L'isolamento di mitocondri intatti dal muscolo scheletrico mediante centrifugazione differenziale per alta risoluzione respirometria Misure

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare i mitocondri del muscolo scheletrico mediante centrifugazione differenziale e determinare le frequenze respiratorie dei complessi della catena respiratoria mitocondriale I, II e IV.Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo bioenergetico mitocondriale come malattie e sindromi associate a disfunzione mitocondriale, come diverse malattie neurologiche, sepsi e disturbi legati all'età. Il vantaggio principale di questa tecnica è l'assenza della maggior parte dei fattori citologici nella preparazione mitocondriale isolata, che possono interferire con l'analisi delle funzioni dei mitocondri. A dimostrare la procedura sarà Sandra Nansoz, il tecnico del mio laboratorio.

Per iniziare questa procedura, procurarsi un becher di campioni di muscolo scheletrico come indicato nel protocollo di testo. Posiziona il bicchiere su un secchiello per il ghiaccio. Usando le forbici sottili, trita il muscolo in pezzi di uno o due millimetri.

Quindi, sciacquare il fazzoletto tritato due volte con un tampone isolante ghiacciato utilizzando 20 millilitri per ogni lavaggio. Sospendi il tessuto lavato in 10 millilitri di tampone di isolamento per grammo di tessuto e poi aggiungi cinque milligrammi di tessuto proteasi-G. Quindi immergere il becher in un bagno di ghiaccio con un agitatore magnetico e mescolare per 10 minuti.

Successivamente, diluire la sospensione con altri 10 millilitri di tampone isolante integrato con BSA sgrassato allo 0,2% per grammo di tessuto. Quindi, decantare tutto il tampone di isolamento dal becher. Lavare il fazzoletto due volte con un tampone isolante ghiacciato integrato con 0,2% BSA utilizzando 20 millilitri per ogni lavaggio.

Quindi, risospendere il tessuto in 10 millilitri di tampone di isolamento integrato con BSA per grammo di tessuto. Utilizzare un omogeneizzatore di vetro semiautomatico con un pestello largo per omogeneizzare il tessuto. Quindi, trasferire l'omogeneizzato in una provetta da centrifugazione e centrifugare a 10.000 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius.

Utilizzando una pipetta sierologica, scartare il surnatante. Risospendere il pellet con 10 millilitri di terreno isolante integrato BSA ghiacciato per grammo di tessuto. Centrifugare la sospensione a 350 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius.

Successivamente, utilizzare una pipetta sierologica per riservare il surnatante, scartando il pellet. Filtrare il surnatante in un becher tenuto in ghiaccio attraverso due strati di garza. Trasferire la sospensione filtrata in una provetta da centrifuga e centrifugare 7.000 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius.

Quindi scartare il surnatante. Risospendere il pellet mitocondriale grezzo in cinque millilitri di tampone di isolamento integrato con BSA per grammo di tessuto. Centrifugare questa sospensione 7.000 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius.

Successivamente, scartare il surnatante e risospendere il pellet in 20 millilitri di tampone di lavaggio. Centrifugare a 7.000 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Ripetere ancora una volta il processo di risospensione e centrifugazione.

Successivamente, scartare il surnatante e risospendere il pellet in un millilitro di tampone di lavaggio. Determinare la concentrazione proteica utilizzando qualsiasi metodo standard. Quindi, mantenere la sospensione mitocondriale concentrata su ghiaccio fino al momento di eseguire i saggi di respirometria.

Per iniziare, risospendere il concentrato mitocondriale nel tampone respiratorio a una concentrazione finale di 0,4 milligrammi per millilitro di proteina mitocondriale. Quindi, aspirare il mezzo di respirazione dalla camera ossigrafica calibrata ad aria. Aggiungere 2,1 millilitri di sospensione mitocondriale isolata.

Inserire un tappo per chiudere la camera dell'ossigrafo. Quindi, mescolare continuamente la sospensione mitocondriale a 700 giri/min a 37 gradi Celsius. Registrare la respirazione cellulare al basale per tre-cinque minuti fino a raggiungere un segnale di flusso di ossigeno stabile.

Per iniziare la respirazione I-dipendente complessa, iniettare 12,5 microlitri di malato molare 0,8 in una camera ossigrafica preparata con la sospensione mitocondriale isolata attraverso la porta di iniezione in titanio del tappo. Quindi, iniettare 10 microlitri di glutammato a due molari. Registrare la respirazione cellulare per tre-cinque minuti fino a raggiungere un segnale di flusso di ossigeno stabile.

Successivamente, iniettare 10 microlitri di ADP molare da 0,05 nella camera attraverso la porta di iniezione. Registrare la respirazione cellulare fino a quando il segnale del flusso di ossigeno aumenta, quindi diminuisce e si stabilizza. Per la respirazione dipendente dal complesso II, iniettare due microlitri di rotenone 0,2 millimolare in una camera ossigrafica preparata con sospensione mitocondriale isolata.

Registrare la respirazione cellulare fino a raggiungere un segnale di flusso di ossigeno stabile. Quindi, iniettare 20 microlitri di un molare succinato. Registrare la respirazione cellulare fino a raggiungere un segnale di flusso di ossigeno stabile.

Successivamente, iniettare 10 microlitri di ADP molare da 0,05 nella camera attraverso la porta di iniezione. Registrare la respirazione cellulare fino a quando il segnale del flusso di ossigeno aumenta, quindi diminuisce e si stabilizza. Per la respirazione endovenosa complessa, iniettare 2,5 microlitri di ascorbato 0,8 millimolare in una camera ossigrafica preparata con sospensione mitocondriale isolata.

Successivamente, iniettare immediatamente 2,5 microlitri di TMPD molare 0,2 e 10 microlitri di ADP molare 0,05. Registrare la respirazione cellulare fino a raggiungere un segnale di flusso di ossigeno stabile. Quindi, iniettare 10 microlitri di azoturo di sodio molare.

Registrare la respirazione cellulare fino a quando il segnale del flusso di ossigeno non diminuisce, quindi si stabilizza. In questo studio, i mitocondri intatti sono isolati dal muscolo scheletrico. Le frequenze respiratorie I-dipendenti complesse vengono quindi misurate tramite respirometria ad alta risoluzione.

Come si può notare, la frequenza respiratoria mitocondriale aumenta immediatamente dopo l'aggiunta di ADP. La frequenza respiratoria diminuisce dopo la deplezione dell'ADP a livelli simili a quelli osservati prima dell'aggiunta di ADP. Ciò indica che il rapporto tra lo stato 3 e lo stato 4 noto come rapporto di controllo respiratorio, o RCR, è elevato e che l'integrità mitocondriale è ben preservata durante la procedura di isolamento.

Le frequenze respiratorie dipendenti dal complesso II vengono quindi osservate inibendo la respirazione del complesso I con rotenone e iniettando il succinato del substrato del complesso II. Viene quindi aggiunto l'ADP, con conseguente aumento immediato della respirazione. Una volta che l'ADP è esaurito, la respirazione diminuisce a livelli simili a quelli osservati prima dell'aggiunta di ADP, indicando un RCR elevato, in quanto l'integrità mitocondriale è ben preservata durante l'isolamento.

Le frequenze respiratorie complesse IV-dipendenti si osservano aggiungendo ascorbato, TMPD e ADP. La differenza nel consumo di ossigeno prima e dopo l'aggiunta di sodio azide viene interpretata come la vera e propria respirazione IV del complesso. L'elevata frequenza respiratoria complesso IV-dipendente osservata nello stato 3 indica che l'integrità mitocondriale è ben preservata durante la procedura di isolamento.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in meno di un'ora e mezza se eseguita correttamente. Durante il tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordarsi di eseguire una calibrazione dei sensori di ossigeno in anticipo prima dell'omogeneizzazione. Seguendo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi come la misurazione del contenuto di ADP cellulare, del potenziale di membrana mitocondriale, dell'attività enzimatica dell'ATP sintasi come livelli di substrato per rispondere a ulteriori domande, come se i cambiamenti nella frequenza respiratoria siano dovuti alla mancanza di substrato mitocondriale, al potenziale di membrana o alla ridotta attività enzimatica dell'ATP sintasi.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare i mitocondri da un muscolo scheletrico mediante centrifugazione differenziale e come misurare le frequenze respiratorie dei complessi mitocondriali I, II e IV utilizzando la respirometria ad alta risoluzione. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo del metabolismo energetico mitocondriale per esplorare la funzione energetica dei mitocondri in campi come le malattie mitocondriali genetiche, le miopatie, il danno da riperfusione ischemica nei mitocondri isolati. Non dimenticare che lavorare con l'antimicina A, il rotenone, l'azide di sodio e l'FCCP può essere estremamente pericoloso.

E precauzioni come indossare guanti e camici da laboratorio dovrebbero essere sempre prese durante l'esecuzione di questa procedura.