, Ashley Crepsac, Jeff Delong, Christian King, Gi Jeong, Maria Belding, Christy Burre, Chris Benson, Louis Stokes, Hannah Itell, Jane Hulse, Jasim Mohammed, James Loggins, Kelli Russell, Gre&#39;Nisha Jones, Kristin Sheaffer, Mariam Hammady, Ava Wilson, Katrina Bazemore, Toney Harper, Karlin McGhee, Mohmed Momin, Rima Momin , Thi Ngoc Le e Angel Pham.

1. Primer Design per amplificazione PCR di geni <ol><li> Scaricare in una lima di elaborazione di testi la regione genomica del gene di interesse (GOI) incluso il frame open reading (ORF) e almeno 2 kb affiancando il gene da entrambi i lati da FungiDB o da un&#39;altra risorsa genomica. </li><li> Evidenziare l&#39;ORF destinato alla cancellazione e all&#39;avvio dell&#39;etichetta e fermare i codoni. </li><li> Identificare e evidenziare gli ORF adiacenti all&#39;interno della sequenza scaricata. </li><li> Utilizzare l&#39;estremità 2 kb 5 &#39;del GOI ORF e lo strumento di progettazione di primer (vedere Elenco materiali) per progettare la coppia di primer PCR O1 e O2 per generare un prodotto di dimensioni minime di 1 kb. Fare attenzione a non influenzare ORF adiacenti. <ol><li> Incollare il fianco 2 kb 5 &#39;nella finestra &quot;Sequence Entry&quot;. Fai clic su &quot;Mostra parametri personalizzati&quot;. Immettere i seguenti parametri di progettazione personalizzati: primer TM 58 (min), 60 (opt) e 62 (max); Primer GC 40 (min), 50 (opt) e 60 (max); Formato primer 22 (min), 24 (opt) e 26(Max); Amplicon Dimensione 1250 (min), 1500 (opt) e 2000 (max). </li><li> Scegli il risultato che pone il primer inverso (O2) più vicino all&#39;ORF. Cattura un colpo di schermo dei dosaggi e copia e incolla le sequenze primer nel documento di elaborazione di testi. </li><li> Ripetere il processo per 3 &#39;fianco per generare primer O3 e O4, questa volta scegliere il risultato che pone il primer avanzato (O3) più vicino all&#39;ORF bersaglio. </li></ol></li><li> Aggiungere i siti appropriati di collegamento a 5 &#39;estremità dei primer da 1 a 4 (vedi tabella 1 ). </li><li> Inoltre progettare e ordinare primer specifici ORF da utilizzare per la conferma della cancellazione nella sezione 4 di seguito. I parametri devono essere identici a quelli descritti nel passaggio 1.4.1, ad eccezione dell&#39;utilizzo Amplicon Size 500 (min), 750 (opt) e 1000 (max) regolazione per lunghezza di ORF, se necessario. Infine, per la conferma di ricombinanti omologhi, generare 5 &#39;out e 3&#39; out primers trovato appena fuori i fianchi all&#39;interno del cromosoma. Questi primer &quot;fuori&quot; verranno usati conRispettivamente hygR (210) e hygF (850) ( Fig. 2 ). </li><li> Primer di ordine. </li></ol> 2. Produzione di costruzioni OSCAR <ol><li> Utilizzando una Taq ad alta fedeltà , eseguire due reazioni, ciascuna per i fianchi 5 &#39;e 3&#39;, utilizzando primer (100 μM) O1 e O2 in una reazione e primer O3 e O4 nel secondo. La miscela di reazione contiene le seguenti: 29,5 μL di acqua distillata sterile (SDW), 5 μL di 10 volte LA PCR tampone, 8 μL di 2,5 mM dNTP mix, 5 μL di 25 mM MgCl2, 1 μl di template (50 ng / La fedeltà Taq , 0,5 μL di Primer O1 e 0,5 μL di Primer O2 per il fianco 5 &#39;(o 0,5 μL di Primer O3 e 0,5 μL di Primer O4 per il fianco 3&#39;) Utilizzare le condizioni di reazione sono le seguenti: 94 ° C per 1 min, poi 30 cicli di 94 ° C per 30 s, 60 ° C per 30 s, 72 ° C per 2 minuti, poi passaggi finali di 72 ° C per 5 minuti e poi mantenersi indefinitamente a 10 ° C. </li><li> Esegui 0.8%Agarosio 1x TAE (40 mM Tris acetato pH 8,3, 1 mM EDTA) elettroforesi per circa 125 Vh in un apparato minigel standard per determinare la dimensione del prodotto e la concentrazione relativa. Inserire il gel con macchia non etidica secondo le istruzioni del produttore. Visualizzare su un illuminatore UV. </li><li> Se i prodotti a fianco 5 &#39;e 3&#39; sono in concentrazione approssimativamente pari, li combinano e usano un kit di colonna di affinità (o precipitazione PEG 90 μL prodotti combinati PCR, 240 μl TE buffer pH 7,5, 160 μl 30% polietilenglicole PEG8000 30 mM MgCl 2 ) per co-purificare i prodotti PCR secondo il protocollo del produttore. Se non sono di uguale concentrazione, combinare tutti i prodotti a bassa concentrazione con una stima uguale di prodotto della reazione di resa più elevata. </li><li> Utilizzare uno spettrofotometro per misurare la concentrazione del DNA purificato. </li><li> Effettuare la reazione di BP mescolando quanto segue: 1 μL di 60 ng / μL pOSCAR, 2 μL di 60 ng /ΜL pA-Hyg-OSCAR, 1 μL di 60 ng / μL fianchi combinati, 1 μL di clonasi. Incubare per 16 ore a 25 ° C. Terminare la reazione aggiungendo 0,5 μl di proteinasi K e incubare per 10 minuti a 37 ° C. </li><li> Trasformare alta competenza E. Coli . Entrambe le cellule competenti disponibili in commercio e le cellule competenti fatte in casa DH5α CaCl2 sono state utilizzate con successo come destinatari come descritto dalle istruzioni del produttore. Piastra a basso contenuto di sodio (0,5 g / L NaCl) LB contenente 100 μg / mL di spectinomycin (Spec). </li><li> Identificare la struttura corretta eseguendo minipreps di DNA 10 delle colonie generate sopra. Eseguire la doppia digestione con Hin dIII e Kpn I come segue: pipetta 5 μL di DNA, 2 U di ciascun enzima, 2 μl di 10x buffer appropriato con SDW a un volume totale di 20 μL. Questo rilascia l&#39;inserto (circa 4,5 kb con i fianchi del gene 1,5 kb) dal vettore ( circa 7 kb) e taglia tutti i siti inFianchi che possono dare dimensioni predefinibili delle bande. </li><li> Sequenza 11 selezioni i cloni che mostrano un appropriato pattern di bande. </li></ol> 3. Agrobacterium tumefaciens trasformazione mediata (ATMT) dei funghi <ol><li> Trasformare il ceppo Agrobacterium tumefaciens AGL1 con il construct del delezione OSCAR 12 . </li><li> Trasformare il fungo con AGL1 contenente il plasmide di delezione GOI OSCAR. A tale scopo procedere come segue: <ol><li> Preparare una sospensione spore fungina con acqua sterile a 2 x 10 6 spore / ml. Quantificare le spore su un emocitometro o un contatore di cellule automatiche. Mettere 500 μL di questo in un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml. Questa impostazione è per 4 piastre di trasformazione. </li><li> Utilizzare un ciclo sterile sterile azzurro per aggiungere un gobetto facilmente visibile (dovrebbe coprire circa il 20% del diametro del ciclo) del plasmide di delezione contenente AGL1 da un substrato LB-Spec 100 di 2-3 giorni (vedi MElenco delle composizioni per la composizione) contenenti piatti e mescolare nella sospensione dello spore. Vortex fino a quando le cellule batteriche sono ben disperse ( circa 5 minuti di media velocità). </li><li> Pipettare 100 μl della sospensione conidia-Agro al centro di un filtro a membrana di cellulosa posto su ciascuno dei quattro piatti da 6 cm di Petri contenenti il ​​mezzo di coltura 12 . </li><li> Spalmare la sospensione con le perline di vetro sterili (circa 4) per coprire tutta la superficie del filtro a membrana. In alternativa, spalmare la sospensione usando uno strumento tradizionale di spargimento. Lasciare che il filtro della membrana si asciughi in una cappa per circa 10 minuti, avvolgere con film paraffina. Ripetere i passaggi 3.2.2 e 3.2.3 per impostare più trasformazioni. </li><li> Incubare la piastra per 2 giorni a temperatura ambiente, invertita. </li><li> Trasferire il filtro a membrana in 6 centimetri di selezione di Aspergillus 12 piastre contenenti hygromycin B (Hyg) 150 μg / mL, 200 mg di cefotaxime e 100 μg / mLmoxalactam. Incubare a temperatura ambiente per 5-7 giorni prima di isolare le colonie igroscopiche. </li><li> Con gli stuzzicadenti sterili, trasferire i trasformanti putativi su 6 cm di piastre di patata di Dextrose Agar (PDA) contenenti 150 μg / mL Hyg, 100 μg / mL kanamicina. </li></ol></li></ol> 4. Identificazione mutante deletione mediante PCR <ol><li> Estrarre il DNA per PCR dai trasformanti mediante termolisi 13 . <ol><li> Una volta che i trasformanti formano colonie sul PDA dalla fase 3.2.7, utilizzare uno stuzzicadenti sterile per trasferire una piccola quantità (2 mm x 2 mm) di micelle o di cellule di lievito dalla colonia in 100 μl di soluzione di lisi (50 mM di sodio fosfato, pH 7,4, 1 mM EDTA, 5% glicerolo) in un tubo di microcentrifuga. </li><li> Incubare la miscela a 85-90 ° C per 20-30 min. Conservare l&#39;estratto grezzo contenente DNA genomico a -20 ° C fino all&#39;uso nel passaggio 4.2. </li></ol></li><li> Effettuare 4 reazioni PCR per trasformante, ognuna da dLa recombinazione omologa dei fianchi 5 &#39;e 3&#39; rispettivamente, uno per il marcatore selectable (hygromycin fosfotransferasi in questo caso) e uno per il GOI ORF. NOTA: generalmente utilizziamo Taq a bassa fedeltà a basso costo per queste reazioni. Le condizioni di reazione sono quelle descritte nel punto 2.1 precedenti e contengono SDW 20 μL, 10 volte Taq buffer 2,5 μL, dNTPS (10 mM) 0,5 μL, Taq 14 casalingo, 0,5 μL, Primer A (100 μM) 0,5 μL, Primer B (100 μM ) 0,5 μL, Template 0,5 μL. Possono essere utilizzati altrettanto bene gli stock di primer di concentrazione inferiori (10 μM). </li><li> Eseguire un gel agarosio ( ad esempio 0,8%) dei prodotti PCR. I mutanti di Deletione produrranno la banda Hyg ma non un prodotto ORF. Gli integratori ectopici mostreranno entrambe le bande. Il tipo Wild produce solo la banda ORF. </li><li> Memorizzare permanentemente mutanti di cancellazione (e un trasformante ectopico o due per i controlli) per un uso futuro. NOTA: 15% di glicerolo è usato per sHa strappato i nostri ceppi a lungo termine a -80 ° C. </li></ol>

<ol><li>Paz, Z., García-Pedrajas, M. D., Andrews, D. L., Klosterman, S. J., Baeza-Montañez, L., Gold, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+step+construction+of+Agrobacterium-Recombination-ready-plasmids+%28OSCAR%29%2C+an+efficient+and+robust+tool+for+ATMT+based+gene+deletion+construction+in+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genet+Biol%22%5BJournal%5D)">One step construction of Agrobacterium-Recombination-ready-plasmids (OSCAR), an efficient and robust tool for ATMT based gene deletion construction in fungi.</a> Fungal Genet Biol. 48 (7), 677-684 (2011).</li>
<li>Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li>
<li>Klosterman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+genomics+yields+insights+into+niche+adaptation+of+plant+vascular+wilt+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Comparative genomics yields insights into niche adaptation of plant vascular wilt pathogens.</a> PLoS Pathog. 7 (7), (2011).</li>
<li>Xue, C., Wu, D., Condon, B. J., Bi, Q., Wang, W., Turgeon, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+knockout+in+the+maize+pathogen+Setosphaeria+turcica+using+Agrobacterium+tumefaciens-mediated+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Efficient gene knockout in the maize pathogen Setosphaeria turcica using Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation.</a> Phytopathology. 103 (6), 641-647 (2013).</li>
<li>Xu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+gene+disruption+methodology+for+the+entomopathogenic+fungus+Metarhizium+robertsii%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A high-throughput gene disruption methodology for the entomopathogenic fungus Metarhizium robertsii.</a> PloS One. 9 (9), (2014).</li>
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<li>Yu, X., Wang, Y., Pan, J., Wei, D., Zhu, X. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/article/10.1007/s13213-015-1055-8">High frequency of homologous gene disruption by single-stranded DNA in the taxol-producing fungus Pestalotiopsis microspora.</a> Ann Microbiol. 65 (4), 2151-2160 (2015).</li>
<li>Korn, M., Schmidpeter, J., Dahl, M., Müller, S., Voll, L. M., Koch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Genetic+Screen+for+Pathogenicity+Genes+in+the+Hemibiotrophic+Fungus+Colletotrichum+higginsianum+Identifies+the+Plasma+Membrane+Proton+Pump+Pma2+Required+for+Host+Penetration%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A Genetic Screen for Pathogenicity Genes in the Hemibiotrophic Fungus Colletotrichum higginsianum Identifies the Plasma Membrane Proton Pump Pma2 Required for Host Penetration.</a> PloS One. 10 (5), e0125960(2015).</li>
<li>Chettri, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Regulation+of+dothistromin+toxin+biosyn+by+the+pine+needle+pathogen+Dothistroma+septosporum%3A+a++presented+in+the+partial+fulfilment+of+the+requirements+for+the+degree+of+Doctor+of+Philosophy+%28%29+in+Genetics+at+Massey+University%2C+Manawatu%2C+New+Zealand%22">Regulation of dothistromin toxin biosynthesis by the pine needle pathogen Dothistroma septosporum: a thesis presented in the partial fulfilment of the requirements for the degree of Doctor of Philosophy (PhD) in Genetics at Massey University, Manawatu, New Zealand </a>. , Massey University. Manawatu, New Zealand. (2014).</li>
<li>Chen Zhou,, Yujun Yang,, Jong, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mini-prep+in+ten+minutes%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Mini-prep in ten minutes.</a> Biotechniques. 8 (2), 172(1990).</li>
<li>Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequencing+with+chain-terminating+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+SciUSA%22%5BJournal%5D)">DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.</a> P Natl Acad SciUSA. 74 (12), 5463-5467 (1977).</li>
<li>Khang, C. H., Park, S. Y., Rho, H. S., Lee, Y. H., Kang, S. Filamentous fungi (Magnaporthe grisea and Fusarium oxysporum). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKhang%2C+CH+%22Agrobacterium+Protocols%22">Agrobacterium Protocols</a>. Wang, K. an 2, Humana Press Inc. Totowa, NJ. 403-420 (2007).</li>
<li>Zhang, Y. J., Zhang, S., Liu, X. Z., Wang Wen, H. A., M, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+of+genomic+DNA+extraction+suitable+for+analysis+of+bulk+fungal+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Lett+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A simple method of genomic DNA extraction suitable for analysis of bulk fungal strains.</a> Lett Appl Microbiol. 51 (1), 114-118 (2010).</li>
<li>Pluthero, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+purification+of+high-activity+Taq+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Rapid purification of high-activity Taq DNA polymerase.</a> Nucleic Acids Res. 21 (20), 4850-4851 (1993).</li>
<li>McCluskey, K. Boosting Research and Industry by Providing Extensive Resources for Fungal Research. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMcCluskey%2C+K+%22Gene+Expression+Systems+in+Fungi%3A+Advancements+and+Applications%22">Gene Expression Systems in Fungi: Advancements and Applications</a>. , Springer International Publishing. 361-384 (2016).</li>
</ol>

Gli autori non hanno niente da rivelare.

La costruzione di una fase di Agrobacterium -ready-plasmids-ready-plasmid (OSCAR) è stata impiegata con successo con un numero sempre crescente di funghi Ascomycota. Il metodo dovrebbe anche essere facilmente applicabile al Basidiomycota e alle specie di altri phyla fungine (con opportuni promotori che guidano i geni marcatori selectable), assumendo la trasformazione mediata da Agrobacterium e la ricombinazione omologa. Varianti di contrassegno aggiuntivi sono stati generati per diversificare le scelte...

La dissezione genetica è una metodologia potente per determinare l&#39;importanza funzionale di individui o combinazioni di geni. Un approccio standard per comprendere il ruolo di geni specifici è la produzione di mutanti singoli di gene inalterati in qualsiasi altro gene. L&#39;approccio più potente e meno potenzialmente confondibile è la delezione completa e precisa di un fotogramma aperto di lettura (GOI ORF) di un interesse senza danno ad alcuna altra funzione genica. Poiché gli approcci standard di ligation per la generazione del plasmide di eliminazione richiedono più fasi, il razionale per OSCAR 1 è quello di produrre un approccio più rapido in vitro . La figura 1 illustra il processo di assemblaggio nell&#39;approccio OSCAR. Il metodo descritto qui presenta il vantaggio di combinare la rapida costruzione di singoli vettori di delezione dei geni in una singola reazione multipartia in combinazione con la successiva transfo mediata da Agrobacterium tumefaciensRmation (ATMT). OSCAR è molto veloce e si confronta con altre strategie, come l&#39;uso del gruppo Gibson nel lievito 2 . Il metodo OSCAR è stato utilizzato con successo con diverse specie di funghi Ascomycota. Queste specie includono : Fusarium verticillioides (inedito), Verticillium dahliae 3 , Setosphaeria turcica 4 , Metarhizium robertsii 5 , Fusarium oxysporum f. sp. Vasinfectum 6 , Pestalotiopsis microspora 7 , Colletotrichum higginsianum 8 e Dothistroma septosporum 9 e Sarocladium zeae (inedito) . Questo protocollo fornisce istruzioni passo per passo per il metodo che include il disegno del primer, l&#39;amplificazione del PCR a fianco, la reazione di OSCAR BP, la configurazione della struttura di delezione, la trasformazioneIone di Agrobacterium con il costrutto seguito dal trasferimento basato sul ATMT del costrutto di delezione nelle cellule fungine e infine differenziando i mutanti della delezione fungina da quelli con costrutti di delezione integrati ectopicamente.

<table><tbody><tr><td>FungiDB</td><td></td><td></td><td>Database/ http://fungidb.org/fungidb/</td></tr> <tr><td>IDT PrimerQuest</td><td>IDT</td><td></td><td>Primer design online software/ http://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index</td></tr><tr><td>Microsoft Word</td><td></td><td></td><td>Manipolazione di file di sequenza</td></tr><tr><td>Basso Na LB Spec 100 medio</td><td></td><td></td><td>E. coli selezione del trasformante, composizione: 1% triptone, 0,05% NaCl, 0,5% estratto di lievito, 1,5% agar se per terreno solido</td></tr><tr>Terreno <td></td><td></td> di<td>co-coltivazione</td><td>Induzione della trasformazione ATMT (Riferimento 12)</td></tr><tr><td>Aspergillus terreno minimo con igromicina</td><td></td><td></td><td>Selezione di trasformanti fungini</td></tr><tr><td>Terreno PDA</td><td>Acumedia</td><td>7149A</td><td>Provette</td></tr> <tr><td>inclinate a spora singolaPDA-Hyg-Kan medio</td><td></td><td></td><td>Isolamento fungino ransformante, PDA contenente 150 &mu; g/mL di igromicina B e 100 &mu; g/mL Kanamicina</td></tr><tr><td>Perle di vetro</td><td>Genlantis</td><td>C400100</td><td>Spalmatura di piastre</td></tr><tr><td>Filtri nitrocellulosici (47 mm)</td><td>Fisher</td><td>09-719-555</td><td>Co-coltura per ATMT</td></tr><tr><td>Varie provette</td><td></td><td></td> centifughe <td>preparazioni multiple</td></tr><tr><td>piastre di Petri (varie)</td><td></td><td></td><td>Coltura di batteri e funghi</td></tr><tr><td>pA-Hyg OSCAR</td><td>Addgene</td><td>29640</td><td>Vettore marcatore selezionabile</td></tr><tr><td>pOSCAR</td><td>Addgene</td><td>29639</td><td>Vettore di assemblaggio</td></tr><tr><td>DH5&#945; One Shot Competent E. coli cells</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>12297-016</td><td>BP reazione trasformazione</td></tr><tr><td>ccdB sopravvivenza cellule di E. coli</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>A10460</td><td>Manutenzione di pOSCAR</td></tr><tr>Bastoncini <td></td><td></td> di<td>trasferimento in legno</td><td>Striature di colonie</td></tr><tr><td>Stuzzicadenti</td><td></td><td></td><td>Prelievo di colonie</td></tr><tr><td>Microcentrifuga</td><td></td><td></td><td>Pellettatura di batteri, ecc.</td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td></td><td></td> preparativa <td>Raccolta di spore fungine</td></tr><tr><td>Microscopio</td><td></td><td></td> da dissezione <td>Singolo isolamento delle spore</td></tr><tr>Contatore <td></td><td></td><td>cellulare automatizzato Calcolo della</td><td>sospensione delle spore</td></tr><tr><td>Microscopio</td><td></td><td></td> composto <td>Emocitometro Conteggio delle cellule</td></tr><tr><td>Kit di purificazione QIAquick PCR&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>PCR gene flank produict purificazione</td></tr><tr><td>TaKaRa LA Taq&nbsp;</td><td>Takara Bio USA</td><td>RR002A</td><td>Hi Fidelity taq polimerasi per la generazione del fianco OSCAR</td></tr><tr><td>Igromicina B</td><td>InvivoGen</td><td>ant-hg-5</td><td></td></tr><tr><td>Spectinomycin</td><td>Sigma</td><td>22189-32-8</td><td></td></tr><tr><td>Cefotaxime</td><td>TCI America</td><td>C2224</td><td></td></tr><tr><td>Kanamicina</td><td></td><td>11815032</td><td></td></tr><tr><td>Moxalactam</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43963</td><td></td></tr><tr><td>GelRed</td><td>&nbsp; Phenix Research Products</td><td>RGB-4103</td><td>Post colorazione gel di agarosio</td></tr><tr><td>Qiagen QIAquick PCR Purification Kit (Cat. n. 28104)&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(OneShot_ Mach1TM T1R o One Shot_ OmniMAX & trade; 2 T1R di Invitrogen)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C862003</td><td></td></tr><tr><td>Gateway BP Clonase II Miscela di enzimi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11789020</td><td>Utilizzato per assemblare il costrutto di delezione in pOSAR</td></tr></tbody></table>

produzione rapida del taglio nei funghi via<em&gt; agrobacterium</em&gt; trasformazione mediata di componenti di eliminazione oscar

Rapid Deletion Production in Fungi via Agrobacterium Mediated Transformation of OSCAR Deletion Constructs

Precisa delezione dei geni di interesse, lasciando inalterata il resto del genoma, fornisce il prodotto ideale per determinare la funzione del particolare gene nell&#39;organismo vivente. In questo protocollo viene descritto il metodo OSCAR di costruzione precisa e rapida del plasmide di delezione. OSCAR si basa sul sistema di clonazione in cui viene eseguita una singola reazione di ricombinasi contenente i fianchi 5 &#39;e 3&#39; amplificati PCR amplificati del gene di interesse e due plasmidi, pA-Hyg OSCAR (il vettore marcatore) e pOSCAR (l&#39;assemblea vettore). La conferma del vettore di delezione correttamente assemblato viene eseguita mediante mapping di digestione di restrizione seguita da sequenziamento. Agrobacterium tumefaciens viene quindi usato per mediare l&#39;introduzione del costrutto di delezione in spore fungine (denominato ATMT). Infine, viene descritto un dosaggio PCR per determinare se il complesso di delezione è integrato dalla ricombinazione omologa o non omologa, indicando la delezione genica oRispettivamente integrazione ectopica. Questo approccio è stato utilizzato con successo per la cancellazione di numerosi geni in Verticillium dahliae e in Fusarium verticillioides tra altre specie.

Il metodo OSCAR, in una sola reazione, genera un plasmide contenente i fianchi del gene target da eliminare che circonda la cassetta di marker selezionabile. La produzione di costruzioni di delezione utilizzando OSCAR è molto efficace. Il sistema può tuttavia produrre componenti costruttivi contenenti alcuni ma non tutti e tre i frammenti (i due fianchi del gene e il marker selectable). Generalmente, la maggior parte dei trasformatori di E. coli contengono il buon costrutto OSCA...

Mutanti di delezione genica generati attraverso la ricombinazione omologa sono il gold standard per gli studi di funzione genica. Viene descritto il metodo OSCAR (costruzione di una fase di Agrobacterium-Recombination-ready-plasmids) per una rapida generazione di costrutti di delezione. La trasformazione fungina mediata da Agrobacterium segue. Infine, viene presentato un metodo di conferma basato su PCR delle delezioni geniche nei trasformanti fungini.

Produzione rapida del taglio nei funghi via<em&gt; Agrobacterium</em&gt; Trasformazione mediata di componenti di eliminazione OSCAR

Precise deletion of gene(s) of interest, while leaving the rest of the genome unchanged, provides the ideal product to determine that particular ...

L'obiettivo generale di questa procedura è generare mutanti con delezioni geniche precise nei funghi. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nella genetica funzionale dei funghi, ad esempio quale ruolo svolge un particolare gene di interesse nella capacità di un fungo di causare malattia. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la costruzione molto rapida di plasmidi per generare delezioni precise.Questo metodo può fornire informazioni su qualsiasi fungo che possieda un sistema di ricombinazione omologa efficace. Potrebbe inoltre essere applicato ad altri sistemi, come cellule di protisti o di vermiformi. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando abbiamo sviluppato il sistema DelsGate, correlato a Oscar, ma utilizzato per la trasformazione di protoplasti piuttosto che tramite agrobatterio.La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché comprende diverse fasi ottimizzate o non intuitive. A illustrare la procedura sarà Nicole Crenshaw, un'assistente tecnico del mio laboratorio. Questa strategia per la progettazione di primer richiede la regione genomica del gene di interesse che comprende la sequenza codificante (open reading frame) e almeno due chilobasi adiacenti al gene su ciascun lato, in un file di elaborazione testi.Iniziare evidenziando la sequenza codificante destinata all'eliminazione e indicare il codone di inizio e di stop. Identificare ed evidenziare le sequenze codificanti adiacenti all'interno della sequenza scaricata. Successivamente, utilizzare uno strumento di progettazione di primer per progettare i primer PCR per le regioni flanking a 5' della sequenza codificante del gene di interesse.Utilizzare i due chilobasi della regione cinque prime della sequenza codificante del gene di interesse per progettare la coppia di primer PCR O1 e O2, al fine di generare un prodotto di dimensione minima di un chilobase. Scegliere il risultato che posiziona il primer inverso O2 più vicino alla sequenza codificante. Assicurarsi che la sequenza codificante adiacente non venga compromessa.Catturare uno screenshot dei saggi e copiare e incollare le sequenze dei primer in un documento di testo. Dopo aver ripetuto il processo per la regione flanking 3' per generare i primer O3 e O4, aggiungere i siti di attacco appropriati alle estremità 5' di tutti e quattro i primer. Infine, progettare i primer da utilizzare per la conferma della delezione e per la conferma del ricombinamento omologo, seguendo le indicazioni riportate nel protocollo testuale.Iniziare questa procedura impostando due reazioni PCR: una per il tratto terminale cinque-primo e l'altra per il tratto terminale tre-primo. Aggiungere a entrambe le miscele di reazione: 29,5 microlitri di acqua distillata sterile, cinque microlitri di tampone PCR 10x LA, otto microlitri di mix di dNTP 2,5 millimolari, cinque microlitri di cloruro di magnesio 25 millimolare, un microlitro di stampo e 0,5 microlitri di Taq ad alta fedeltà. Alla reazione per il tratto terminale cinque-primo, aggiungere 0,5 microlitri del Primer O1 e 0,5 microlitri del Primer O2. Alla reazione per il tratto terminale tre-primo, aggiungere 0,5 microlitri del Primer O3 e 0,5 microlitri del Primer O4. Eseguire la PCR con le seguenti condizioni di reazione: 94 gradi Celsius per un minuto, seguiti da 30 cicli di 94 gradi Celsius per 30 secondi, 60 gradi Celsius per 30 secondi e 72 gradi Celsius per due minuti, e un passaggio finale a 72 gradi Celsius per cinque minuti prima di mantenere indefinitamente a 10 gradi Celsius.Per determinare la dimensione del prodotto e la concentrazione relativa, eseguire l'elettroforesi dei prodotti PCR su un gel di agarosio 0,8% in tampone TLE 1x per circa 125 volt-ora utilizzando un apparato standard per mini-gel. Colorare successivamente il gel con un colorante non a base di bromuro di etidio seguendo le istruzioni del produttore e visualizzare su un illuminatore a UV. Se le regioni fluttuanti a 5' e a 3' sono presenti in concentrazioni approssimativamente uguali, combinarle.Se non hanno concentrazione uguale, combinare il prodotto a bassa concentrazione con una quantità stimata equivalente di prodotto dalla reazione a resa più elevata. Utilizzare un kit di colonne infinity per co-purificare i prodotti PCR secondo il protocollo del produttore. Successivamente, eseguire la reazione BP clonase mescolando quanto segue: un microlitro del vettore di assemblaggio, due microlitri del vettore marcatore, un microlitro dei flank combinati e un microlitro di clonase.Incubare a 25 gradi Celsius per 16 ore. Terminare la reazione aggiungendo 0,5 microlitri di proteinasi-K e incubando a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Dopo aver trasformato le cellule di E.coli con la reazione BP e isolato il DNA come descritto nel protocollo testuale, identificare il costrutto corretto eseguendo una doppia digestione con HindIII e KpnI.Dopo l'identificazione del costrutto di delezione OSCAR mediante doppia digestione del sequenziamento, il costrutto viene trasformato in agrobatterio tumefaciens ceppo AGL1. Il passo successivo consiste nel trasformare i funghi con AGL1 contenente il costrutto di delezione OSCAR. Iniziare preparando una sospensione di spore fungine in acqua sterile a una concentrazione di 2 × 10⁶ spore per millilitro.Dopo aver diluito le spore, aggiungere 500 microlitri della sospensione di spore fungine in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitro. Utilizzare un’ansa sterile monouso di colore blu per aggiungere una quantità visibile del plasmide di delezione contenente AGL1 nella sospensione di spore. Vortexare fino a quando le cellule batteriche non sono ben disperse.Posizionare un filtro in membrana di cellulosa su ciascuna di quattro piastre di Petri da sei centimetri contenenti mezzo di co-coltura e quindi aggiungere circa quattro perline di vetro sterili per piastra. Pipettare 100 microlitri della sospensione di conidi di *Agra* al centro di ciascun filtro in membrana, quindi distribuire la sospensione con le perline per coprire l'intera superficie del filtro. Dopo aver rimosso le perline, lasciare asciugare i filtri in membrana nell'incubatrice per circa dieci minuti, quindi avvolgere le piastre di Petri con pellicola paraffinata.Rovesciare le piastre e incubare per due giorni a temperatura ambiente. Dopo due giorni, trasferire ciascun filtro membrana su una piastra di medio selettivo asper gel da sei centimetri contenente igromicina B e kanamicina. Incubare a temperatura ambiente per cinque fino a otto giorni.Per isolare le colonie resistenti all'igromicina, utilizzare bastoncini sterili per trasferire i presunti trasformanti su piastre di agar di patata dextrosa da sei centimetri contenenti igromicina e kanamicina. Incubare le piastre a temperatura ambiente. Una volta che i trasformanti formano colonie sulle piastre, utilizzare un bastoncino sterile per trasferire una piccola quantità di micelio o cellule di lievito dalla colonia in 100 microlitri di soluzione di lisi in un tubo da microcentrifuga.Incubare la miscela a 85-90 gradi Celsius per 20-30 minuti. Conservare l'estratto grezzo contenente il DNA genomico a meno 20 gradi Celsius fino al momento dell'esecuzione della PCR. Per identificare i mutanti con delezione, eseguire innanzitutto una PCR per rilevare il frame di lettura aperto del gene di interesse e il marcatore selezionabile per ciascun trasformante.Utilizzare le stesse condizioni di reazione per la produzione dei costrutti OSCAR. Dopo l'isolamento di spore singole e la lisi termica, ripetere la PCR per il frame di lettura aperto e l'igromicina, nonché la PCR per rilevare la ricombinazione omologa delle regioni fluttuanti a cinque-prime e a tre-prime. Successivamente, eseguire un gel di agarosio dei prodotti della PCR.Il metodo OSCAR genera un plasmide contenente il gene del marcatore selezionabile, circondato dalle regioni flanking del gene bersaglio da eliminare, che in questo esempio è un gene di verticillium dahliae. Quando sottoposto a doppia digestione, il rilascio di un inserto di 4.247 paia di basi, nel presente caso, conferma la corretta struttura del plasmide in tutte le corsie, ad eccezione delle corsie cinque e 11. Un approccio di PCR viene utilizzato per confermare l'eliminazione.Questo esempio mostra l'analisi di cinque trasformanti di *Fusarium verticillioides*. Nel gel superiore, le corsie da due a sei corrispondono alle amplificazioni della regione 5'-flank, mentre le corsie da sette a undici corrispondono alle amplificazioni delle regioni codificanti (ORF). Nel gel inferiore, le corsie da due a sei mostrano le amplificazioni del gene marcatore selezionabile, mentre le corsie da sette a undici mostrano le amplificazioni della regione 3'-flank.La presenza di bande nella regione amplificata del tratto a monte (cinque-prime flank), nel tratto a valle (tre-prime flank) e nel gene del marcatore selezionabile, e l'assenza di bande nell'amplificazione della regione codificante (open reading frame), confermano che i ceppi 1131, 1132 e 1133 sono trasformanti deleti. La presenza di bande nelle amplificazioni della regione codificante e del gene del marcatore selezionabile, e l'assenza di bande nelle amplificazioni dei tratti a monte e a valle, indicano che i ceppi 1134 e 1135 sono trasformanti atopici. Le delezioni geniche possono inoltre essere confermate mediante Southern blot.Una volta padroneggiata, questa tecnica può generare plasmidi di delezione Oscar pronti per le trasformazioni fungine in due giorni, escluso il tempo necessario per il sequenziamento. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di utilizzare polimerasi Taq ad alta fedeltà e di accertarsi che i geni adiacenti non vengano influenzati. Dopo aver seguito questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi per analizzare i fenotipi dei mutanti al fine di rispondere a ulteriori domande, ad esempio se un gene riveste un'importanza in processi specifici, come la sensibilità o la resistenza ai farmaci.Non dimenticare che lavorare con organismi viventi, come il batterio *Agrobacterium* e i funghi, può essere pericoloso, in particolare se una persona è immunocompromessa. Precauzioni come il lavaggio delle mani dopo il contatto devono sempre essere adottate durante questa procedura.

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