Sublimazione di DAN Matrix per la rilevazione e visualizzazione dei gangliosidi nel cervello di ratto Tissue per MALDI Imaging Mass Spectrometry

L'obiettivo generale di questo protocollo di sublimazione è quello di fornire un processo di preparazione del campione dettagliato e facile da seguire, per la rilevazione dei gangliosidi negli esperimenti di spettrometria di massa con imaging MALDI. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della neurobiologia, tra cui la distribuzione anatomica e la funzione dei gangliosidi, sia nel cervello sano che nella patologia cerebrale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può essere adattata per l'imaging di alta qualità di molte specie lipidiche, poche alterazioni del protocollo.

Per iniziare questa procedura, estrarre il tessuto cerebrale dal ratto e prepararsi al criostato come descritto nel protocollo di testo. Quindi posizionare il tessuto nel criostato. Sezionare il tessuto fino alla posizione anatomica desiderata.

Assicurarsi che lo spessore di taglio sia compreso tra otto e 12 micron. Utilizzando la barra antirollio del criostato, sezionare lentamente la sezione di tessuto appiattita. Possono verificarsi fori o segni sul tessuto se il posizionamento della roll bar non è corretto o se la lama è smussata.

Spostare il fazzoletto al centro della piattaforma di affettatura utilizzando pennelli puliti. Per mappare il tessuto, congelare i vetrini conduttivi o le piastre metalliche posizionandoli nel criostato durante l'affettatura. Quando il vetrino è completamente congelato, spostare con cautela il tessuto della sezione sul supporto conduttivo del vetrino utilizzando pennelli puliti.

Una volta che tutte le sezioni di tessuto sono posizionate correttamente sul vetrino, posizionare un dito sotto il vetrino di fronte al tessuto e premere fino a quando la sezione non si scongela. Quindi posizionare i vetrini con il fazzoletto in un essiccatore per cinque-10 minuti. In alternativa, utilizzare un vetrino caldo e premerlo leggermente, con il lato conduttivo rivolto verso il basso, contro le sezioni di tessuto appiattite.

Lavorando nella cappa aspirante, posizionare un bagno di sabbia in un contenitore di alluminio su una piastra riscaldante. La piastra riscaldante deve essere posizionata su un sollevatore a forbice in metallo della superficie appropriata. Accendi la piastra e imposta la temperatura a 140 gradi Celsius.

Utilizzare la sonda di feedback della temperatura per monitorare la temperatura della sabbia durante l'esperimento e garantire la costanza della temperatura. Quindi, posizionare 300 milligrammi di matrice DAN sulla superficie inferiore dell'apparecchio di sublimazione. Stendere la matrice in uno strato uniforme al centro dell'apparecchio fino alla larghezza e alla lunghezza approssimative del vetrino da sublimare.

Posizionare una piastra metallica sulla superficie interna dell'apparecchio con la piastra che entra in contatto diretto con il fondo del condensatore. Fissare con nastro adesivo un vetrino di prova bianco che attraversa diagonalmente la superficie della piastra metallica, con un nastro adesivo posizionato sui bordi esterni del vetrino. Collegare le parti superiore e inferiore dell'apparecchio con un O-ring di gomma al centro per garantire una tenuta completa.

Posizionare un giunto a U metallico attorno al centro dell'apparecchio e serrare le morse fino a quando la metà superiore e inferiore dell'apparecchio non sono sigillate ermeticamente insieme. Quindi posizionare l'apparecchio nell'O-ring metallico attorno al bagno di sabbia. Quindi, metti una manciata di ghiaccio tritato nel condensatore.

Riempire il condensatore da un quarto a metà con acqua fredda per creare una fanghiglia di ghiaccio. La fanghiglia di ghiaccio raffredderà la piastra metallica all'interno dell'apparecchio e successivamente il vetrino vi aderiva . Attendere almeno cinque minuti affinché la temperatura raggiunga uno stato stabile.

Quindi, versare 300 ml di metanolo nel contenitore della trappola fredda e posizionare la vetreria nel contenitore. Collegare la pompa del vuoto all'uscita della trappola fredda utilizzando un tubo di gomma. Utilizzare un altro pezzo di tubo di gomma per collegare l'ingresso della trappola fredda all'apparecchio di sublimazione.

Assicurarsi che il tubo sia fissato saldamente utilizzando morsetti metallici. Utilizzare la pompa del vuoto per erogare un vuoto da 30 a 50 millitorr. Lasciare in funzione le pompe per almeno cinque minuti per l'equilibrio della pressione.

Versare due o tre piccoli pezzi di ghiaccio secco nell'etanolo, sul fondo del contenitore della trappola fredda. La trappola fredda aiuta a prevenire l'accumulo di particelle di matrice nella pompa del vuoto. Potrebbe essere necessario serrare le morse sull'anello a U dell'apparecchio di sublimazione una volta accesa la pompa del vuoto a causa della diminuzione della pressione nell'apparecchio.

Assicurarsi che la temperatura del bagno di sabbia si sia stabilizzata a 140 gradi Celsius. Verificare inoltre che l'aspirapolvere sia attivo e che l'apparecchio sia fissato nell'O-ring metallico sopra il bagno di sabbia con tutti i tubi collegati. Impostare il timer per sette minuti ma non avviarlo.

Sollevare lentamente l'ascensore a forbice e il bagno di sabbia fino all'apparecchio di sublimazione fino a quando il giunto a U del sublimatore non si trova ben al di sopra dell'O-ring metallico. Questo spazio extra consente la regolazione dell'apparecchio sulla sabbia. Premere rapidamente il sublimatore delicatamente sulla superficie della sabbia per assicurarsi che l'apparecchio sia posizionato uniformemente sulla sabbia.

E poi, avvia immediatamente il timer. Quando suona il timer, spegnere la pompa del vuoto e abbassare con cautela l'ascensore a forbice fino a quando il sublimatore non tocca più il bagno di sabbia e si trova saldamente nell'O-ring metallico. Allentare lentamente la valvola di sfiato per rilasciare la pressione nell'apparecchio.

Allentare il metallo clamp attorno al tubo di gomma dell'apparecchio di sublimazione e iniziare lentamente ad allentare il tubo. Una volta che il tubo di gomma è stato leggermente allentato, piegare il tubo da un lato per consentire la fuoriuscita della pressione residua. Quando la pressione ambiente ritorna, rimuovere con cautela il tubo di gomma dall'apparecchio di sublimazione.

Quindi, allentare le morse sul giunto a U dell'apparecchio e rimuoverle. Separare con cura le due metà dell'apparecchio di sublimazione ed estrarre il vetrino dalla parte superiore della vetreria interna. Esaminare il vetrino per confermare la distribuzione uniforme della matrice.

Se la distribuzione e la quantità di matrice sublimata sono sufficienti, fissare un nuovo vetrino con tessuto all'interno del sublimatore e ripetere il processo di sublimazione. Procedere con l'esecuzione dell'imaging e dell'analisi come descritto nel protocollo di testo. Lo spettro di massa mostra l'abbondanza ionica di anoliti in un intervallo di massa compreso tra 1000 e 2000.

I principali gangliosidi della serie A sono etichettati lungo lo spettro. Qui è mostrata l'immagine molecolare corrispondente dei gangliosidi nel cervello di ratto. L'immagine molecolare mostra la distribuzione anatomica di diverse specie di gangliosidi attraverso la codifica a colori, che sono state sovrapposte e pseudocolorate utilizzando il software ImageJ.

In generale, le persone che non conoscono questo metodo possono avere difficoltà, poiché ci sono molte variabili nel processo di preparazione del campione che possono influenzare la qualità dei risultati IMS che spesso vengono tralasciate dai protocolli riportati. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di monitorare la quantità di matrice che viene sublimata dopo ogni esperimento e modificare di conseguenza il tempo di sublimazione per il vetrino. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori per esplorare il ruolo dei lipidi di membrana come i gangliosidi, dopo le lesioni cerebrali, la malattia di ner-jone e il naturale processo di invecchiamento.

Questo metodo può fornire informazioni sull'abbondanza e la distribuzione anatomica dei lipidi nel cervello, può anche essere applicato ad altri sistemi, compresi i tessuti al di fuori del cervello e persino modelli di piante e insetti. Lavorare con radici danneggiate può essere estremamente pericoloso e quando si esegue questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come guanti, maschere e protezione per gli occhi.