Name: La riprogrammazione di cellule condizionale Pediatric umana esofageo epiteliali per luso in ingegneria dei tessuti e la malattia Investigation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Scopri la riprogrammazione condizionale di cellule epiteliali esofagee pediatriche umane per l'ingegneria dei tessuti e lo studio delle malattie. Questo metodo consente l'espansione efficiente senza modificazioni genetiche.

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Vorremmo ringraziare il Connecticut Children's Medical Center Strategic Research Funding per aver sostenuto questo lavoro.

biopsie esofagee sono stati ottenuti dopo il consenso informato è stato ottenuto dai genitori / tutori dei pazienti pediatrici e in conformità con la scheda di revisione istituzionale (IRB # 13-094). 1. sterilizzazione di strumenti e la gelatina Soluzione <ol><li> forcipe autoclave, lame di rasoio e forbici prima di maneggiare il tessuto per evitare la contaminazione. </li><li> Per 200 ml di soluzione di gelatina 0,1%, unire 200 mL di acqua distillata con 0,2 g di gelatina. Autoclavare e fresco prima dell&#39;uso. </li></ol> 2. Rivestimento Piastre Tissue Culture <ol><li> Circa 2 h prima di isolare cellule, aggiungere abbastanza 0,1% di gelatina per coprire un piatto di coltura di tessuti (100 mm) e incubare a 37 ° C in un incubatore di coltura cellulare. NOTA: Queste piastre possono anche essere effettuate in anticipo e tenute in incubatrice prima dell&#39;uso. </li></ol> 3. Fare Soluzione Enzimatica per la dissociazione <ol><li> Circa 30 minuti prima di isolare cellule, pesare10 unità di dispasi su un bilancio basato sulle unità per milligrammo concentrazione dei flaconi. Posizionare la polvere in un tubo da 15 ml con 10 ml di Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) e posto in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C. </li></ol> 4. cellulare fare cultura medio <ol><li> Per fare 50 ml di mezzo riprogrammazione condizionale, mescolare i seguenti ingredienti in una provetta sterile conica: 35 ml di F12 (Ham media), 11,5 ml di DMEM, 0,5 ml di L-glutammina, 0,5 ml di 100x di penicillina / streptomicina, 2,5 ml di siero fetale bovino (FBS), 250 mg di insulina umana, 500 ng del fattore di crescita epidermico umano (EGF). </li><li> Per fare 500 ml di 3T3 media, mescolare 50 ml di FBS, 5 ml di 100x penicillina / streptomicina e 5 ml di L-glutammina con 500 ml di DMEM. </li><li> Per fare 500 ml di cheratinociti mezzo privo di siero, scongelare integratori estratto pituitario bovina (BPE) (forniti con i media) EGF e. Aggiungere i supplementi per la bottiglia di terreno di base da 500 ml e aggiungere 5 ml di 100x penicillina / streptomicina </li></ol> 5. Le cellule la coltura e irradiante 3T3 come fonte alimentatore <ol><li> Preparare medio 3T3, comprendente DMEM, 10% FBS, 1x penicillina / streptomicina e 2 mM L-glutammina. </li><li> Cultura 3T3 nel tessuto trattato con T-75 fiaschi almeno 3 giorni prima dell&#39;arrivo dei campioni dei pazienti. <ol><li> Poco prima dell&#39;arrivo dei campioni dei pazienti, trypsinize 3T3 con 5 ml di 0,25% tripsina-EDTA per bombola e incubare a 37 ° C per 5 minuti o fino a quando la maggior parte delle cellule sono galleggianti </li></ol></li><li> Aggiungere 5 ml di 3T3 mezzo per fermare la reazione. Aspirare la sospensione cellulare e trasferire ad un tubo da 15 ml. Spin per 5 min a 300 x g. </li><li> Aspirare il medio e risospendere le cellule in un determinato volume di Trypan blu per il conteggio delle cellule. Unire 10 ml di cellule con 10 ml di Trypan blu di escludere le cellule morte. Carico 10 ml di questa soluzione in un emocitometro per il conteggio delle cellule. NOTA: Per questo protocol, densità di semina per irradiati 3T3 è 10.900 cellule per cm 2, che è pari a 600.000 cellule per piastra a 100 mm. </li><li> Aliquota del numero di cellule necessarie al piatto un piatto 100 millimetri per campione del paziente e risospendere in 25 ml di 3T3 media in una provetta da 50 ml e irradiare con 3000 rad. </li><li> A seguito di irraggiamento, le cellule spin down per 5 min a 300 xg e risospendere in media riprogrammazione condizionale a 5 ml per piastra a 100 mm. </li><li> Impostare il tubo da parte fino al rivestimento delle cellule del paziente avviene successivamente nel protocollo (vedi punto 7.6). </li></ol> 6. Ottenere, conservare e trasportare pediatrici esofagee biopsie <ol><li> Aggiungere 5 ml di completo mezzo privo di siero dei cheratinociti con 100 mg / ml primocin a 15 ml provette coniche e portarlo al centro medico sul ghiaccio. NOTA: Questi tubi di media possono essere conservati a 4 ° C per un massimo di 2 mesi. </li><li> Ottenere circa 8 biopsie esofagee in TIme di endoscopia e separato come segue: <ol><li> Mettere sei biopsie nel conica da 15 ml contenente completa di siero cheratinociti medie libero con 100 mg / ml primocin e posto sul ghiaccio bagnato. </li><li> Mettere una biopsia in 5 ml di formalina tamponata e posto sul ghiaccio bagnato. </li><li> Mettere una biopsia in una piccola biopsia cryomold con mescola ottimale temperatura di taglio. <ol><li> goccia Immediatamente questo stampo in un becher di isopentano collocato in azoto liquido. Una volta congelato, collocare il cryomold in un sacchetto campione e memorizzare sul ghiaccio secco in un contenitore di polistirolo espanso. </li></ol></li></ol></li><li> Mettere le provette contenenti biopsie a medio o formalina all&#39;interno di un sacchetto sigillato e poi in una scatola di spedizione contiene ghiaccio umido. Sigillare ed etichettare la scatola con un&#39;etichetta di rischio biologico e trasportarla al laboratorio. NOTA: Il contenitore che contiene il ghiaccio secco e la biopsia congelata è anche sigillato ed etichettato con un&#39;etichetta rischio biologico. </li></ol> 7. ProcessingTessuto del paziente per la Cultura a valle e analisi <ol><li> All&#39;arrivo presso il laboratorio, trasferire la biopsia congelato in ghiaccio secco a -80 ° C freezer per il sezionamento a valle o estrazione di RNA. Mettere il campione in formalina. Conservare in frigorifero C 4 ° e permettono di risolvere durante la notte. </li><li> Spin i restanti biopsie giù a 300 xg, e aspirare il terreno. Aggiungere 10 ml di dispasi soluzione al tubo conico, guarnizione e lasciarla incubare a 37 ° C a bagnomaria per 15 minuti. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, girare le biopsie giù a 300 x g. Aspirare biopsie medio e risospendere in 5 ml di 0,05% tripsina-EDTA. </li><li> Trasferire il 5 ml di tripsina-EDTA contenente le biopsie ad una piastra sterile 100 mm e sminuzzare biopsie con 2 lamette sterilizzati più sottile possibile. </li><li> Trasferire il 5 ml di tripsina-EDTA contenente biopsie macinate in un 15 mL conica. Sciacquare la piastra due volte con un ulteriore 5 ml di 0,05% tripsina-EDTA e aggiungere alla conicatubo. Incubare la provetta per 10 minuti in un bagno d&#39;acqua 37 ° C. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, girare le biopsie giù a 300 xg (1,4 rpm) per 5 min e aspirare il terreno. Aggiungere 5 ml di terreno riprogrammazione condizionale per il tubo conico, nonché il 5 ml di terreno di riprogrammazione condizionale che contiene le cellule di alimentazione irradiate (vedi punto 5.7). </li><li> Aggiungere inibitore ROCK (1 ml / mL) al 10 ml di sospensione cellulare e piatto dopo aspirando la gelatina dal piatto di coltura tissutale. Incubare a 37 ° C. </li></ol> 8. Coltura e cellule espansione <ol><li> Dopo circa 5 giorni di coltura, aspirare il terreno iniziale contenente i pezzi tritato-biopsia e sciacquare il piatto 2-3 volte con 5 ml di PBS sterile. Aggiungere nuovo mezzo alla piastra compreso inibitore ROCK a 10 micron. </li><li> Giunti 70% di confluenza, espandere le cellule. Aggiungere 5 ml di 0,05% tripsina-EDTA alla piastra e incubare in un incubatore a 37 ° non più di 2,5 minuti per rimuovere °cellule di alimentazione e. Dopo che l&#39;incubazione, aspirare il tripsina-EDTA e sciacquare la piastra con 5 ml di PBS. </li><li> Aspirare il PBS e aggiungere 5 ml di 0,25% tripsina-EDTA alla piastra e incubare per 5-10 minuti o fino a quando le cellule sono sciolti dalla piastra. Aggiungere quantità uguali di mezzo alla piastra per bloccare la reazione e trasferire tutto il fluido in un tubo da 50 ml conica e centrifugare a 300 xg per 5 min. </li><li> Risospendere le cellule in un volume definito di media riprogrammazione condizionale e mescolare 10 ml di sospensione con 10 ml di trypan blu. Contare su un emocitometro per determinare il numero totale delle cellule. </li><li> Per espandere cellule, aggiungere 1 milione di cellule umane esofagee ad una piastra 150 millimetri insieme con 1,2 milioni irradiato 3T3 in un volume totale di 15 ml. Aggiungere inibitore ROCK fresco a 10 micron e aggiungere la sospensione cellulare in un piatto di gelatina rivestita 150 mm. </li></ol> 9. Le cellule congelare e conservare umano esofageo epiteliali <ol><li> Per rendere media di congelamento, aggiungere il 10%DMSO medio riprogrammazione condizionale. Dopo trypsinizing e conteggio, un&#39;aliquota le cellule di congelare in un nuovo tubo 50 ml conica e centrifugare a 300 xg per 5 min. </li><li> Aspirare il medio e aggiungete il congelamento di media ad un volume di 2 ml per esageratamente. Una volta che la sospensione cellulare è omogenea, un&#39;aliquota da 10 6 cellule in cyrovials pre-etichettato. Mettere in un contenitore di congelamento a -80 ° C per almeno 24 h prima di spostare le fiale di conservazione in azoto liquido a lungo termine. </li></ol>

<ol><li>Clark, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Esophageal+atresia+and+tracheoesophageal+fistula%5BTitle%5D)+AND+%22Am+Fam+Physician%22%5BJournal%5D)">Esophageal atresia and tracheoesophageal fistula.</a> Am Fam Physician. 59 (4), 910-920 (1999).</li>
<li>Soon, I. S., Butzner, J. D., Kaplan, G. G., deBruyn, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+and+prevalence+of+eosinophilic+esophagitis+in+children%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pediatr+Gastroenterol+Nutr%22%5BJournal%5D)">Incidence and prevalence of eosinophilic esophagitis in children.</a> J Pediatr Gastroenterol Nutr. 57 (1), 72-80 (2013).</li>
<li>Sjöqvist, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+orthotopic+transplantation+of+a+tissue-engineered+oesophagus+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Experimental orthotopic transplantation of a tissue-engineered oesophagus in rats.</a> Nat Commun. 5, 3562(2014).</li>
<li>Saxena, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Esophagus+tissue+engineering%3A+designing+and+crafting+the+components+for+the+%27hybrid+construct%27+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pediatr+Surg%22%5BJournal%5D)">Esophagus tissue engineering: designing and crafting the components for the 'hybrid construct' approach.</a> Eur J Pediatr Surg. 24 (3), 246-262 (2014).</li>
<li>Saxena, A. K., Ainoedhofer, H., Höllwarth, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+ovine+esophageal+epithelial+cells+and+in+vitro+esophagus+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Culture of ovine esophageal epithelial cells and in vitro esophagus tissue engineering.</a> Tissue Eng Part C Methods. 16 (1), 109-114 (2010).</li>
<li>Saxena, A. K., Kofler, K., Ainodhofer, H., Hollwarth, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Esophagus+tissue+engineering%3A+hybrid+approach+with+esophageal+epithelium+and+unidirectional+smooth+muscle+tissue+component+generation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gastrointest+Surg%22%5BJournal%5D)">Esophagus tissue engineering: hybrid approach with esophageal epithelium and unidirectional smooth muscle tissue component generation in vitro.</a> J Gastrointest Surg. 13 (6), 1037-1043 (2009).</li>
<li>Macheiner, T., Kuess, A., Dye, J., Saxena, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+isolation+of+epithelial+cells+from+ovine+esophagus+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Mater+Eng%22%5BJournal%5D)">A novel method for isolation of epithelial cells from ovine esophagus for tissue engineering.</a> Biomed Mater Eng. 24 (2), 1457-1468 (2014).</li>
<li>Mishra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significance+of+Mouse+Models+in+Dissecting+the+Mechanism+of+Human+Eosinophilic+Gastrointestinal+Diseases+%28EGID%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gastroenterol+Hepatol+Res%22%5BJournal%5D)">Significance of Mouse Models in Dissecting the Mechanism of Human Eosinophilic Gastrointestinal Diseases (EGID).</a> J Gastroenterol Hepatol Res. 2 (11), 845-853 (2013).</li>
<li>Medvedev, S. P., Shevchenko, A. I., Zakian, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+Pluripotent+Stem+Cells%3A+Problems+and+Advantages+when+Applying+them+in+Regenerative+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Naturae%22%5BJournal%5D)">Induced Pluripotent Stem Cells: Problems and Advantages when Applying them in Regenerative Medicine.</a> Acta Naturae. 2 (2), 18-28 (2010).</li>
<li>Metallo, C. M., Azarin, S. M., Ji, L., de Pablo, J. J., Palecek, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+tissue+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Engineering tissue from human embryonic stem cells.</a> J Cell Mol Med. 12 (3), 709-729 (2008).</li>
<li>Lee, H., Park, J., Forget, B. G., Gaines, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+in+regenerative+medicine%3A+an+argument+for+continued+research+on+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells in regenerative medicine: an argument for continued research on human embryonic stem cells.</a> Regen Med. 4 (5), 759-769 (2009).</li>
<li>Ghaedi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+iPS+cell-derived+alveolar+epithelium+repopulates+lung+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Human iPS cell-derived alveolar epithelium repopulates lung extracellular matrix.</a> J Clin Invest. 123 (11), 4950-4962 (2013).</li>
<li>Huang, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+lung+and+airway+epithelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. , (2013).</li>
<li>Ogaki, S., Morooka, M., Otera, K., Kume, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cost-effective+system+for+differentiation+of+intestinal+epithelium+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A cost-effective system for differentiation of intestinal epithelium from human induced pluripotent stem cells.</a> Sci Rep. 5, 17297(2015).</li>
<li>Ehrhardt, C., Kim, K. J., Lehr, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+human+alveolar+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of human alveolar epithelial cells.</a> Methods Mol Med. 107, 207-216 (2005).</li>
<li>Zubeldia-Plazaola, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+methods+for+the+isolation+of+human+breast+epithelial+and+myoepithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Comparison of methods for the isolation of human breast epithelial and myoepithelial cells.</a> Front Cell Dev Biol. 3, 32(2015).</li>
<li>Spurrier, R. G., Speer, A. L., Hou, X., El-Nachef, W. N., Grikscheit, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+and+human+tissue-engineered+esophagus+form+from+sufficient+stem%2Fprogenitor+cells+and+do+not+require+microdesigned+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Murine and human tissue-engineered esophagus form from sufficient stem/progenitor cells and do not require microdesigned biomaterials.</a> Tissue Eng Part A. 21 (5-6), 906-915 (2015).</li>
<li>Roche, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+purified+epithelial+cell+population+from+human+colon%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Isolation of a purified epithelial cell population from human colon.</a> Methods Mol Med. 50, 15-20 (2001).</li>
<li>Southgate, J., Hutton, K. A., Thomas, D. F., Trejdosiewicz, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+human+urothelial+cells+in+vitro%3A+proliferation+and+induction+of+stratification%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Normal human urothelial cells in vitro: proliferation and induction of stratification.</a> Lab Invest. 71 (4), 583-594 (1994).</li>
<li>Kalabis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+mouse+and+human+esophageal+epithelial+cells+in+3D+organotypic+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of mouse and human esophageal epithelial cells in 3D organotypic culture.</a> Nat Protoc. 7 (2), 235-246 (2012).</li>
<li>Geraghty, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+use+of+cell+lines+in+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the use of cell lines in biomedical research.</a> Br J Cancer. 111 (6), 1021-1046 (2014).</li>
<li>Lodish, H., Berk, A., Zipursky, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLodish%2C+H+%22Molecular+Cell+Biology%22">Molecular Cell Biology</a>. , W.H. Freeman. New York. (2000).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROCK+inhibitor+and+feeder+cells+induce+the+conditional+reprogramming+of+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells.</a> Am J Pathol. 180 (2), 599-607 (2012).</li>
<li>Suprynowicz, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditionally+reprogrammed+cells+represent+a+stem-like+state+of+adult+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Conditionally reprogrammed cells represent a stem-like state of adult epithelial cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (49), 20035-20040 (2012).</li>
<li>Davis, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+retinal+pigment+epithelial+cell+line+that+retains+epithelial+characteristics+after+prolonged+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">A human retinal pigment epithelial cell line that retains epithelial characteristics after prolonged culture.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 36 (5), 955-964 (1995).</li>
<li>Carro, O. M., Evans, S. A., Leone, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+inflammation+on+the+proliferation+of+human+gingival+epithelial+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Effect of inflammation on the proliferation of human gingival epithelial cells in vitro.</a> J Periodontol. 68 (11), 1070-1075 (1997).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

I passi più importanti al fine di isolare ed espandere cellule epiteliali dell&#39;esofago da biopsie di pazienti sono: 1) adeguatamente dissociare biopsia del tessuto con la morte delle cellule minimo; 2) garantire inibitore ROCK viene aggiunto al mezzo di coltura cellulare ad ogni cambio medio; 3) Non utilizzare più cellule di alimentazione di quanto raccomandato; 4) mantenere una cultura asettica pulito; e 5) le cellule di passaggio appena prima di raggiungere confluenza. A causa delle di...

ingegneria dei tessuti dell&#39;esofago e esofagite eosinofila (EoE) sono stati al centro della ricerca in molti laboratori nel corso dell&#39;ultimo decennio. Difetti congeniti, come atresia esofagea, si osservano in circa 1 su 4000 nati vivi, che si traduce nello sviluppo incompleto dell&#39;esofago porta alla incapacità di mangiare 1. L&#39;incidenza e la prevalenza di EoE sono in aumento da quando l&#39;identificazione del soggetto malattia nel 1993. L&#39;incidenza di EoE varia 0,7-10 / 100.000 a persona-anno e la prevalenza variava 0,2-43 / 100.000 2. Un nuovo approccio chirurgico interessante per il trattamento a lungo divario atresia esofagea consiste nel generare costrutti di tessuto per l&#39;impianto che utilizza le cellule del paziente. Queste cellule in combinazione con impalcature sintetica genera un costrutto autologo che non richiede immunosoppressione. Alcuni gruppi hanno già iniziato ad indagare negli Stati Unitie di cellule staminali-simili per l&#39;ingegneria tissutale esofageo 3 nonché l&#39;uso di cellule epiteliali dell&#39;esofago nativi per ripopolare mucosa 4 - 7. Malattie che sono presenti in esofago di pazienti pediatrici sono spesso difficili da diagnosticare o studiare senza intervento. Inoltre, utilizzando modelli animali o in vitro immortalati modelli di linee cellulari per le malattie pediatriche come EoE non comprendere l&#39;esatta patogenesi della malattia o differenze specifiche del paziente 8. Pertanto, la capacità di studiare processo patologico di un paziente in vitro per identificare specifici innescare malattie antigeni, valutare meccanismi sottostanti e indagare trattamenti farmacologici sarebbe romanzo e fornire ai medici informazioni che possono aiutare nel trattamento del paziente. Ci sono stati molti tipi di cellule autologhe o paziente-specifici che sono stati proposti per l&#39;uso in tissue di ingegneria e studiare la patogenesi delle malattie umane. Tuttavia, alcuni di questi tipi cellulari sono limitati nella loro capacità di generare abbastanza cellule di un fenotipo specifico per inizializzare una grande impalcatura o eseguire high throughput studi in vitro. L&#39;utilizzo di cellule staminali pluripotenti o multipotenti è stato l&#39;argomento di discussione di ricerca molto, tuttavia, i limiti e le lacune per l&#39;utilizzo di queste cellule sono stati ben descritti 9. L&#39;uso di cellule staminali embrionali umane è molto dibattuto e presenta molti problemi etici. Soprattutto, queste cellule formano teratomi, che sono simili a un tumore, se non sono differenziati dal loro stato pluripotente prima trasporto loro in un ospite vivente 10. Inoltre, l&#39;uso di cellule staminali embrionali non sarebbe paziente-specifico e potrebbe provocare una risposta allogenico e la necessità di soppressione immunitaria 10. Cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) sono cellule pluripotenti che possonoessere derivato dalle cellule di un paziente. cellule somatiche, come le cellule della pelle, possono essere indotte a uno stato pluripotente utilizzando una varietà di tecniche integrative e non integrative. Queste cellule poi servire come un paziente-specifici fonti di cellule per l&#39;ingegneria tissutale o indagine malattia. L&#39;integrazione di materiale genetico indesiderato in queste cellule è una preoccupazione molti hanno descritto ed anche se le sequenze sono completamente rimossi iPSCs apparire per preservare una &quot;memoria&quot; epigenetica verso il tipo di cellula da cui sono stati ricavati 11. Queste cellule anche formeranno teratomi in vivo se non differenziati prima del trapianto 11. Molti protocolli di differenziazione sono stati indagati concentrandosi su linee dell&#39;epitelio 12, 13, 14, tuttavia, è molto importante notare che i tipi cellulari risultanti alla fine di differenziazione non sono omogenei e oolo possiede una frazione del tipo cellulare di interesse. Questo si traduce in bassa resa e la necessità di purificare il tipo cellulare desiderato. Anche se iPSCs sono una potenziale fonte di cellule specifiche del paziente, il processo per ottenere un tipo di cellula di interesse sia per l&#39;ingegneria dei tessuti o indagine malattia è molto inefficiente. Cellule epiteliali umane sono state isolate con successo da una varietà sia di tessuti malati e non malati nel corpo umano, inclusi: polmone 15, seno 16, intestino tenue 17, colon 18, vescica 19 e dell&#39;esofago 20. È importante notare che le cellule primarie umane hanno un numero finito di passi in cui il fenotipo viene mantenuta 21, 22. Sfortunatamente, questo significa che il numero di cellule necessarie per indagini di malattia o per la semina un&#39;impalcatura ingegnerizzatoper l&#39;impianto non può essere raggiunto. Pertanto, sono necessarie nuove tecniche per espandere le cellule dei pazienti, pur mantenendo un fenotipo epiteliale. Riprogrammazione condizionale di normali e tumorali cellule epiteliali che utilizzano cellule di alimentazione e inibitore ROCK è stato descritto nel 2012 da Liu et al. 2 3. Questa tecnica è stata utilizzata per espandere le cellule epiteliali cancerose ottenuti da biopsie di cancro alla prostata e al seno utilizzando cellule di alimentazione irradiati, inibitore ROCK e medie riprogrammazione condizionale. L&#39;obiettivo era di generare abbastanza cellule per test in vitro, come lo screening di stupefacenti. Questa tecnica è in grado di espandere cellule epiteliali indefinitamente &quot;riprogrammazione&quot; queste cellule a uno stelo o stato progenitore simile, che è altamente proliferativo. È stato dimostrato che queste cellule sono non tumorigeniche e non possiedono la capacità di formare teratomi 23, 24. Inoltre, nessunanomalie cromosomiche o manipolazioni genetiche erano presenti dopo passaging queste cellule in coltura con questa tecnica 23, 24. Ancora più importante, queste cellule sono in grado di differenziarsi in cellule del tipo nativo di interesse. Pertanto, questa tecnica offre un grande serbatoio di cellule epiteliali paziente-specifiche per le indagini malattie o ingegneria dei tessuti senza necessità di immortalizzazione. Ottenere tessuto epiteliale da un organo specifico, al fine di studiare i processi di malattia è spesso limitata e non sempre è possibile a causa del rischio del paziente. Per quei pazienti affetti da malattia esofagea o difetti, endoscopica recupero biopsia è un approccio minimamente invasivo per ottenere il tessuto epiteliale che può essere dissociato e condizionatamente riprogrammato per fornire una fonte di cellule indefinita che è specifico per la mucosa dell&#39;esofago che del paziente. Questo permette quindi per gli studi in vitrodelle cellule epiteliali per valutare processi di malattia e lo schermo per potenziali terapie. Un processo di malattia che potrebbero notevolmente beneficiare di questo approccio è esofagite eosinofila, che è stato descritto come malattia allergica dell&#39;esofago 8. Prove allergiche e approcci terapeutici potrebbero essere valutati in vitro utilizzando cellule epiteliali del paziente e questi dati possono poi essere trasmessi al medico curante di sviluppare piani di trattamento individualizzato. La tecnica di riprogrammazione condizionale unitamente ottenere biopsie endoscopiche da pazienti pediatrici offre la possibilità di espandere normali cellule epiteliali dell&#39;esofago indefinitamente da qualsiasi paziente. Questa fonte di cellule potrebbe quindi essere abbinato insieme con l&#39;armatura naturale o sintetica per fornire un paziente-specifica opzione chirurgica dei difetti, malattie o traumi. Avere un numero di cellulare indefinito aiuterebbe ingegnere costrutti esofagee che possiedono una struttura completamente reseededlumen con le cellule epiteliali dell&#39;esofago al fine di contribuire a facilitare la rigenerazione dei tipi di cellule rimanenti.

<table><tbody><tr><td>Primocin</td><td>InVivogen</td><td>ant-pm2</td><td></td></tr><tr><td>isopentano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>277258-1L</td><td></td></tr><tr><td>gelatina da pelle suina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1890-100G</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Cryomold</td><td>TissueTek</td><td>4565</td><td></td></tr><tr><td>Cryomatrix OCT</td><td>Thermofisher Scientific</td><td></td><td></td>6769006</tr><tr><td>Provette coniche da 15 mL</td><td>Denville Scientific</td><td>C1017-p</td><td></td></tr><tr><td>Siero completo per cheratinociti Senza terreno</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>10724011</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina Streptomicina</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di insulina</td><td>Sigma Aldrich</td> Fattore di crescita epidermico umano (EGF) <td>I9278-5MLPeprotech</td><td></td></tr> <tr><td></td><td></td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>ROCK Inhibitor (Y-27632)</td><td>Fisher Scientific</td><td>125410</td><td></td></tr><tr><td>F-12 Medium&nbsp;</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>11765054</td><td></td></tr><tr><td>Siero Fetale Bovino</td><td>Denville Scientific</td><td>FB5001</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Thermofisher Scientific 17105041</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,05% Tripsina-EDTA</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Tripsina-EDTA</td><td>Thermofisher Scientific 25200072</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mm</td><td>Piatti Denville Scientific</td><td>T1110-20</td><td></td></tr><tr><td>Piastre da 150 mm</td><td>Denville Scientific</td><td>T1115</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Coniche</td><td>Denville Scientific</td><td>&nbsp; C1062-9&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Compresse saline tamponate con fosfato</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2944-100</td><td></td></tr><tr><td>Pipette da 5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367811D</td><td></td></tr><tr><td>Pipette da 10 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367811E</td><td></td></tr><tr><td>Pipette da 25 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367811</td><td></td></tr><tr><td>9" Pipette Pasteur</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20D</td><td></td></tr><tr><td>Celle NIH 3T3 ATCC</td><td></td><td>CRL1658</td><td></td></tr></tbody></table>

la riprogrammazione di cellule condizionale pediatric umana esofageo epiteliali per l&#39;uso in ingegneria dei tessuti e la malattia investigation

Conditional Reprogramming of Pediatric Human Esophageal Epithelial Cells for Use in Tissue Engineering and Disease Investigation

Identificare ed espandere le cellule specifiche del paziente in coltura per l'uso nell'ingegneria tissutale e nell'indagine sulle malattie può essere molto impegnativo. L'utilizzo di vari tipi di cellule staminali per derivare tipi di cellule di interesse è spesso costoso, dispendioso in termini di tempo e altamente inefficiente. Inoltre, i tipi di cellule indesiderati devono essere rimossi prima di utilizzare questa fonte di cellule, il che richiede un'altra fase del processo. Al fine di ottenere un numero sufficiente di cellule epiteliali esofagee per ingegnerizzare il lume di un costrutto esofageo o per esaminare approcci terapeutici per il trattamento della malattia esofagea, le cellule epiteliali esofagee native devono essere espanse senza alterare la loro espressione genica o fenotipo. La riprogrammazione condizionale del tessuto epiteliale esofageo offre un approccio promettente all'espansione delle cellule epiteliali esofagee paziente-specifiche. Inoltre, queste cellule non hanno bisogno di essere ordinate o purificate e torneranno a uno stato epiteliale maturo dopo averle rimosse dalla coltura di riprogrammazione condizionale. Questa tecnica è stata descritta in molti studi di screening del cancro e consente l'espansione indefinita di queste cellule su più passaggi. La capacità di eseguire saggi di screening esofageo aiuterebbe a rivoluzionare il trattamento delle malattie esofagee pediatriche come l'esofagite eosinofila, identificando il meccanismo scatenante che causa i sintomi del paziente. Per quei pazienti che soffrono di difetti congeniti, malattie o lesioni dell'esofago, questa fonte cellulare potrebbe essere utilizzata come mezzo per seminare un costrutto sintetico per l'impianto per riparare o sostituire la regione interessata.

Una sintesi dei passaggi chiave nel isolare cellule epiteliali esofagee da biopsie di pazienti è riassunto nella figura 1. Le colonie di cellule epiteliali formeranno in circa 4-5 giorni e sarà circondato da cellule di alimentazione dei fibroblasti (Figura 2A). Poiché queste colonie si espandono che si fonderanno con altre colonie di formare colonie più grandi (Figura 2b). Una volta che le culture sono diventate confluenti 70%, devono es...

L&#39;espansione del pediatrici cellule epiteliali umane esofagee che utilizzano riprogrammazione condizionale fornisce gli investigatori con una popolazione paziente-specifici di cellule che possono essere utilizzati per l&#39;ingegneria costrutti esofagei per l&#39;impianto autologo per il trattamento di difetti o lesioni e di fungere da serbatoio per test di screening terapeutici.

La riprogrammazione di cellule condizionale Pediatric umana esofageo epiteliali per l&#39;uso in ingegneria dei tessuti e la malattia Investigation

Identifying and expanding patient-specific cells in culture for use in tissue engineering and disease investigation can be very challenging. Utilizing ...

L'obiettivo generale di questa procedura è espandere cellule epiteliali esofagee derivate da pazienti, ottenute mediante biopsie endoscopiche, per lo studio delle malattie esofagee oppure per creare un impalcatura tridimensionale esofagea per modelli successivi o per il ripristino del tessuto esofageo. Questo metodo può essere utilizzato per comprendere meglio il ruolo delle cellule epiteliali esofagee nelle malattie dell'esofago. Possono inoltre essere utilizzate per ottenere impalcature tridimensionali per modellizzazione o impianto.Il vantaggio di questa tecnica è che ci permette di generare cellule epiteliali specifiche del paziente a partire da un frammento molto piccolo di tessuto, senza la necessità di modifiche genetiche o permanenti. Le implicazioni di questa tecnica riguardano la comprensione della patogenesi dell'esofagite eosinofila, nonché lo sviluppo di trattamenti per l'atresia esofagea e l'esofagite eosinofila. In generale, le persone nuove a questa tecnica incontreranno difficoltà nell'eliminare completamente le cellule feeder prima del prelievo delle cellule epiteliali esofagee umane, al fine di mantenere la purezza.La dimostrazione di questa tecnica sarà effettua

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Definizione e analisi istologica di organoidi esofagei che modellano la progressione da tessuti normali a cancerosi

Scopri la riprogrammazione condizionale di cellule epiteliali esofagee pediatriche umane per l'ingegneria dei tessuti e lo studio delle malattie. Questo metodo consente l'espansione efficiente senza modificazioni genetiche.

La riprogrammazione di cellule condizionale Pediatric umana esofageo epiteliali per luso in ingegneria dei tessuti e la malattia Investigation (Video) | JoVE Journal

La riprogrammazione di cellule condizionale Pediatric umana esofageo epiteliali per l'uso in ingegneria dei tessuti e la malattia Investigation

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