La riprogrammazione di cellule condizionale Pediatric umana esofageo epiteliali per l'uso in ingegneria dei tessuti e la malattia Investigation

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di espandere le cellule epiteliali esofagee derivate dal paziente dalle biopsie endoscopiche per studiare le malattie esofagee o di creare un'impalcatura esofagea 3D per la modellazione a valle o la sostituzione del tessuto esofageo. Questo metodo può essere utilizzato per comprendere meglio il ruolo delle cellule epiteliali esofagee nella malattia esofagea. Possono anche essere utilizzati per vedere scaffold 3D per la modellazione o l'impianto.

Il vantaggio di questa tecnica è che ci consente di generare cellule epiteliali specifiche del paziente da un piccolissimo pezzo di tessuto senza la necessità di modifiche genetiche o permanenti. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla comprensione della patogenesi dell'esofagite eosinofila, nonché allo sviluppo di trattamenti per l'atresia esofagea e l'esofagite eosinofila. In generale, gli individui che non conoscono questa tecnica avranno difficoltà con la capacità di rimuovere completamente le cellule di alimentazione prima di prelevare le cellule epiteliali esofagee umane al fine di mantenere la purezza.

A dimostrare questa tecnica sarà Christopher Foster, tecnico del nostro laboratorio. Almeno tre giorni prima di ottenere i campioni del paziente, piastrate le cellule 3T3 nel terreno di coltura 3T3 in fiasche T75 trattate con tessuti. Il giorno dell'esperimento, poco prima di ottenere i campioni, staccare le cellule 3T3 con 5 millilitri di tripsina-EDTA allo 0,25% per pallone per circa cinque minuti a 37 gradi Celsius.

Quando la maggior parte delle cellule galleggia, aggiungere 5 millilitri di terreno 3T3 per fermare la reazione e trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica da 15 millilitri per la centrifugazione. Risospendere il pellet nel mezzo per il conteggio. Quindi, trasferire il numero appropriato di cellule per la semina in una provetta conica da 15 millilitri.

Quindi, aggiungere 25 millilitri di terreno 3T3 fresco alle celle per l'irradiazione a 3000 rad. Quindi, raccogliere le celle mediante centrifugazione e risospendere il pellet in un mezzo di programmazione condizionale a cinque millilitri per piastra da 100 millimetri. Dopo aver ottenuto circa sei biopsie esofagee al momento dell'endoscopia, posizionare sei biopsie in una provetta conica da 15 millilitri contenente un terreno cheratinocitario completo privo di siero, integrato con Primocin su ghiaccio umido.

Posizionare una biopsia in cinque millilitri di formalina tamponata su ghiaccio umido e posizionare una biopsia in un piccolo criomold per biopsia contenente terreno di inclusione. Immergere immediatamente lo stampo in un becher di ghiaccio o pentano all'interno di un contenitore di azoto liquido. Una volta che il tessuto è congelato, posizionare il criomold in un sacchetto per campioni su ghiaccio secco, in un contenitore di polistirene espanso.

Quindi, posizionare le provette delle biopsie all'interno di un sacchetto sigillabile all'interno di una scatola di spedizione con l'etichetta di rischio biologico contenente ghiaccio umido e sigillare ed etichettare entrambi i contenitori con un adesivo di rischio biologico per il trasporto in laboratorio. All'ingresso in laboratorio, trasferire immediatamente la biopsia congelata in una posizione di conservazione a meno 80 gradi Celsius per il sezionamento a valle o l'estrazione dell'RNA. Posizionare il campione in formalina in un frigorifero a quattro gradi Celsius per la fissazione notturna e posizionare le biopsie rimanenti nella centrifuga.

Sostituire il terreno in ogni provetta con 10 millilitri di soluzione di dispasi e sigillare le provette per un'incubazione di 15 minuti a 37 gradi Celsius in un bagno d'acqua. Al termine dell'incubazione, centrifugare nuovamente le biopsie e sospendere nuovamente i campioni in cinque millilitri di tripsina-EDTA allo 0,25%. Trasferire le biopsie su una singola piastra sterile da 100 millilitri e utilizzare due rasoi sterilizzati per tritare i tessuti il più finemente possibile.

Quando tutto il tessuto è stato tagliato, trasferire i frammenti di tessuto in una nuova provetta da 15 millilitri e risciacquare la piastra due volte con cinque millilitri di tripsina-EDTA allo 0,05%. Raccogliere i lavaggi nella provetta e riportare i campioni a un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Dopo 10 minuti, centrifugare i pezzi del campione digerito e le celle di alimentazione e risospendere i pellet in cinque millilitri di mezzo di riprogrammazione condizionale, ciascuno.

Quindi, combinare i campioni di alimentazione e biopsia esofagea in un'unica provetta e aggiungere la rho chinasi, o inibitore ROCK, alle cellule per la loro co-coltura su un piatto di coltura tissutale rivestito di gelatina. Dopo circa cinque giorni, rimuovere il terreno e i pezzi di biopsia tritati mediante aspirazione e sciacquare il piatto due o tre volte con cinque millilitri di PBS sterile. Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere 10 millilitri di terreno fresco integrato con inibitore ROCK, alla piastra e riportare la co-coltura nell'incubatore fino a quando le cellule non raggiungono il 70% di confluenza.

Per espandere le cellule, rimuovere gli alimentatori con cinque millilitri di tripsina-EDTA allo 0,05% a 37 gradi Celsius per non più di due minuti e mezzo. Sciacquare la piastra con cinque millilitri di PBS fresco per rimuovere le cellule di alimentazione galleggianti e aggiungere cinque millilitri di tripsina-EDTA allo 0,25% per un'incubazione da cinque a 10 minuti fino a quando le cellule del campione bioptico non si sono staccate dal fondo della piastra. Quindi, interrompere la reazione con 10 millilitri di terreno fresco e trasferire le cellule in una provetta conica da 50 millilitri per la centrifugazione.

Risospendere il pellet in un nuovo mezzo di riprogrammazione condizionale per il conteggio e, ora, contare una volta 10 per la sesta cellula esofagea umana in un nuovo tubo conico. Aggiungere 1,2 volte 10 alla sesta cellula 3T3 irradiata alle cellule esofagee e portare il volume totale nella provetta a 15 millilitri con un nuovo terreno di riprogrammazione condizionale. Quindi, aggiungere l'inibitore ROCK fresco alle cellule e preparare la co-coltura su un piatto da 150 millimetri rivestito di gelatina.

Per congelare le cellule esofagee per una conservazione di meno 80 gradi Celsius, rimuovere gli alimentatori e staccare le cellule esofagee come appena dimostrato. Quindi, trasferire le cellule in una nuova provetta conica da 50 millilitri per la centrifugazione e risospendere il pellet a una volta per 10-6 celle per due millilitri di concentrazione del mezzo di congelamento. Quindi, trasferire due millilitri di cellule in ciascun crioviale pre-marcato e conservare i campioni a meno 80 gradi Celsius per almeno 24 ore prima di spostarli in un deposito di azoto liquido a lungo termine.

Le colonie di cellule epiteliali si formeranno in circa quattro o cinque giorni e saranno circondate da cellule alimentatrici di fibroblasti. Man mano che queste colonie si espandono, si fonderanno con altre colonie per formare colonie più grandi. Una volta che la cultura è diventata confluente al 70%, devono essere espanse.

Dopo che le cellule di alimentazione sono state rimosse, le cellule epiteliali aderenti possono essere tripsonizzate e ripiastrate su nuove cellule di alimentazione irradiate. La caratterizzazione fenotipica di queste cellule tramite qRT-PCR rivela una sovraregolazione di P63, un marcatore cellulare progenitore alla fine del primo passaggio, rispetto al campione iniziale di biospia, indicando che le cellule sono state riprogrammate in uno stato più simile allo staminali progenitore. Quando queste cellule vengono trasferite su piastre di coltura tissutali normali, l'espressione di P63 diminuisce e le espressioni della proteina a giunzione stretta, o TJP1, e della E-caderina aumentano, dimostrando uno spostamento del fenotipo da cellula progenitrice a cellula epiteliale più differenziata.

L'analisi citofluorimetrica delle cellule dopo il primo passaggio indica che oltre il 90% delle cellule è positivo anche per EpCAM. La colorazione in immunofluorescenza dimostra che le cellule mantengono il loro marcatore epiteliale, il marcatore progenitore, il marcatore di proliferazione e l'espressione della proteina della giunzione stretta epiteliale. Il tempo di raddoppio delle cellule esofagee di un paziente non malato è stato calcolato in circa 36-40 ore, anche se è probabile che il tempo di raddoppio delle cellule malate sarà più lento.

Una volta padroneggiata, questa tecnica dovrebbe essere completata in circa un'ora. Durante il tentativo di questa procedura, assicurarsi di utilizzare una tecnica sterile per prevenire la contaminazione e assicurarsi di lavorare rapidamente per mantenere la vitalità cellulare. Dopo questa procedura, possono essere eseguiti altri saggi, come la coltura transwell, per valutare quali antigeni causano l'infiammazione esofagea o la patogenesi.

Dopo lo sviluppo, questo test aprirà la strada ai ricercatori per identificare gli antigeni scatenanti che causano l'esofagite eosinofila, nonché nuove opzioni di trattamento per il trattamento di questi pazienti. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare ed espandere le cellule epiteliali esofagee dalle biopsie endoscopiche da utilizzare nello studio delle malattie esofagee o nella generazione di modelli 3D. Non dimenticare che lavorare con strumenti affilati e tessuti biologici può essere pericoloso.

Assicurarsi di smaltire correttamente gli strumenti appuntiti e di utilizzare buone pratiche di biosicurezza.