Name: Caratterizzazione biofisica delle funzioni flagellare a motore (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: Scopri la caratterizzazione biofisica dei motori flagellari batterici mediante tracciamento in tempo reale di microsfere. Questo metodo computazionale permette di studiare la meccanobiologia cellulare con precisione senza precedenti.

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Gli autori ringraziano Howard Berg per il dono del microscopio/fotomoltiplicatori a tracciamento delle perle e la Texas A&M Engineering Experiment Station per i fondi.

1. Preparazione delle cellule <ol><li> Grow culture durante la notte del ceppo desiderato portando il appiccicoso flic allele 15,22 a triptone Broth (TB, 1% Peptone, 0.5% NaCl) seguita da inoculo in diluizione 1: 100 in 10 ml TB fresco. Crescere la coltura a 33 ° C in un incubatore shaker fino OD 600 = 0.5. </li><li> Agglomerare le cellule a 1500 xg per 5 - 7 min e ri-disperdere il pellet vigorosamente in 10 mL di tampone di filtro sterilizzato motilità (MB; 10 mM tampone fosfato: 0,05-0,06 M NaCl, 10 -4 M EDTA, 1 mM metionina, pH 7,0). </li><li> Ripetere il punto 1.2 altre due volte e ri-disperdere il pellet finale in 1 ml MB. </li><li> Tosare la sospensione passando avanti e indietro ~ 75 volte tra due siringhe con 21 a 23 adattatori calibro connesso con un tubo in polietilene (7 - 12 cm di lunghezza, diametro 0,58 mm interno). Limitare il tempo totale di taglio a 30 - 45 s. </li><li> Centrifugare le cellule tranciate a 1.500 xg per 5-7 minuti e ri-disperdere lapellet in 100 - 500 ml di MB. </li></ol> 2. Far scorrere Preparazione <ol><li> Preparare una camera di imaging da sandwich due nastri adesivi doppia faccia tra una copertura antiscivolo e un vetrino da microscopio. Per i saggi di chemiotassi, impiegare qualsiasi camera di microfluidica che consente lo scambio di MB e stimolanti chimici. </li><li> Aggiungere 0,01% soluzione di poli-L-lisina nella camera e dopo 5 min risciacquare delicatamente le superfici con MB (80 - 100 l). </li><li> Aggiungere 40 ml di sospensione cellulare nella camera e consentire un tempo sufficiente per il fissaggio alla superficie di vetro (7 - 8 min). Defluire cellule scollate aggiungendo 100 microlitri MB su un lato della camera, mentre traspirante la soluzione con un filtro di carta dal lato opposto. </li><li> Aggiungere 10 - 15 ml di perle di lattice nella camera e consentire le perle tempo sufficiente per risolvere e allegare alle cellule (7-8 min). Lavare delicatamente con 100 ml di MB, come descritto al punto 2.3, per rimuovere scollarsi perline. Utilizzare un intervallo di bead-SIzes per gli esperimenti così a lungo come un buon contrasto è disponibile. </li></ol> 3. Monitoraggio Bead <ol><li> Posizionare il campione su un palco microscopio e la scansione della superficie per perline attaccate ai motori. Utilizzare un obiettivo 40X fase per fare osservazioni anche se la microscopia di fase non è necessario. In alternativa, utilizzare l&#39;imaging in campo chiaro fino a quando un sufficiente contrasto è mantenuto per distinguere chiaramente una perlina luminoso su uno sfondo scuro. </li><li> Una volta selezionato un tallone, spostare la fase lateralmente per posizionare il tallone in un angolo predeterminato, come mostrato in Figura 1B. perline posizione alla stessa corner per garantire che il senso di rotazione del tallone è correttamente noto. Il tallone traiettoria ideale è approssimativamente circolare, ma ellittica traiettorie sono ricevibili. </li><li> Mantenere la frequenza di campionamento superiore al doppio della frequenza di rotazione del motore per evitare errori associati aliasing. In questo lavoro, utilizzare un motore che ruotava a50 Hz e il campione a frequenze che erano 10 volte superiore (500 Hz), per ottenere un segnale liscia. </li></ol> Analisi 4. I dati <ol><li> Centro e scalare le tensioni di uscita PMT e corretta ellitticità nelle traiettorie con trasformazioni affini, se necessario 23. Utilizzare l&#39;analisi di potenza spettro per determinare i tassi di rotazione 17. </li><li> Determinare angoli polari, θ (t) = atan (y (t) / x (t)). Determinare le variazioni di velocità del motore e la commutazione nel tempo calcolando ω <img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/55240/55240eq1.jpg" /> 14. </li><li> Impiegare un filtro mediano per lisciare i dati di velocità del motore. Una finestra di filtro più di due giri completi si raccomanda 23,24. </li></ol>

<ol><li>Emody, L., Kerenyi, M., Nagy, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulence+factors+of+uropathogenic+Echerichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Antimicrob.+Ag%22%5BJournal%5D)">Virulence factors of uropathogenic Echerichia coli.</a> Int J Antimicrob. Ag. 22, 29-33 (2003).</li>
<li>Lane, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+motility+in+the+colonization+of+uropathogenic+Escherichia+coli+in+the+urinary+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Role of motility in the colonization of uropathogenic Escherichia coli in the urinary tract.</a> Infect Immun. 73 (11), 7644-7656 (2005).</li>
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<li>Yuan, J., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resurrection+of+the+flagellar+rotary+motor+near+zero+load%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Resurrection of the flagellar rotary motor near zero load.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (4), 1182-1185 (2008).</li>
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<li>Xing, J., Bai, F., Berry, R., Oster, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Torque-speed+relationship+of+the+bacterial+flagellar+motor%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Torque-speed relationship of the bacterial flagellar motor.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (5), 1260-1265 (2006).</li>
<li>Meacci, G., Tu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+the+bacterial+flagellar+motor+with+multiple+stators%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Dynamics of the bacterial flagellar motor with multiple stators.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (10), 3746-3751 (2009).</li>
<li>Lele, P. P., Roland, T., Shrivastava, A., Chen, Y. H., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+flagellar+motor+of+Caulobacter+crescentus+generates+more+torque+when+a+cell+swims+backwards%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Phys%22%5BJournal%5D)">The flagellar motor of Caulobacter crescentus generates more torque when a cell swims backwards.</a> Nat Phys. 12 (2), 175-178 (2016).</li>
<li>Lele, P. P., Shrivastava, A., Roland, T., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+thresholds+in+bacterial+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Response thresholds in bacterial chemotaxis.</a> Sci Adv. 1 (9), e1500299(2015).</li>
<li>Berg, H. C., Turner, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Torque+Generated+by+the+Flagellar+Motor+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Torque Generated by the Flagellar Motor of Escherichia coli.</a> Biophys J. 65, 2201-2216 (1993).</li>
<li>Bai, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+Spread+as+a+Mechanism+for+Cooperativity+in+the+Bacterial+Flagellar+Switch%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conformational Spread as a Mechanism for Cooperativity in the Bacterial Flagellar Switch.</a> Science. 327, 685-689 (2010).</li>
<li>Reid, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+maximum+number+of+torque-generating+units+in+the+flagellar+motor+of+Escherichia+coli+is+at+least+11%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The maximum number of torque-generating units in the flagellar motor of Escherichia coli is at least 11.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 8066-8071 (2006).</li>
<li>Chen, X., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Torque-Speed+Relationship+of+the+Flagellar+Rotary+Motor+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Torque-Speed Relationship of the Flagellar Rotary Motor of Escherichia coli.</a> Biophys J. 78, 1036-1041 (2000).</li>
<li>Turner, L., Caplan, S. R., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-induced+switching+of+the+bacterial+flagellar+motor%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Temperature-induced switching of the bacterial flagellar motor.</a> Biophys J. 71, 2227-2233 (1996).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Al fine di facilitare tethered tallone-tracking e stima corretta del motore coppie, le seguenti informazioni dovrebbe essere rivisto. Quando si eseguono queste misure con cellule flagellate, tosatura è un passaggio fondamentale. Shearing riduce la flagellar filamento ad un semplice stub, garantendo così che il carico sul motore viscosa è prevalentemente dovuta al tallone e può essere stimato entro l&#39;errore 10% 16. Shearing migliora anche la possibilità di trovare le traiettorie circolari con eccentricità ...

I motori flagellare consentono alle cellule di nuotare ruotando filamenti extracellulari elicoidali. La quantità di coppia del motore può generare per una data lunghezza del flagello (cioè, il carico viscoso) determina le velocità di nuoto. D&#39;altro canto, la capacità di cambiare la direzione di rotazione controlla migrazione delle cellule in risposta ad agenti chimici, un processo noto come chemiotassi. Chemiotassi e la motilità di essere fattori di virulenza 1-3, motori flagellare sono stati ben caratterizzati nel corso degli anni 4. Prove di montaggio ora suggerisce che il motore funge mechanosensor - rileva meccanicamente la presenza di substrati solidi 5,6. Questa capacità aiuta probabilmente a scatenare la colonizzazione della superficie e le infezioni 5,7. Di conseguenza, i meccanismi per cui il motore individua automaticamente superfici e iniziati segnalazione sono di importanza 8,9. Il motore flagellare può essere facilmente studiato da legare il flagellum ad un substrato e osservando la rotazione cellulare. Tale tethering è stato raggiunto prima da Silverman e Simon, che lavorava con un mutante polyhook in E. coli e ganci fissati con successo per substrati di vetro con anticorpi anti-gancio 10. Il test legato celle consentito ai ricercatori di studiare le risposte del motore interruttore ad una varietà di stimoli chimici. Ad esempio, Segall e collaboratori stimolati chimicamente le cellule in collegamento, con l&#39;ausilio di pipette iontoforesi. I cambiamenti corrispondenti pregiudizi CW (la frazione dei motori tempo di rotazione in senso orario, CW) ha permesso loro di misurare le cinetiche di adattamento della rete chemiotassi 11,12. Mentre il test delle cellule legato è stato efficace nello studio delle risposte degli interruttori, è stato solo in grado di offrire intuizioni meccanica del motore su una gamma limitata di carichi viscosi 13. Per superare questo problema, Ryu e collaboratori impastoiati sferiche, sfere di lattice a filamento stub su cellule attaccate alle superfici. Le perle sono statipoi monitorati tramite interferometria back-focale con trappole ottiche deboli 14. Lavorando con perline di diverse dimensioni, i ricercatori possono studiare il motore su una gamma più ampia di carichi. Questo test è stato poi migliorato da Yuan e Berg, che ha sviluppato una tecnica di tallone-tracking fotomoltiplicatore a base combinata con illuminazione laser in campo scuro. Il loro metodo attivato il monitoraggio di nanobeads frenati d&#39;oro che erano così piccola (~ 60 nm) che le resistenze viscose esterni sono stati inferiori rispetto alle resistenze viscose interne a rotazione 15,16. Ciò ha portato alle misure delle velocità massime ottenibili in E. coli (~ 300 Hz). In V. alginolyticus, simili saggi di perline attivate misure dei tassi di filatura a carichi intermedi viscosi (~ 700 Hz) 17. Consentendo misurazioni di risposte motorie sull&#39;intera gamma possibile di carichi viscosi (da zero-carico quasi stallo), le perline-saggi fornito un importante strumento biofisico per comprendere il tprocesso orque generazione 18,19. Recentemente, abbiamo modificato il dosaggio Yuan-Berg per includere pinzette ottiche che ci hanno permesso di applicare stimoli meccanici precisi per singoli motori 6. Usando questa tecnica, abbiamo dimostrato che la forza-generatori che ruotano il motore sono meccanosensori dinamici - si rimodellare in risposta ai cambiamenti di carichi viscosi. È possibile che tale load sensing innesca differenziazione cellulare nei batteri brulicanti, sebbene i meccanismi rimangono poco chiari. E &#39;anche probabile che i motori flagellare in altre specie sono anche meccanosensibili 20, anche se la prova diretta è carente. Qui, si discute l&#39;approccio fotomoltiplicatore-based (PMT) per il monitoraggio della rotazione delle sfere di lattice impastoiati ai filamenti flagellari 15. Rispetto al monitoraggio con telecamere ultraveloci, il fotomoltiplicatore-setup è vantaggioso perché è relativamente semplice per tenere traccia delle singole perle in tempo reale e più a lungo durazioni. E &#39;particolarmente utile quando si studia a lungo tempo rimodellamento in complessi a motore flagellare a causa di stimoli ambientali 21. Anche se abbiamo protocolli dettaglio specifico per E. coli, che possono essere facilmente adattati per lo studio di motori flagellare in altre specie.

<table><tbody><tr><td>Soluzione di poli-L-lisina (0,1%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>Microsfere Polybeads</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>7307</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>1 mL Luer Slip Tip Siringa</td><td>Exel Int.</td><td>26048</td><td>http://www.exelint.com/tuberculin_syringes.php</td></tr><tr><td>Clay Adams Intramedic Luer-Stub Adapter 23 gauge</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>427565</td><td>http://www.bd.com/ds/productCenter/ES-LuerStubAdaptors.asp</td></tr><tr><td>Tubo in polietilene</td><td>Harvard Apparatus</td><td>59-8325</td><td>http://www.harvardapparatus.com/laboratory-polye-polyethylene-non-sterile-tubing.html</td></tr><tr><td>fotomoltiplicatore Tubi</td><td>Hamamatsu</td><td>R7400U-20</td><td>Gamma di risposta spettrale da 300 a 920 nm, lunghezza d'onda di picco 630 nm, tempo di risposta di 0,78 ns&nbsp; http://pdf1.alldatasheet.com/datasheet-pdf/view/212308/HAMAMATSU/R7400U-20.html</td></tr><tr><td>3 fessure di precisione da 1 mm</td><td>Edmund Optics</td><td>NT39-908</td><td>2 fessure montate ad angolo retto l'una rispetto all'altra su tubi fotomoltiplicatori</td></tr><tr><td>Oscilloscopio</td><td>Tektronix</td><td>TBS 1032B</td><td>Sono accettabili marche alternative. Oscilloscopio Digitale, Serie TBS 1000B, 2 Analogici, 30 MHz, 500 MSPS, 2.5 kpts&nbsp; http://www.tek.com/oscilloscope/tbs1000b-digital-storage-oscilloscope</td></tr><tr><td>Filtro LP/HP a 8 poli</td><td>Krohn-Hite</td><td>3384</td><td>Sono accettabili marche alternative. Si consiglia una gamma di frequenza da 0,1 Hz a 200 kHz. &nbsp; &nbsp; http://www.krohn-hite.com/htm/filters/PDF/3384Data.pdf</td></tr><tr><td>Microscopio Optiphot</td><td>Nikon</td><td>NA</td><td>È possibile utilizzare qualsiasi microscopio a fase verticale o invertita. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=754</td></tr><tr><td>50:50 (R:T) Beamsplitter a cubo</td><td>ThorLabs</td><td>BS013</td><td></td></tr></tbody></table>

caratterizzazione biofisica delle funzioni flagellare a motore

Biophysical Characterization of Flagellar Motor Functions

Il ruolo dei motori flagellari nella motilità batterica e nella chemiotassi è ben compreso. Recenti scoperte suggeriscono che i motori flagellari sono in grado di rimodellarsi in risposta a una varietà di stimoli ambientali e sono tra i fattori scatenanti della colonizzazione superficiale e delle infezioni. I meccanismi precisi con cui i motori rimodellano e promuovono l'adattamento cellulare dipendono probabilmente dagli attributi motori chiave. La tecnica di tracciamento delle microsfere basata su fotomoltiplicatore qui presentata consente un'accurata caratterizzazione biofisica delle funzioni motorie, compresi gli adattamenti delle velocità dei motori e della dinamica degli interruttori. Questo approccio offre il vantaggio del tracciamento in tempo reale e la capacità di sondare il comportamento motorio per periodi prolungati. I protocolli discussi possono essere facilmente estesi allo studio dei motori flagellari in una varietà di specie batteriche.

La configurazione fotomoltiplicatore è mostrato nella Figura 1A. È importante che i PMT hanno alte sensibilità nel range di lunghezze d&#39;onda sparse dalle perline di interesse. Le PMT impiegati qui operano nelle gamme visibile e vicino infrarosso, e sono stati in grado di rilevare la luce diffusa dalla perle illuminate da una sorgente di luce alogena. Le condizioni di luce ottimali e tensioni di alimentazione variano da una configurazione all&#39;altra. Per la configu...

Recenti scoperte suggeriscono che i motori flagellari batterici percepiscono una varietà di segnali ambientali e si rimodellano in risposta. I saggi a microsfere qui discussi dovrebbero aiutare a spiegare il ruolo del rimodellamento nell'adattamento cellulare ai fattori di stress ambientale.

Caratterizzazione biofisica delle funzioni flagellare a motore

The role of flagellar motors in bacterial motility and chemotaxis is well-understood. Recent discoveries suggest that flagellar motors are able to remodel ...

L'obiettivo generale di questa procedura sperimentale è misurare la rotazione di microsfere sonda legate ai singoli motori flagellari in cellule batteriche vive. La tecnica che descriveremo offre il vantaggio di un monitoraggio in tempo reale delle risposte del motore e della capacità di discriminare tra dati accettabili e inaccettabili in tempo reale. Questo approccio ci sta aiutando a rispondere a domande fondamentali nel campo della meccanobiologia e a svelare la fisica alla base del comportamento dei motori molecolari.Sebbene utilizziamo principalmente queste tecniche per studiare i motori flagellari in E.coli, questi protocolli possono essere facilmente adattati per studiare i motori in altre specie di batteri flagellati. Coltivare colture notturne del ceppo desiderato che porta l'allele sticky fliC in TB. Il giorno successivo, inoculare 10 millilitri di TB fresco con un diluizione 1:100. Far crescere la coltura a 33 gradi Celsius in un incubatore agitatore fino a quando la densità ottica a 600 nanometri raggiunge 0,5.Centrifugare le cellule a 1500 ×g per cinque a sette minuti. Successivamente, risospendere vigorosamente il pellet in 10 millilitri di tampone per la motilità filtrato e sterilizzato. Ripetere la centrifugazione e la risospensione altre due volte.Risospendere il pellet finale in un millilitro di MB. Sottoporre la sospensione a taglio facendola passare avanti e indietro circa 75 volte tra due siringhe munite di adattatori da 21 a 23 gauge collegati da un tubo di polietilene. Limitare il tempo totale di taglio a 30-45 secondi. Dopo la centrifugazione delle cellule sottoposte a taglio, risospendere il pellet in 100-500 microlitri di MB. Preparare una camera per imaging inserendo tra una lamella e un vetrino per microscopia due nastri adesivi doppiato.Aggiungere la soluzione di poli-L-lisina allo 0,01% nella camera e, dopo cinque minuti, risciacquare delicatamente le superfici con MB. Aggiungere 40 microlitri di sospensione cellulare nella camera e lasciare un tempo sufficiente affinché le cellule si attacchino alla superficie di vetro. Rimuovere le cellule non aderenti aggiungendo 100 microlitri di MB da un lato della camera, mentre si asciuga la soluzione con carta da filtro dall'altro lato. Successivamente, aggiungere da 10 a 15 microlitri di microsfere di lattice nella camera.Utilizzare una gamma di dimensioni delle perle per gli esperimenti che producono un buon contrasto. Lasciare alle perle un tempo adeguato per depositarsi e attaccarsi alle cellule. Risciacquare delicatamente le perle con 100 microlitri di MB per rimuovere le perle non attaccate.Posizionare il campione su un portapreparati del microscopio e scansionare la superficie alla ricerca di microsfere legate ai motori. Utilizzare l'immagine in campo chiaro con un obiettivo 60X fintanto che viene mantenuto un contrasto sufficiente per distinguere chiaramente una microsfera luminosa su uno sfondo scuro. Una volta selezionata una microsfera, spostare lateralmente il portapreparati per posizionare la microsfera in un angolo predeterminato.Posizionare le perle nello stesso angolo per assicurare che la direzione di rotazione della perla sia correttamente nota. Mantenere la frequenza di campionamento superiore a due volte la frequenza di rotazione del motore per evitare errori associati al fenomeno di aliasing. In questo studio, sono state utilizzate frequenze di campionamento 10 volte superiori per osservare un motore che ruota a 50 hertz.Se, dopo l'ancoraggio, le perle appaiono oscillare con un'eccentricità maggiore di uno o due volte rispetto al raggio della perla stessa, si raccomanda di sottoporre le cellule a un numero maggiore di cicli di taglio. Qui viene mostrato un confronto visivo tra una perla correttamente ancorata e una perla non ancorata. Le uscite dei due fotomoltiplicatori, campionate a 500 hertz, sono rappresentate per un breve intervallo della misurazione.Gli output filtrati dai PMT, dopo essere stati centrati e scalati, sono stati utilizzati per ricostruire le traiettorie circolari della microsfera in rotazione, come mostrato qui. La traiettoria ideale della microsfera è approssimativamente circolare, ma sono ammesse anche traiettorie ellittiche. Le velocità angolari calcolate a partire dalle traiettorie delle microsfere per un singolo motore sono rappresentate in una finestra di tre secondi.Le transizioni ripetute del motore tra le direzioni di rotazione in senso antiorario e orario sono indicate da passaggi tra valori positivi e negativi. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come tracciare con elevata precisione le perle ancorate a singoli motori flagellari, utilizzando le tecniche basate su fotomoltiplicatore presentate in questo lavoro. Il motore flagellare batterico presenta un insieme unico di sfide perché è in grado di ruotare a velocità di diverse centinaia di hertz.Il tracciamento ad alta precisione di microsfere legate a motori molecolari ha facilitato la caratterizzazione di diversi tipi di motori, tra cui le chinesine, le miosine e l'F1-ATPasi. L'estensione della tecnica di legame mediante microsfera ai motori flagellari ha permesso ai ricercatori di studiare la meccanica dei motori con un'accuratezza senza precedenti. Una dimostrazione visiva di questo metodo aiuterà i ricercatori che desiderano utilizzare questa tecnica a superare ostacoli come il corretto posizionamento delle microsfere legate singolarmente a ciascun motore.Ci si aspetta che i metodi qui descritti permettano lo sviluppo di nuove intuizioni sulla capacità di adattamento di queste nanomacchine in diverse specie batteriche.

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Biologia

Il trasporto intracellulare di carichi, come vescicole o organelli, è effettuato da proteine motrici molecolari che seguono i microtubuli polarizzati. Questo protocollo descrive la correlazione della direzionalità del trasporto delle singole particelle di carico che si muovono all'interno dei neuroni, con la quantità relativa e il tipo di proteine motorie associate.

Che caratterizza la composizione molecolare di motori su Moving assonale Cargo Utilizzo dell&#39;analisi &quot;Cargo Mapping&quot;

L'obiettivo di questo protocollo è quello di formare insiemi di motori molecolari sulle nanostrutture di origami del DNA e osservare la motilità dell'insieme utilizzando la microscopia a fluorescenza totale della riflessione interna.

Produzione di Dynein e Kinesin Motor Ensemble su nanostrutture DNA Origami per l'osservazione a singola molecola

Molti batteri usano la motilità guidata dalla flagella per navigare nel loro ambiente e colonizzare un ambiente favorevole sia individualmente che collettivamente. Qui è dimostrato l'uso di tre metodi consolidati che sfruttano la motilità come strumento di selezione per identificare componenti / percorsi che contribuiscono al nuoto e alla motilità brulicante.

Investigare la motilità guidata dalla Flagella in Escherichia coli applicando tre tecniche consolidate in una serie

Qui viene presentata una procedura per esprimere e purificare la miosina 5a seguita da una discussione sulla sua caratterizzazione, utilizzando sia l'ensemble che la singola molecola in saggi basati sulla microscopia a fluorescenza in vitro, e come questi metodi possono essere modificati per la caratterizzazione della miosina 2b non a forma di molecola.

Adattamenti specifici della miosina dei saggi di motilità basati sulla microscopia a fluorescenza in vitro

Presentato qui è un protocollo completo per eseguire esperimenti di force-clamp ultraveloci su motori processivi miosina-5, che potrebbe essere facilmente esteso allo studio di altre classi di motori processivi. Il protocollo descrive in dettaglio tutte le fasi necessarie, dalla messa a punto dell'apparato sperimentale alla preparazione del campione, all'acquisizione dei dati e all'analisi.

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Qui, descriviamo la costruzione di mutanti nulli di Aeromonas in specifiche glicosiltransferasi o regioni contenenti glicosiltransferasi, i saggi di motilità e la purificazione dei flagelli eseguiti per stabilire il coinvolgimento e la funzione dei loro enzimi codificati nella biosintesi di un glicano, nonché il ruolo di questo glicano nella patogenesi batterica.

Generazione di mutanti nulli per chiarire il ruolo delle glicosiltransferasi batteriche nella motilità batterica

La cinesina mitotica bidirezionale-5 Cin8 si accumula in ammassi che si dividono e si fondono durante la loro motilità. L'accumulo negli ammassi cambia anche la velocità e la direzionalità di Cin8. Qui viene descritto un protocollo per saggi di motilità con Cin8-GFP purificato e analisi delle proprietà mobili di singole molecole e cluster di Cin8.

Motilità di singole molecole e cluster di Kinesin-5 Cin8 bidirezionale purificata da cellule S. cerevisiae

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Sondare la meccanica dell'ensemble di miosina in fasci di filamenti di actina usando pinzette ottiche

Qui, presentiamo un protocollo per ricostituire i fasci di microtubuli in vitro e quantificare direttamente le forze esercitate al loro interno utilizzando l'intrappolamento ottico simultaneo e la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale. Questo test consente la misurazione su scala nanometrica delle forze e degli spostamenti generati dagli insiemi proteici all'interno delle reti di microtubuli attivi.

Misurazione diretta delle forze all'interno di fasci di microtubuli attivi ricostituiti

Questo studio descrive in dettaglio la purificazione di KIF1A (1-393LZ), un membro della famiglia kinesin-3, utilizzando il sistema di espressione del baculovirus Sf9. L'analisi in vitro di scorrimento monomolecola e multimotore di questi motori purificati ha mostrato robuste proprietà di motilità paragonabili ai motori del lisato cellulare di mammifero. Pertanto, il sistema Sf9-baculovirus è suscettibile di esprimere e purificare la proteina motoria di interesse.

Analisi a singola molecola dei motori della famiglia Kinesin-3 superprocessiva purificata Sf9

Questo protocollo descrive in dettaglio le procedure per la produzione ricombinante dell'oloenzima miosina-7a umano utilizzando il sistema MultiBac Baculovirus e per lo studio della sua motilità utilizzando un saggio di scorrimento del filamento in vitro su misura.

Purificazione basata sul sistema MultiBac e caratterizzazione biofisica della miosina-7a umana

Scopri la caratterizzazione biofisica dei motori flagellari batterici mediante tracciamento in tempo reale di microsfere. Questo metodo computazionale permette di studiare la meccanobiologia cellulare con precisione senza precedenti.

Caratterizzazione biofisica delle funzioni flagellare a motore

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