MitoCeption: Trasferimento isolato umana MSC mitocondri di Glioblastoma cellule staminali

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di trasferire i mitocondri precedentemente isolati da cellule di donatori come le cellule staminali mesenchimali a cellule bersaglio come le cellule staminali del glioblastoma. Questa procedura può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del metabolismo, come gli effetti metabolici e biologici dei mitocondri che vengono trasferiti spontaneamente tra le cellule attraverso processi come il tunneling di nanotubi o microvescicole. Il vantaggio principale di questa tecnica è che gli effetti dei mitocondri possono essere valutati indipendentemente da altri fattori presenti nel microambiente come citochine o metaboliti e anche da altri composti che possono anche essere trafficati nei nanotubi a effetto tunnel.

Ai fini dell'imaging, i mitocondri delle MSC e le GSC possono essere marcati con coloranti vitali prima del trasferimento dei mitocondri da parte di MitoCeption. Per iniziare, dopo aver pre-marcato le GSC con coloranti vitali secondo il protocollo di testo, raccogliere le neurosfere GSC in una provetta da 50 millilitri mediante centrifugazione a 270 volte g a 20 gradi Celsius per cinque minuti. Utilizzare cinque millilitri di HBSS per lavare le cellule e far girare nuovamente la provetta.

Aspirare il surnatante e con 100 microlitri di tripsina-EDTA allo 0,25% risospendere delicatamente il pellet di GSC. Quindi incubare le cellule a 37 gradi Celsius per tre minuti. Quindi, aggiungere 10 microlitri di cloruro di calcio 20 millimolari in due microlitri a 10 milligrammi per millilitro di DNasi I nella provetta.

Dissociare le neurosfere utilizzando una pipetta P200 per pipettare delicatamente su e giù da 30 a 50 volte evitando la formazione di bolle. Aggiungere 10 microlitri di inibitore della tripsina al 5% in 10 millilitri di HBSS alle cellule e centrifugare le GSC per sette minuti. Quindi scartare il surnatante e 10 millilitri di GSC Basal Medium nel campione.

Ora, utilizzando una camera di conteggio Thoma, conta le cellule prima di girare di nuovo. Aggiungere il volume appropriato di terreno di proliferazione delle GSC per raggiungere una concentrazione cellulare di 10 al sesto GSC per millilitro. Quindi seminare da 10 al quinto GSC per pozzetto di una piastra a 96 pozzetti.

Centrifugare la piastra in modo che le GSC si depositino sul fondo dei pozzetti. Controllare le cellule al microscopio. Quindi incubare la piastra a 37 gradi Celsius.

Per eseguire l'isolamento dei mitocondri delle MSC, iniziare regolando la temperatura della microcentrifuga a quattro gradi Celsius. Preparare due provette da 1,5 millilitri etichettate A e C contenenti i reagenti per l'estrazione dei mitocondri. Preparare due provette aggiuntive etichettate MSC e MiTo.

Mantieni i tubi sul ghiaccio. Preparare anche le provette per le diluizioni seriali dei mitocondri che verranno impostate con la preparazione dei mitocondri. Utilizzare 10 millilitri di PBS preriscaldato a 37 gradi Celsius per lavare le MSC.

Quindi, con due millilitri di tripsina senza EDTA, lavare le cellule per 10 secondi e aggiungere un ulteriore millilitro di tripsina prima di incubare le cellule a 37 gradi Celsius per cinque-10 minuti. L'uso di EDTA deve essere evitato come da protocollo, in particolare per la tripsinizzazione delle MSC e per gli inibitori della proteasi utilizzati nella preparazione dei mitocondri. Recuperare le MSC aggiungendo 10 millilitri di Alpha MEM 10%FBS e trasferire la sospensione in un tubo da 50 millilitri.

Quindi centrifugare le cellule. Scartare il surnatante e aggiungere 10 millilitri di Alpha MEM 10%FBS al pellet cellulare. Quindi utilizzare una camera di conteggio Malassez per contare le MSC prima di ruotare verso il basso da quattro a cinque volte da 10 alla quinta cella.

Scartare il surnatante, aggiungere un millilitro di Alpha MEM 10%FBS ghiacciato al pellet cellulare e trasferire le cellule nella provetta precedentemente preparata marcata con MSC continuando a mantenerla in ghiaccio. Quindi centrifugare la provetta MSC a 900 volte g a quattro gradi Celsius per cinque minuti e rimuovere tutto il mezzo residuo dalla provetta. Quindi, aggiungere 200 microlitri di reagente di isolamento dei mitocondri A con inibitori della proteasi privi di EDTA alle MSC e agitare a velocità media per cinque secondi.

Quindi lasciare i tubi sul ghiaccio per due minuti esatti. Aggiungere 2,5 microlitri di reagente di isolamento dei mitocondri B e agitare le cellule alla massima velocità per 10 secondi prima di rimettere le provette sul ghiaccio. Ripeti il vortice ogni 30 secondi per cinque minuti.

Ora, aggiungere 200 microlitri di reagente C per l'isolamento dei mitocondri con inibitori della proteasi privi di EDTA alla provetta e mescolare il contenuto inclinando la provetta circa 30 volte. Centrifugare le provette a 700 volte g a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Trasferire il surnatante contenente i mitocondri MSC nella provetta MiTo precedentemente preparata.

Centrifugare il campione a 3.000 volte g a quattro gradi Celsius per 15 minuti. Dopo aver scartato il surnatante, utilizzare 200 microlitri di reagente C per sciacquare il pellet mitocondriale. Quindi far girare la sospensione a 12.000 volte g a quattro gradi Celsius per cinque minuti per pellettare gli organelli.

Per trasferire i mitocondri isolati delle MSC alle GSC, aggiungere 200 microlitri di terreno di proliferazione delle GSC pre-raffreddato al pellet mitocondriale. Diluire il preparato mitocondriale nel terreno di proliferazione delle GSC per consentire costantemente l'aggiunta di 20 microlitri di sospensione mitocondriale alle GSC. Quindi, aggiungi lentamente i mitocondri vicino al fondo del pozzo.

Per controllare la perdita di colorante vitale nei mitocondri MSC, aggiungere la stessa quantità di preparato mitocondriale ai pozzetti di una piastra a 96 pozzetti contenente solo terreno di proliferazione GSC. Centrifugare le piastre a 1.500 volte g a quattro gradi Celsius per 15 minuti. Quindi posizionare immediatamente le colture a 37 gradi Celsius.

Il giorno seguente, per analizzare i pozzetti di controllo per la perdita di colorante vitale, seminare le cellule GSC come descritto in precedenza, centrifugare la piastra e quindi incubare le colture a 37 gradi Celsius per un'ora. Centrifugare la piastra a 96 pozzetti contenente solo mitocondri. Quindi aspirare il terreno dalla piastra a 96 pozzetti GSC e sostituirlo con il surnatante dei mitocondri.

Incubare le GSC con il surnatante mitocondriale a 37 gradi Celsius per due ore. Infine, eseguire l'analisi del trasferimento dei mitocondri, l'analisi FACS e l'imaging confocale secondo il protocollo di testo. Le GSC sono cellule staminali tumorali coltivate come neurosfere per preservare le loro proprietà di cellule staminali.

Poco prima del trasferimento mitocondriale, vengono seminati come singole cellule per consentire un'elevata efficienza di trasferimento dei mitocondri e il giorno seguente, come mostrato qui, si osservano nuovamente le cellule formare neurosfere. In questa figura, i mitocondri MSC marcati in fluorescenza possono essere visti localizzati all'interno delle GSC Gb4. I mitocondri delle MSC compaiono in tutte le GSC in modo simile ai mitocondri delle GSC.

Il trasferimento dei mitocondri delle MSC può essere osservato per la maggior parte delle GSC nella ricostruzione 3D dalle immagini confocali delle GSC che confermano la localizzazione intercellulare dei mitocondri delle MSC trasferite. La pre-marcatura delle GSC con coloranti vitali cellulari blu e rossi ha permesso di visualizzare la localizzazione dei mitocondri MSC trasferiti in verde rispetto ai mitocondri GSC endogeni. Come mostrato qui, la MitoCeption con quantità crescenti di mitocondri fluorescenti MSC ha portato a un aumento dei segnali FACS e con diversi ordini di grandezza superiori al segnale di controllo.

Il protocollo di trasferimento dei mitocondri qui presentato, eseguito su GSC a singola cellula, ha mostrato una risposta dose-dipendente e un'intensità di fluorescenza media relativa. Infine, sebbene il trasferimento dei mitocondri delle MSC sia stato ottenuto anche sulle neurosfere delle GSC, l'efficacia del trasferimento alle GSC in queste condizioni è stata inferiore rispetto ai mitocondri trasferiti alle GSC seminate per la prima volta come cellule singole. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre ore se eseguita correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di mantenere sempre la preparazione dei mitocondri sul ghiaccio. Seguendo queste procedure, è possibile eseguire altri metodi come la FACS, la microscopia confocale, la QPCR sul DNA mitocondriale al fine di visualizzare e quantificare il trasferimento mitocondriale delle MSC alle cellule bersaglio. Possono anche essere eseguiti studi funzionali per determinare gli effetti biologici dei mitocondri trasferiti.

Tieni presente che questi studi saranno generalmente eseguiti con quantità inferiori di mitocondri rispetto a quelli utilizzati per visualizzare il trasferimento dei mitocondri. Questa tecnica permetterà di esplorare l'esito e gli effetti biologici dei mitocondri che vengono trasferiti spontaneamente tra le cellule in condizioni fisiologiche o patologiche normali e contribuirà quindi allo sviluppo di nuovi trattamenti terapeutici.