L'isolamento di mitocondri intatti dal muscolo scheletrico mediante centrifugazione differenziale per alta risoluzione respirometria Misure

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare i mitocondri del muscolo scheletrico mediante centrifugazione differenziale e determinare i tassi respiratori dei complessi della catena respiratoria mitocondriale I, II e IV. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della bioenergetica mitocondriale, come le malattie e i disturbi associati alla disfunzione mitocondriale, tra cui diverse patologie neurologiche, la sepsi e i disturbi legati all'età. Il principale vantaggio di questa tecnica è l'assenza della maggior parte dei fattori citologici nel preparato mitocondriale isolato, che potrebbero interferire con l'analisi delle funzioni mitocondriali. A dimostrare la procedura sarà Sandra Nansoz, la tecnica del mio laboratorio.

Per iniziare questa procedura, procurarsi un becher contenente campioni di tessuto muscolare scheletrico come descritto nel protocollo testuale. Posizionare il becher su un secchiello con ghiaccio. Utilizzando forbici fini, tritare il muscolo in pezzi di dimensioni comprese tra uno e due millimetri.

Successivamente, lavare il tessuto tritato due volte con tampone di isolamento freddo di ghiaccio, utilizzando 20 millilitri per ogni lavaggio. Sospendere il tessuto lavato in 10 millilitri di tampone di isolamento per grammo di tessuto, quindi aggiungere cinque milligrammi di proteasi-G tissutale. Successivamente, posizionare il becher in un bagno di ghiaccio con un agitatore magnetico e agitare per 10 minuti.

In seguito, diluire la sospensione con ulteriori 10 millilitri di buffer di isolamento integrato con BSA privata di grassi allo 0,2% per grammo di tessuto. Successivamente, versare delicatamente tutto il buffer di isolamento dal becher. Lavare il tessuto due volte con buffer di isolamento freddo ghiacciato integrato con BSA allo 0,2%, utilizzando 20 millilitri per ogni lavaggio.

Quindi, risospendere il tessuto in 10 millilitri di tampone di isolamento integrato con BSA per ogni grammo di tessuto. Utilizzare un omogeneizzatore in vetro semiautomatico con pestello allentato per omogeneizzare il tessuto. Successivamente, trasferire l'omogenato in una provetta per centrifuga e centrifugare a 10.000 ×g per 10 minuti a 4 °C.

Utilizzando una pipetta sierologica, eliminare il soprannatante. Ri-sospendere il pellet con 10 millilitri di mezzo di isolamento freddo di ghiaccio integrato con BSA per ogni grammo di tessuto. Centrifugare la sospensione a 350 ×g per 10 minuti a quattro gradi Celsius.

Successivamente, utilizzare una pipetta serologica per prelevare il soprannatante, scartando il pellet. Filtrare il soprannatante in un becher mantenuto sul ghiaccio attraverso due strati di garza. Trasferire la sospensione filtrata in un tubo da centrifuga e centrifugare a 7.000 ×g per 10 minuti a quattro gradi Celsius.

Quindi eliminare il soprannatante. Ri-sospendere il pellet mitocondriale grezzo in cinque millilitri di tampone di isolamento integrato con BSA per ogni grammo di tessuto. Centrifugare questa sospensione a 7.000 ×g per 10 minuti a quattro gradi Celsius.

Successivamente, eliminare il soprannatante e risospendere il pellet in 20 millilitri di buffer di lavaggio. Centrifugare a 7.000 ×g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Ripetere questo processo di risospensione e centrifugazione un'altra volta.

Dopo questa fase, eliminare il soprannatante e risospendere il pellet in un millilitro di buffer di lavaggio. Determinare la concentrazione proteica utilizzando un qualsiasi metodo standard. Successivamente, mantenere la sospensione mitocondriale concentrata sul ghiaccio fino al momento dell'esecuzione dei saggi di respirometria.

Per iniziare, risospendere il concentrato mitocondriale nel buffer per la respirazione fino a una concentrazione finale di 0,4 milligrammi per millilitro di proteina mitocondriale. Successivamente, aspirare il mezzo di respirazione dalla camera dell'ossigrafo calibrata con aria. Aggiungere 2,1 millilitri di sospensione mitocondriale isolata.

Inserire un tappo per chiudere la camera dell'ossigrafo. Quindi, agitare continuamente la sospensione mitocondriale a 700 giri al minuto a 37 gradi Celsius. Registrare la respirazione cellulare al valore iniziale per tre-cinque minuti fino al raggiungimento di un segnale stabile di flusso di ossigeno.

Per iniziare la respirazione dipendente dal complesso I, iniettare 12,5 microlitri di malato 0,8 molare in una camera dell'ossigrafo preparata con la sospensione mitocondriale isolata attraverso il porto di iniezione in titanio del tappo. Successivamente, iniettare 10 microlitri di glutammato 2 molare. Registrare la respirazione cellulare per tre-cinque minuti fino al raggiungimento di un segnale stabile di flusso di ossigeno.

In seguito, iniettare 10 microlitri di ADP 0,05 molare nella camera attraverso il portello di iniezione. Registrare la respirazione cellulare fino a quando il segnale del flusso di ossigeno aumenta, poi diminuisce e si stabilizza. Per la respirazione dipendente dal complesso II, iniettare due microlitri di rotenone 0,2 millimolare in una camera ossigrafica preparata con sospensione mitocondriale isolata.

Registrare la respirazione cellulare fino al raggiungimento di un segnale stabile di flusso di ossigeno. Quindi, iniettare 20 microlitri di succinato uno molare. Registrare la respirazione cellulare fino al raggiungimento di un segnale stabile di flusso di ossigeno.

Dopo di ciò, iniettare 10 microlitri di ADP 0,05 molari nella camera attraverso il porto di iniezione. Registrare la respirazione cellulare fino a quando il segnale del flusso di ossigeno aumenta, poi diminuisce e si stabilizza. Per la respirazione dipendente dal complesso IV, iniettare 2,5 microlitri di ascorbato 0,8 millimolari in una camera ossigrafica preparata con sospensione mitocondriale isolata.

Successivamente, iniettare immediatamente 2,5 microlitri di TMPD 0,2 M e 10 microlitri di ADP 0,05 M. Registrare la respirazione cellulare fino al raggiungimento di un segnale stabile di flusso di ossigeno. Quindi, iniettare 10 microlitri di azoturo di sodio 1 M.

Registrare la respirazione cellulare fino a quando il segnale del flusso di ossigeno diminuisce, quindi si stabilizza. In questo studio, i mitocondri integri sono isolati dal muscolo scheletrico. I tassi respiratori dipendenti dal complesso I vengono quindi misurati mediante rispirometria ad alta risoluzione.

Come si può osservare, la velocità della respirazione mitocondriale aumenta immediatamente dopo l'aggiunta di ADP. La velocità respiratoria diminuisce dopo l'esaurimento dell'ADP fino a livelli simili a quelli osservati prima dell'aggiunta di ADP. Ciò indica che il rapporto tra lo stato 3 e lo stato 4, noto come rapporto di controllo respiratorio o RCR, è elevato e che l'integrità mitocondriale è ben preservata durante la procedura di isolamento.

I tassi respiratori dipendenti dal complesso II vengono quindi osservati inibendo la respirazione del complesso I con rotenone e aggiungendo il substrato del complesso II, il succinato. Viene quindi aggiunto ADP, determinando un immediato aumento della respirazione. Una volta esaurito l'ADP, la respirazione diminuisce fino a livelli simili a quelli osservati prima dell'aggiunta di ADP, indicando un elevato RCR, il che significa che l'integrità mitocondriale è ben preservata durante l'isolamento.

I tassi di respirazione dipendenti dal complesso IV sono osservati aggiungendo ascorbato, TMPD e ADP. Viene quindi aggiunto azoturo di sodio per inibire il complesso IV. La differenza nel consumo di ossigeno prima e dopo l'aggiunta di azoturo di sodio è interpretata come la vera respirazione del complesso IV. L'elevato tasso di respirazione dipendente dal complesso IV osservato nello stato 3 indica che l'integrità mitocondriale è ben preservata durante la procedura di isolamento.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in meno di un'ora e mezza se effettuata correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di eseguire una calibrazione anticipata dei sensori di ossigeno prima dell'omogeneizzazione. Dopo questa procedura, altri metodi come la misurazione del contenuto cellulare di ADP, del potenziale di membrana mitocondriale o dell'attività enzimatica dell'ATP sintasi in funzione dei livelli di substrato possono essere effettuati per rispondere ad ulteriori domande, ad esempio se le variazioni dei tassi respiratori siano dovute alla carenza di substrato mitocondriale, al potenziale di membrana o a una ridotta attività enzimatica dell'ATP sintasi.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare i mitocondri da un muscolo scheletrico mediante centrifugazione differenziale e di come misurare i tassi respiratori dei complessi mitocondriali I, II e IV utilizzando la rispirometria ad alta risoluzione. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo del metabolismo energetico mitocondriale per esplorare la funzione energetica dei mitocondri in ambiti come le malattie mitocondriali genetiche, le miopatie e il danno da ischemia-riperfusione nei mitocondri isolati. Non dimenticare che lavorare con antimicina A, rotenone, azoturo di sodio e FCCP può essere estremamente pericoloso.

E devono sempre essere adottate precauzioni come l'uso di guanti e camici da laboratorio durante l'esecuzione di questa procedura.