Name: Lisolamento di mitocondri intatti dal muscolo scheletrico mediante centrifugazione differenziale per alta risoluzione respirometria Misure (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Scopri come isolare mitocondri intatti dal muscolo scheletrico mediante centrifugazione differenziale e misurare le velocità respiratorie dei complessi I, II e IV tramite respirometria ad alta risoluzione.

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Questo studio è stato sostenuto dal Fondo Nazionale Svizzero per la Ricerca Scientifica (Grant 32003B_127619).

La biopsia muscolo quadricipite viene prelevata da un suino anestetizzato, da cui i mitocondri sono isolate mediante centrifugazione differenziale. Il maiale viene utilizzata in seguito per un altro esperimento. Lo studio è effettuata in conformità con le linee guida del National Institutes of Salute per la cura e l&#39;uso di animali da esperimento e con l&#39;approvazione del Comitato cura degli animali del Canton Berna, Svizzera. 1. Omogeneizzazione muscolo scheletrico e isolamento mitocondriale <ol><li> Excise 5-10 esemplare g muscolo quadricipite da un maiale anestetizzato. Nel presente saggio, usare muscolo scheletrico suina. Questo protocollo può anche essere utilizzata per isolare mitocondri da altre specie (ad esempio, ratti, topi, umano, ecc.). NOTA: Questa fase viene eseguita da un medico specialista con esperienza in chirurgia. <ol><li> maiali sedare con ketamina intramuscolare (20 mg / kg) e xilazina (2 mg / kg), prima dell&#39;anestesia è indotta con intramidazolam venosa (0,5 mg / kg, più atropina 0,02 mg / kg). Mantenere l&#39;anestesia con continue infusioni endovenose di propofol (4-8 mg / kg per h) e fentanyl (30 mg / kg per h) durante l&#39;intervento chirurgico. </li></ol></li><li> Immergere immediatamente il campione di tessuto in un becher contenente 20 mL di tampone isolamento mitocondriale ghiacciata (Tabella 1). NOTA: buffer utilizzati durante l&#39;omogeneizzazione e centrifugazione dovrebbe essere ghiacciata e avere un pH fisiologico rilevante con una forza ionica e osmotica compatibile con citoplasma. </li><li> Pesare il campione di tessuto nel becher su una bilancia analitica tarato. La tara con becher contenente 20 mL di tampone di isolamento. </li><li> Porre il bicchiere in un secchio di ghiaccio. NOTA: eseguire tutti i passi successivi per la procedura di omogeneizzazione alla temperatura secchiello del ghiaccio e mantenere tutti i buffer sul secchiello del ghiaccio. </li><li> Tritare il muscolo scheletrico nel bicchiere (tenere in ghiaccio) in 1-2 mm piccoli pezzi per 3-4 minuti utilizzando SCISS beneors. </li><li> Risciacquare il tessuto tritato nel bicchiere due volte con ghiaccio buffer di isolamento a freddo (20 ml ciascuna fase di lavaggio). </li><li> Sospendere il tessuto in 10 volumi di tampone di isolamento per peso di tessuto (g) contenente 5 mg proteasi / g di tessuto. </li><li> Porre il becher in un bagno di ghiaccio sulla agitatore magnetico e agitare per 10 min. </li><li> Diluire la sospensione nel becher con ulteriori 10 volumi di tampone di isolamento per peso di tessuto (g) supplementato con 0,2% (peso / volume) di albumina di siero bovino sgrassata (BSA). </li><li> Decantare tutto il buffer di isolamento integrato con 0,2% BSA e sciacquare il tessuto nel becher due volte con tampone di ghiaccio freddo isolamento integrato con 0,2% BSA (20 mL ciascuna fase di lavaggio). </li><li> Risospendere il tessuto in 10 volumi di tampone di isolamento per peso di tessuto (g) supplementato con 0,2% BSA sgrassata. </li><li> Omogeneizzare il tessuto con un omogeneizzatore di vetro semi-automatico (tenuti in ghiaccio) con un pestello larghi (10 colpi). NOTA: Homogenizall&#39;e tessuto sempre nello stesso modo (lo stesso numero di colpi, ad esempio, 10 colpi). Un numero maggiore di colpi può danneggiare e disaccoppiare i mitocondri. Preferibilmente, omogeneizzare il tessuto utilizzando un omogeneizzatore automatizzato. Manualmente (e soggettivamente) campioni di tessuto omogeneizzati in omogeneizzatori di vetro possono produrre diverse qualità di mitocondri isolati. </li><li> Centrifugare il tessuto omogeneizzato a 4 ° C per 10 min a 10.000 x g. NOTA: Tutte le fasi di centrifugazione sono eseguite in centrifughe con rotori ad angolo fisso. </li><li> Eliminare il surnatante con una pipetta sierologica e risospendere il pellet in terreno di isolamento ghiacciata BSA-integrato (10 ml / g di tessuto). </li><li> Centrifugare la sospensione a 4 ° C per 10 min a 350 x g. </li><li> Prenotate il surnatante con una pipetta sierologica e scartare il pellet (detriti cellulari). </li><li> Filtrare il surnatante in un becher (tenuti in ghiaccio) attraverso due strati di garza (17 fili / cm 2) per rimuovere DEBR celluleè. </li><li> Centrifugare la sospensione filtrata a 4 ° C per 10 min a 7000 x g. </li><li> Eliminare il supernatante e risospendere il pellet mitocondriale grezzo nel buffer di isolamento (5 mL / g di tessuto) supplementato con 0,2% (peso / volume) BSA e centrifugare la sospensione a 4 ° C per 10 min a 7000 x g. </li><li> Eliminare il surnatante e risospendere il pellet mitocondriale greggio nel tampone di lavaggio (tabella 1). Centrifugare la sospensione di nuovo a 4 ° C per 10 min a 7000 x g. </li><li> Eliminare il supernatante e risospendere il pellet mitocondriale greggio nel tampone di lavaggio e centrifugare la sospensione di nuovo a 4 ° C per 10 min a 7000 x g. </li><li> Eliminare il surnatante e risospendere il pellet mitocondriale greggio in 1,0 ml di tampone di lavaggio. </li><li> Determinare la concentrazione proteica della sospensione mitocondriale e mantenere la sospensione mitocondriale concentrata su ghiaccio. NOTA: la concentrazione di proteine ​​può essere misurata con qualsiasi metodo standard. </li><li> Appena primaper Respirometria saggi, risospendere la sospensione mitocondriale nel buffer respirazione ad una concentrazione finale di 0,4 mg mL proteine ​​/ mitocondriale. </li></ol> 2. ad alta risoluzione respirometria <ol><li> Pipettare 2.1 mL di tampone respirazione (Tabella 1) 16 in una camera oxygraph ad alta risoluzione e mescolare il buffer continuo mediante ancoretta magnetica presente nella camera (700 rpm) a 37 ° C per 1 h fino a quando un segnale di ossigeno flusso stabile di il sensore di ossigeno polarografico si ottiene. NOTA: gli elettrodi di ossigeno polarografici all&#39;interno di ciascuna camera oxygraph misurano la concentrazione di ossigeno e calcolare il consumo di ossigeno (flusso) all&#39;interno di ciascuna camera. La concentrazione di ossigeno e tassi di consumo di ossigeno (flusso) sono visualizzate in tempo reale on-line in un computer utilizzando il software per l&#39;acquisizione e l&#39;analisi dei dati. Inoltre, al fine di garantire risultati accurati e affidabili, ossigeno strumentale correzione del fondo dovrebbe essereeseguite in conformità alle istruzioni del produttore. NOTA: Accurato 2.1 mL di tampone di respirazione viene aggiunto nella camera per la calibrazione di un volume della camera finale di 2,0 ml dopo la chiusura dei tappi. </li><li> Eseguire una taratura dell&#39;aria del sensore di ossigeno polarografico secondo protocolli 17 del produttore. NOTA: Durante la taratura dell&#39;aria, con una fase gassosa presente, la concentrazione di ossigeno media sarà equilibrare dell&#39;ordine di 15-20 min. A seconda della temperatura, pressione barometrica, e la solubilità della concentrazione dei media -oxygen può essere calcolato. </li><li> Dopo la calibrazione dell&#39;aria, aspirare il terreno respirazione dalla camera oxygraph e aggiungere 2,1 ml di sospensione mitocondriale isolata (0,4 mg / ml proteina mitocondriale) dal passaggio 1,24 a una sezione del oxygraph. NOTA: Il volume di tampone respirazione dipende dallo strumento impostare e produttore. Per respirometria alta risoluzione, i 2,1 ml di bu respirazioneffer viene aggiunto nella camera per la calibrazione di un volume della camera finale di 2,0 ml dopo la chiusura dei tappi. </li><li> Chiudere la camera oxygraph mediante inserimento del tappo. </li><li> Mescolare la sospensione mitocondriale continuo mediante una barra magnetica agitazione presente nella camera (700 rpm) a 37 ° C e registrare la respirazione cellulare al basale per 3-5 minuti fino ad ottenere un segnale di flusso di ossigeno stabile. NOTA: la concentrazione di ossigeno e il segnale di flusso di ossigeno vengono visualizzate in tempo reale on-line in un computer utilizzando il software per l&#39;acquisizione e l&#39;analisi dei dati 17. </li><li> Successivamente, iniettare substrati e inibitori della respirazione mitocondriale attraverso i fori di iniezione di titanio dei tappi utilizzando i seguenti protocolli standard. </li></ol> 3. Complesso respirazione I-dipendente <ol><li> Preparare una camera oxygraph contenente la sospensione isolata mitocondriale (0,4 mg / mL) seguendo la procedura descritta nei passaggi 2.1-2.5 eattendere un segnale stabile. </li><li> Iniettare 12,5 ml di 0,8 M malato (5 mM concentrazione finale) e 10 ml di 2 M glutammato (10 mM concentrazione finale) nella camera oxygraph contenente isolato sospensione mitocondriale (0,4 mg / mL) attraverso la porta di iniezione di titanio del tappo camera ed registrare la respirazione cellulare per 3-5 minuti fino ad ottenere un segnale di flusso di ossigeno stabile. NOTA: Tutte le iniezioni nei seguenti operazioni vengono eseguite attraverso i fori di iniezione titanio di tappi che utilizzano siringhe. </li><li> Iniettare 10 ml di 0,05 M ADP (0.25 mM) nella camera oxygraph attraverso la luce di iniezione di titanio del tappo da camera e registrare respirazione mitocondriale fino all&#39;aumentare del segnale di flusso di ossigeno, poi diminuisce e si stabilizza (3-5 min). NOTA: L&#39;altopiano della respirazione dopo l&#39;aggiunta di ADP indica che la concentrazione di ADP era alto e saturazione. A seconda della quantità di mitocondri utilizzati durante la respirazione, concentrazione ADP deve essere titolatoper uno stato 3 il consumo di ossigeno stabile (respirazione massima). L&#39;aggiunta di ADP alla sospensione mitocondriale induce un aumento del consumo di ossigeno e il segnale di flusso di ossigeno aumenta (stato 3 della respirazione). Dopo l&#39;ADP è consumato, il segnale di flusso di ossigeno diminuisce (stato 4 della respirazione). </li></ol> 4. Complesso respirazione II-dipendente <ol><li> Preparare una camera oxygraph contenente isolato sospensione mitocondriale (0,4 mg / mL) seguendo la procedura descritta nei passaggi 2.1-2.5 e attendere un segnale stabile. </li><li> Iniettare 2 ml di 0,2 mM rotenone (0,2 pM) &#39;ATTENZIONE&#39; nella camera oxygraph attraverso la luce di iniezione di titanio del tappo della camera con una siringa e registrare la respirazione cellulare per 3-5 minuti fino a quando un segnale di flusso di ossigeno stabile è raggiunto. NOTA: Rotenone è un veleno pericoloso e può avere un impatto significativo sulla salute umana. </li><li> Iniettare 20 ml di 1 M succinato (10 mm) nel ch oxygraphambra e registrare la respirazione mitocondriale per 3-5 minuti fino a quando un segnale di flusso di ossigeno stabile si ottiene. </li><li> Iniettare 10 ml di 0,05 M ADP (0.25 mM) nella camera oxygraph attraverso la luce di iniezione di titanio del tappo da camera e registrare respirazione cellulare fino all&#39;aumentare del segnale di flusso di ossigeno, stabilizza, poi diminuisce e si stabilizza (3-5 min). NOTA: L&#39;aggiunta di ADP alla sospensione mitocondriale induce un aumento del consumo di ossigeno e il segnale di flusso di ossigeno aumenta (stato 3 della respirazione). Dopo l&#39;ADP è consumato, il segnale di flusso di ossigeno diminuisce (stato 4 della respirazione). </li></ol> 5. Complesso respirazione IV-dipendente <ol><li> Preparare una camera contenente oxygraph isolato sospensione mitocondriale (0,4 mg / ml) seguendo la procedura descritta nei passaggi da 2.1 a 2.5 del protocollo e attendere un segnale stabile. </li><li> Poi iniettare 2,5 ml di 0,8 mm ascorbato (1 mm). Subito dopo l&#39;iniezione di 2,5 ml di 0,2M TMPD (0,25 mM) e 10 ml di 0,05 M ADP (0.25 mM) nella camera oxygraph e registrare respirazione cellulare fino agli ossigeno aumento del segnale di flusso e stabilizza (3-5 min). </li><li> Infine iniettare 10 ml di 1 M sodio azide (5 mm) &#39;ATTENZIONE&#39; nella camera oxygraph e registrare la respirazione cellulare fino a quando il segnale di flusso di ossigeno diminuisce e si stabilizza. NOTA: Sodio azide è un veleno pericoloso e può avere un impatto significativo sulla salute umana. </li></ol> 6. citocromo C test <ol><li> Preparare una camera contenente oxygraph isolato sospensione mitocondriale (0,4 mg / ml) seguendo la procedura descritta nei passaggi da 2.1 a 2.5 del protocollo e attendere un segnale stabile. </li><li> Iniettare 12,5 ml di 0,8 M malato (5 mM concentrazione finale) e 10 ml di 2 M glutammato (10 mM concentrazione finale) nella camera oxygraph contenente isolato sospensione mitocondriale (0,4 mg / mL) attraverso la porta di iniezione di titanio del tappo camerae registrare la respirazione cellulare per 3-5 minuti fino ad ottenere un segnale di flusso di ossigeno stabile. </li><li> Iniettare 10 ml di 0,5 M ADP (2.5 mM) nella camera oxygraph attraverso la luce di iniezione di titanio del tappo camera e registrare respirazione mitocondriale fino all&#39;aumentare del segnale di flusso di ossigeno, poi diminuisce e si stabilizza (3-5 min). </li><li> Infine, iniettare 5 ml di 4 mM citocromo c (10 pM) nella camera oxygraph e registrare la respirazione cellulare per 5 minuti fino ad ottenere un segnale di flusso di ossigeno stabile. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Nel presente studio si descrive un protocollo per isolare alta qualità, intatta e strettamente accoppiati mitocondri muscolari scheletriche mediante centrifugazione differenziale che possono essere utilizzati per gli studi funzionali come ad alta risoluzione respirometria. Per isolare mitocondri intatti e strettamente accoppiati, ci sono alcuni punti critici da considerare all&#39;interno del presente protocollo. Dopo la raccolta del tessuto scheletrico, va subito immerso in tampone isolamen...

bioenergetica mitocondriale e le capacità respiratorie possono essere studiate non solo nelle cellule o fibre permeabilizzate ma anche nei mitocondri isolati. Nel presente studio, si descrive un protocollo per isolare intatte mitocondri dei muscoli scheletrici con centrifugazione differenziale per misure respirometria ad alta risoluzione. Per isolare mitocondri intatti per respirometria, il tessuto è omogeneizzata e mitocondri sono isolati mediante un metodo differenziale centrifugazione convenzionale. Il metodo differenziale centrifugazione si basa su centrifugazioni sequenziali (in una serie di aumentare la velocità) di omogenati di tessuti è stato introdotto da Pallade e collaboratori quasi 70 anni fa 1. Il tessuto viene prima tritata con le forbici e omogeneizzato meccanicamente in un omogeneizzatore di vetro con un pestello larghi. Successivamente l&#39;omogenato viene centrifugato a bassa velocità e il pellet risultante che contiene tessuto ininterrotta, cellulardetriti e nuclei viene scartato. Poi, il surnatante viene centrifugato più volte ad alta velocità e la frazione arricchita mitocondriale viene raccolta. I vantaggi del metodo differenziale centrifugazione per isolare i mitocondri sono che: i) il metodo è veloce e mitocondri può essere isolato all&#39;interno 1-1,5 h (esperimenti respiratorie devono essere eseguite più velocemente possibile); ii) è poco costoso; e iii) è molto efficiente e mitocondri ottenuti mediante centrifugazione differenziale sono abbastanza puro per analisi respirometria. Gli svantaggi di metodo centrifugazione differenziale per isolare i mitocondri sono che i) i mitocondri possano venire danneggiati e sganciato durante l&#39;omogeneizzazione; ii) la contaminazione dei mitocondri con altri componenti cellulari (potrebbe essere risolto ulteriore lavaggio del pellet mitocondriale con fasi di centrifugazione accessorie); iii) la possibilità di selezionare differenti sottopopolazioni mitocondriali, per esempio, durante centrifugazioni differenziali gradini, mitochondria con denso inferiore può essere esclusa 7; e iv) l&#39;mitocondriale circostante cellulare è mancante e solo la respirazione massimo teorico può essere misurata. Un altro metodo per isolare mitocondri per i saggi respirometria è il gradiente di centrifugazione densità 2. In questa tecnica, l&#39;estratto tissutale è stratificato su una soluzione di saccarosio o un gradiente Percoll (con densità maggiore nella parte inferiore del tubo di centrifugazione) e centrifugati a una certa velocità, causando i mitocondri essere isolati da altri componenti cellulari secondo la loro densità. Questo metodo viene spesso utilizzato per isolare i mitocondri cerebrali con molto bassa contaminazione da sinaptosomi. Tuttavia, i mitocondri di fegato di ratto isolati dal gradiente di densità centrifugazione sono altamente contaminati con altri organelli cellulari 3. Uno dei limiti di questo metodo è che il gradiente di saccarosio presente nel tubo di centrifugazione può rompersi cosìMi mitocondri (shock osmotico). A seconda del tipo di tessuto; ci sono alcuni fattori importanti da considerare per l&#39;isolamento dei mitocondri intatti mediante centrifugazione differenziale. La prima necessità è di omogeneizzare i tessuti in un modo delicato. I tessuti molli come il rene, cervello e fegato richiedono forze meccaniche dolci applicate durante l&#39;omogeneizzazione. Questo contrasta con i tessuti duri come il muscolo cardiaco e scheletrico che richiedono forze meccaniche molto più forti. Il tessuto tritato è di solito trattato con proteinasi prima della omogeneizzazione per ammorbidire i tessuti. Tutti i buffer utilizzati durante l&#39;omogeneizzazione e centrifugazione devono essere ghiacciata e avere un pH fisiologico rilevante con una forza ionica e osmotica compatibile con citosol 4, 5. Uno dei vantaggi di studiare isolato bioenergetica mitocondriale è che le membrane plasmatiche cellulari non devono essere permeabilitàzato con detergenti quali digitonina o saponina 4, 6, che potrebbero compromettere l&#39;integrità della membrana mitocondriale esterna. Un altro vantaggio del mitocondri isolati è l&#39;assenza di altri fattori citosolici, che possono interferire con l&#39;analisi delle funzioni mitocondriali quali il consumo di ossigeno. Gli svantaggi di usare mitocondri isolati sono possibili selezione di alcune popolazioni mitocondriali durante le fasi di centrifugazione, danni ai mitocondri durante l&#39;omogeneizzazione, e la necessità di elevate quantità di campioni biologici per ottenere una buona resa di mitocondri isolati 7, 8. Dopo la procedura di isolamento, la frequenza respiratoria dei complessi mitocondriali I-, II- e IV-dipendenti (stati 2, 3 e 4) sono determinati utilizzando ad alta risoluzione respirometria. Per complesso I-guidato la respirazione, il glutammatoe malato sono aggiunti seguito da adenosina difosfato (ADP). Per complesso respirazione II-driven, succinato è aggiunto seguito da ADP. Per complesso IV-driven respirazione, ascorbato e tetramethylphenylendiamine (TMPD) sono aggiunti seguiti da ADP 9, 10, 11, 12. Stato 2 si riferisce al consumo di ossigeno in presenza dei soli substrati. Stato 3 si riferisce al consumo di ossigeno in presenza di substrati e ADP. Stato 4 si riferisce al consumo di ossigeno dopo l&#39;esaurimento ADP. Il rapporto di controllo respiratorio (RCR) è un indice di accoppiamento della produzione di ATP consumo di ossigeno e viene calcolato come rapporto tra stato 3 e 4 dello stato 13, 15. In sintesi, si descrive un protocollo per isolare i mitocondri dei muscoli scheletrici e funzionali intatti per centrifugazione differenziale e utilizzare questi isolati mitochondria per studi funzionali e bioenergetici, come ad alta risoluzione respirometria.

<table><tbody><tr><td>ADP</td><td>Sigma</td><td>A 4386</td><td>Chimico</td></tr><tr><td>Antimicina A</td><td>Sigma</td><td>A 8674</td><td>Chimico, sciogliere in etanolo</td></tr><tr><td>Ascorbato</td><td>Merck</td><td>1.00127</td><td>Chimico</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A 7699</td><td>Chimico</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A 6003</td><td>Chimico</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>fluka</td><td>3779</td><td>Chimico</td></tr><tr><td>Glutammato</td><td>Sigma,G</td> <td>1626</td><td>Chimico</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma</td><td>H 7523</td><td>Chimico</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1.04936</td><td>Chimico</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Merck</td><td>1.04873</td><td>Chimico</td></tr><tr><td>K-lattobionato</td><td>Sigma</td><td>L 2398</td><td></td></tr><tr><td>Chimico MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M 9272</td><td>Acido</td></tr><tr><td>morfolinopropano solfonico chimico (MOPS)</td><td>Merck</td><td>1.06129</td><td></td></tr><tr><td>O2k-Core chimico: ossigrafo-2k&nbsp;</td><td>Oroboros Instruments</td><td>10000-02</td><td>Strumento per respirometria ad alta risoluzione</td></tr><tr><td>Proteinasi, batterica</td><td>Sigma</td><td>P 8038</td><td>Chimico</td></tr><tr><td>Sodio azide</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td>Chimico</td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Sigma</td><td>R 8875</td><td>Chimico, sciogliere in etanolo</td></tr><tr><td>Succinato</td><td>Sigma</td><td>S 2378</td><td>Chimico</td></tr><tr><td>Schuett omogen-plus omogeneizzatore semiautomatico&nbsp;</td><td>schuett-biotec GmbH</td><td>3.201 011</td><td>Omogeneizzatore tissutale</td></tr><tr><td>Taurina</td><td>Sigma</td><td>T 8691</td><td>Chimico</td></tr><tr><td>TMPD</td><td>Sigma</td><td>T 3134</td><td>Chimico</td></tr></tbody></table>

l&#39;isolamento di mitocondri intatti dal muscolo scheletrico mediante centrifugazione differenziale per alta risoluzione respirometria misure

Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

I mitocondri sono coinvolti nel metabolismo energetico cellulare e utilizzano l'ossigeno per produrre energia sotto forma di adenosina trifosfato (ATP). La centrifugazione differenziale a bassa e alta velocità è comunemente utilizzata per isolare i mitocondri dai tessuti e dalle cellule in coltura. Le frazioni mitocondriali grezze ottenute mediante centrifugazione differenziale vengono utilizzate per le misure di respirometria. La tecnica della centrifugazione differenziale si basa sulla separazione degli organelli in base alle loro dimensioni e velocità di sedimentazione. L'isolamento dei mitocondri viene eseguito immediatamente dopo il prelievo dei tessuti. Il tessuto viene immerso in un mezzo di omogeneizzazione ghiacciato, tritato con le forbici e omogeneizzato in un omogeneizzatore di vetro con un pestello largo. La tecnica di centrifugazione differenziale è efficiente, veloce ed economica e i mitocondri ottenuti con la centrifugazione differenziale sono sufficientemente puri per i saggi di respirometria. Alcuni dei limiti e degli svantaggi dei mitocondri isolati, basati sulla centrifugazione differenziale, sono che i mitocondri possono essere danneggiati durante la procedura di omogeneizzazione e isolamento e che per l'isolamento mitocondriale sono necessarie grandi quantità di biopsia tissutale o cellule in coltura.

Complesso I-dipendente respirazione Isolati tassi mitocondriali complessi I dipendenti delle vie respiratorie (stati 2, 3 e 4) sono determinati utilizzando ad alta risoluzione respirometria (figura 1, un diagramma rappresentante). Mitocondriali substrati del complesso I, glutammato e malato, vengono aggiunti seguiti con l&#39;aggiunta di ADP. Stato 2 si riferisce al consumo di ossigeno in pres...

Qui, un campione di muscolo quadricipite viene prelevato da un maiale anestetizzato e i mitocondri vengono isolati mediante centrifugazione differenziale. Quindi, le frequenze respiratorie dei complessi della catena respiratoria mitocondriale I, II e IV vengono determinate utilizzando la respirometria ad alta risoluzione.

L&#39;isolamento di mitocondri intatti dal muscolo scheletrico mediante centrifugazione differenziale per alta risoluzione respirometria Misure

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare i mitocondri del muscolo scheletrico mediante centrifugazione differenziale e determinare i tassi respiratori dei complessi della catena respiratoria mitocondriale I, II e IV. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della bioenergetica mitocondriale, come le malattie e i disturbi associati alla disfunzione mitocondriale, tra cui diverse patologie neurologiche, la sepsi e i disturbi legati all'età. Il principale vantaggio di questa tecnica è l'assenza della maggior parte dei fattori citologici nel preparato mitocondriale isolato, che potrebbero interferire con l'analisi delle funzioni mitocondriali. A dimostrare la procedura sarà Sandra Nansoz, la tecnica del mio laboratorio.Per iniziare questa procedura, procurarsi un becher contenente campioni di tessuto muscolare scheletrico come descritto nel protocollo testuale. Posizionare il becher su un secchiello con ghiaccio. Utilizzando forbici fini, tritare il muscolo in pezzi di dimensioni comprese tra uno e due millimetri.Successivamente, lavare il tessuto tritato due volte con tampone di isolamento freddo di ghiaccio, utilizzando 20 millilitri per ogni lavaggio. Sospendere il tessuto lavato in 10 millilitri di tampone di isolamento per grammo di tessuto, quindi aggiungere cinque milligrammi di proteasi-G tissutale. Successivamente, posizionare il becher in un bagno di ghiaccio con un agitatore magnetico e agitare per 10 minuti.In seguito, diluire la sospensione con ulteriori 10 millilitri di buffer di isolamento integrato con BSA privata di grassi allo 0,2% per grammo di tessuto. Successivamente, versare delicatamente tutto il buffer di isolamento dal becher. Lavare il tessuto due volte con buffer di isolamento freddo ghiacciato integrato con BSA allo 0,2%, utilizzando 20 millilitri per ogni lavaggio.Quindi, risospendere il tessuto in 10 millilitri di tampone di isolamento integrato con BSA per ogni grammo di tessuto. Utilizzare un omogeneizzatore in vetro semiautomatico con pestello allentato per omogeneizzare il tessuto. Successivamente, trasferire l'omogenato in una provetta per centrifuga e centrifugare a 10.000 ×g per 10 minuti a 4 °C.Utilizzando una pipetta sierologica, eliminare il soprannatante. Ri-sospendere il pellet con 10 millilitri di mezzo di isolamento freddo di ghiaccio integrato con BSA per ogni grammo di tessuto. Centrifugare la sospensione a 350 ×g per 10 minuti a quattro gradi Celsius.Successivamente, utilizzare una pipetta serologica per prelevare il soprannatante, scartando il pellet. Filtrare il soprannatante in un becher mantenuto sul ghiaccio attraverso due strati di garza. Trasferire la sospensione filtrata in un tubo da centrifuga e centrifugare a 7.000 ×g per 10 minuti a quattro gradi Celsius.Quindi eliminare il soprannatante. Ri-sospendere il pellet mitocondriale grezzo in cinque millilitri di tampone di isolamento integrato con BSA per ogni grammo di tessuto. Centrifugare questa sospensione a 7.000 ×g per 10 minuti a quattro gradi Celsius.Successivamente, eliminare il soprannatante e risospendere il pellet in 20 millilitri di buffer di lavaggio. Centrifugare a 7.000 ×g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Ripetere questo processo di risospensione e centrifugazione un'altra volta.Dopo questa fase, eliminare il soprannatante e risospendere il pellet in un millilitro di buffer di lavaggio. Determinare la concentrazione proteica utilizzando un qualsiasi metodo standard. Successivamente, mantenere la sospensione mitocondriale concentrata sul ghiaccio fino al momento dell'esecuzione dei saggi di respirometria.Per iniziare, risospendere il concentrato mitocondriale nel buffer per la respirazione fino a una concentrazione finale di 0,4 milligrammi per millilitro di proteina mitocondriale. Successivamente, aspirare il mezzo di respirazione dalla camera dell'ossigrafo calibrata con aria. Aggiungere 2,1 millilitri di sospensione mitocondriale isolata.Inserire un tappo per chiudere la camera dell'ossigrafo. Quindi, agitare continuamente la sospensione mitocondriale a 700 giri al minuto a 37 gradi Celsius. Registrare la respirazione cellulare al valore iniziale per tre-cinque minuti fino al raggiungimento di un segnale stabile di flusso di ossigeno.Per iniziare la respirazione dipendente dal complesso I, iniettare 12,5 microlitri di malato 0,8 molare in una camera dell'ossigrafo preparata con la sospensione mitocondriale isolata attraverso il porto di iniezione in titanio del tappo. Successivamente, iniettare 10 microlitri di glutammato 2 molare. Registrare la respirazione cellulare per tre-cinque minuti fino al raggiungimento di un segnale stabile di flusso di ossigeno.In seguito, iniettare 10 microlitri di ADP 0,05 molare nella camera attraverso il portello di iniezione. Registrare la respirazione cellulare fino a quando il segnale del flusso di ossigeno aumenta, poi diminuisce e si stabilizza. Per la respirazione dipendente dal complesso II, iniettare due microlitri di rotenone 0,2 millimolare in una camera ossigrafica preparata con sospensione mitocondriale isolata.Registrare la respirazione cellulare fino al raggiungimento di un segnale stabile di flusso di ossigeno. Quindi, iniettare 20 microlitri di succinato uno molare. Registrare la respirazione cellulare fino al raggiungimento di un segnale stabile di flusso di ossigeno.Dopo di ciò, iniettare 10 microlitri di ADP 0,05 molari nella camera attraverso il porto di iniezione. Registrare la respirazione cellulare fino a quando il segnale del flusso di ossigeno aumenta, poi diminuisce e si stabilizza. Per la respirazione dipendente dal complesso IV, iniettare 2,5 microlitri di ascorbato 0,8 millimolari in una camera ossigrafica preparata con sospensione mitocondriale isolata.Successivamente, iniettare immediatamente 2,5 microlitri di TMPD 0,2 M e 10 microlitri di ADP 0,05 M. Registrare la respirazione cellulare fino al raggiungimento di un segnale stabile di flusso di ossigeno. Quindi, iniettare 10 microlitri di azoturo di sodio 1 M.Registrare la respirazione cellulare fino a quando il segnale del flusso di ossigeno diminuisce, quindi si stabilizza. In questo studio, i mitocondri integri sono isolati dal muscolo scheletrico. I tassi respiratori dipendenti dal complesso I vengono quindi misurati mediante rispirometria ad alta risoluzione.Come si può osservare, la velocità della respirazione mitocondriale aumenta immediatamente dopo l'aggiunta di ADP. La velocità respiratoria diminuisce dopo l'esaurimento dell'ADP fino a livelli simili a quelli osservati prima dell'aggiunta di ADP. Ciò indica che il rapporto tra lo stato 3 e lo stato 4, noto come rapporto di controllo respiratorio o RCR, è elevato e che l'integrità mitocondriale è ben preservata durante la procedura di isolamento.I tassi respiratori dipendenti dal complesso II vengono quindi osservati inibendo la respirazione del complesso I con rotenone e aggiungendo il substrato del complesso II, il succinato. Viene quindi aggiunto ADP, determinando un immediato aumento della respirazione. Una volta esaurito l'ADP, la respirazione diminuisce fino a livelli simili a quelli osservati prima dell'aggiunta di ADP, indicando un elevato RCR, il che significa che l'integrità mitocondriale è ben preservata durante l'isolamento.I tassi di respirazione dipendenti dal complesso IV sono osservati aggiungendo ascorbato, TMPD e ADP. Viene quindi aggiunto azoturo di sodio per inibire il complesso IV. La differenza nel consumo di ossigeno prima e dopo l'aggiunta di azoturo di sodio è interpretata come la vera respirazione del complesso IV. L'elevato tasso di respirazione dipendente dal complesso IV osservato nello stato 3 indica che l'integrità mitocondriale è ben preservata durante la procedura di isolamento.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in meno di un'ora e mezza se effettuata correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di eseguire una calibrazione anticipata dei sensori di ossigeno prima dell'omogeneizzazione. Dopo questa procedura, altri metodi come la misurazione del contenuto cellulare di ADP, del potenziale di membrana mitocondriale o dell'attività enzimatica dell'ATP sintasi in funzione dei livelli di substrato possono essere effettuati per rispondere ad ulteriori domande, ad esempio se le variazioni dei tassi respiratori siano dovute alla carenza di substrato mitocondriale, al potenziale di membrana o a una ridotta attività enzimatica dell'ATP sintasi.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare i mitocondri da un muscolo scheletrico mediante centrifugazione differenziale e di come misurare i tassi respiratori dei complessi mitocondriali I, II e IV utilizzando la rispirometria ad alta risoluzione. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo del metabolismo energetico mitocondriale per esplorare la funzione energetica dei mitocondri in ambiti come le malattie mitocondriali genetiche, le miopatie e il danno da ischemia-riperfusione nei mitocondri isolati. Non dimenticare che lavorare con antimicina A, rotenone, azoturo di sodio e FCCP può essere estremamente pericoloso.E devono sempre essere adottate precauzioni come l'uso di guanti e camici da laboratorio durante l'esecuzione di questa procedura.

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Questo protocollo descrive una procedura per studiare la respirazione dei mitocondri isolati da muscolo scheletrico. Questo metodo è stato adattato da...

Isolamento dei mitocondri dal muscolo scheletrico

Un metodo rapido isolamento dei mitocondri da biopsie di tessuto mammiferi è descritto. Fegato di ratto o preparazioni muscolari scheletriche sono stati omogeneizzati con un dissociatore tessuto commerciale e mitocondri sono stati isolati per filtrazione differenziale attraverso filtri a rete di nylon. Tempo di isolamento mitocondriale è &lt;30 min rispetto ai 60 - 100 min con metodi alternativi.

Isolamento rapida e purificazione di mitocondri per il trapianto da tessuto Dissociazione e Filtrazione Differenziale

Sono descritti metodi per la biopsia di vasto laterale, la preparazione dei mitocondri purificati, e profilatura respirometrico. L'uso di piccolo volume muscolare rende questa tecnica adatta per applicazioni di ricerca clinica.

Preparazione e respirometrici valutazione dei mitocondri isolati dal tessuto muscolare scheletrico Ottenuto dalla biopsia percutanea

Qui, presentiamo una modifica di un metodo precedentemente riportato che consente l'isolamento di mitocondri purificati e di alta qualità da piccole quantità di muscolo scheletrico di topo. Questa procedura si traduce in mitocondri altamente accoppiati che respirano con elevata funzione durante i saggi respirometrici basati su micropiastre.

L&#39;isolamento di mitocondri da minime quantità di muscolo scheletrico del mouse per misurazioni High Throughput micropiastre respiratorie

I mitocondri sono organelli metabolici chiave che mostrano un alto livello di plasticità fenotipica nel muscolo scheletrico. L'importazione di proteine dal citosol è una via critica per la biogenesi degli organelli, essenziale per l'espansione del reticolo e il mantenimento della funzione mitocondriale.  Pertanto, l'importazione di proteine funge da barometro della salute cellulare.

Misurazione della capacità di importazione di proteine dei mitocondri del muscolo scheletrico

Qui, descriviamo un metodo dettagliato per l'isolamento dei mitocondri dal muscolo scheletrico del topo e la successiva analisi della respirazione mediante Oxygen Consumption Rate (OCR) utilizzando saggi respirometrici basati su micropiastre. Questa pipeline può essere applicata per studiare gli effetti di molteplici interventi ambientali o genetici sul metabolismo mitocondriale.

Isolamento dei mitocondri dal muscolo scheletrico del topo per saggi respirometrici

I cavalli hanno un'eccezionale capacità di esercizio aerobico, rendendo il muscolo scheletrico equino un tessuto importante sia per lo studio della fisiologia dell'esercizio equino che per la fisiologia mitocondriale dei mammiferi. Questo articolo descrive le tecniche per la valutazione completa della funzione mitocondriale nel muscolo scheletrico equino.

Fluoro-respirometria ad alta risoluzione del muscolo scheletrico equino

Studi bioenergetici e metabolomici sui mitocondri hanno rivelato il loro ruolo multiforme in molte malattie, ma i metodi di isolamento per questi organelli variano. Il metodo qui descritto è in grado di purificare mitocondri di alta qualità da più fonti di tessuto. La qualità è determinata dai rapporti di controllo respiratorio e da altre metriche valutate con la respirometria ad alta risoluzione.

Robusto isolamento mitocondriale dal tessuto cardiaco dei roditori 

Il micro-dissezionato tecnica espianti è un metodo robusto e affidabile per isolare proliferativa delle cellule del muscolo scheletrico da giovani, adulte o embrionali muscoli come fonte di cellule staminali del muscolo scheletrico. Unicamente, queste cellule sono state derivate clonazione per la produzione di muscolo scheletrico linee di cellule staminali utilizzate per trapianto in vivo.

Adulte e embrionali muscolo scheletrico Microexplant Cultura e isolamento di cellule staminali del muscolo scheletrico

Qui descritto è un metodo per misurare direttamente scintille di calcio, le unità elementari di Ca 2 + liberano dal reticolo sarcoplasmatico in fibre muscolari scheletriche intatte. Questo metodo utilizza osmotico stress-mediata attivazione di Ca 2 + liberazione dal recettore della rianodina nelle fibre muscolari isolate. La dinamica e la capacità omeostatica di intracellulare di Ca 2 + segnalazione possono essere utilizzati per valutare la funzione muscolare in salute e malattia.

Valutazione del calcio Sparks in intatte fibre muscolari scheletriche

Scopri come isolare mitocondri intatti dal muscolo scheletrico mediante centrifugazione differenziale e misurare le velocità respiratorie dei complessi I, II e IV tramite respirometria ad alta risoluzione.

Lisolamento di mitocondri intatti dal muscolo scheletrico mediante centrifugazione differenziale per alta risoluzione respirometria Misure (Video) | JoVE Journal

L'isolamento di mitocondri intatti dal muscolo scheletrico mediante centrifugazione differenziale per alta risoluzione respirometria Misure

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