Name: Sublimazione di DAN Matrix per la rilevazione e visualizzazione dei gangliosidi nel cervello di ratto Tissue per MALDI Imaging Mass Spectrometry (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: Scopri il protocollo di sublimazione con matrice DAN per la rilevazione dei gangliosidi nel tessuto cerebrale di ratto mediante MALDI Imaging Mass Spectrometry. Questo metodo consente imaging di alta qualità delle distribuzioni lipidiche.

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Vorremmo ringraziare l'assistenza tecnica di Kristina Jurcic nella struttura MALDI MS dell'Università dell'Ontario Occidentale, così come il National Sciences and Engineering Council (NSERC) per aver finanziato questo lavoro. Gli autori ringraziano anche il gruppo Caprioli (Vanderbilt University, TN) e il gruppo Chaurand (Université de Montreal, QC) per i loro consigli nell'ottimizzazione della tecnica di sublimazione presentata in questo manoscritto.

Tutte le procedure di gestione degli animali descritti di seguito aderire alla University of comitato cura degli animali del Western Ontario (2016-014). 1. Preparazione del tessuto e sezionamento <ol><li> Estratto tessuto cerebrale di ratto attraverso un processo noto come &quot;Fresh congelati estrazione&quot; (FFE). <ol><li> Euthanize il topo con una dose eccessiva di sodio pentobarbital e monitorare riflessi negli arti. Una volta che tutti i riflessi hanno cessato, recidere il capo del ratto usando una ghigliottina. </li><li> Attenzione separare i muscoli e altri tessuti dal cranio con un bisturi. Utilizzare pinze osso-taglio per rompere il cranio per esporre il cervello, partendo dalla base del cranio (occipitale) alla porzione anteriore. </li><li> Una volta che il cervello è esposto, scoop accuratamente fuori con una spatola chirurgica e collocare immediatamente in ghiaccio secco schiacciato per congelamento flash. NOTA: Il cervello sarà molto malleabile. Pertanto, prestare la massima attenzione quando si posiziona il cervello sughiaccio secco. Se il cervello è schiacciato o premuto contro una superficie, altera la sua forma e congelare in quella posizione. </li></ol></li><li> Rimuovere il tessuto fresco congelato (non perfusi con formaldeide o incorporato in OCT) da - 80 ° C freezer e luogo in ghiaccio secco. </li><li> Mettere alcune gocce di acqua su un supporto criostato e posto su entrambi ghiaccio secco o la barra di congelamento criostato. Premere il tessuto leggermente sul supporto criostato come si comincia a congelare e tenere premuto fino a quando l&#39;acqua gela intorno alla base del tessuto ed ancora in posizione. Aggiungere acqua supplementare per fissare ulteriormente il tessuto sul supporto se necessario. NOTA: dell&#39;acqua invece dell&#39;OCT mezzi per il tessuto di montaggio al fine di evitare la contaminazione del tessuto con composti che possono influenzare il rilevamento del segnale desiderato. </li><li> tessuti posizione nel criostato. tessuto Sezione fino alla posizione anatomica desiderata. Assicurarsi che lo spessore di taglio è compresa tra 8-12 micron. NOTA: quando sezionare il tessuto in criostato comunaledispositivi, è imperativo che i materiali separati come lame, spazzole, barre antirollio, e titolari essere utilizzati al fine di evitare la contaminazione con l&#39;incorporamento composti. L&#39;interno del criostato deve essere pulito anche accuratamente con etanolo prima dell&#39;uso. </li><li> Utilizzando la barra antirollio criostato, lentamente sezione appiattita sezioni di tessuto. Fori o segni sul tessuto può verificarsi se il posizionamento roll bar non è corretto o lama è ottuso. Spostare il tessuto verso il centro di affettare piattaforma usando pennelli puliti. </li><li> Montaggio <ol><li> Congelare diapositive conduttive o piastre di metallo inserendoli nel criostato mentre affettare. Quando la slitta è completamente congelato, spostare accuratamente il tessuto sezionato sulla superficie conduttiva del vetrino utilizzando pennelli puliti. Una volta che tutte le sezioni di tessuto sono posizionati correttamente sul vetrino, mettere un dito sotto il vetrino, di fronte al tessuto, e premere fino a quando la sezione si scioglie. NOTA: Le sezioni possono piegare o arricciare durante il processo di scongelamento quandoUtilizzando questo metodo di montaggio. Questo può essere ridotto mantenendo la slitta nella criostato quando scongelamento del tessuto. Se questi problemi diventano problematici, in alternativa, warm-mount metodo è elencato di seguito. </li><li> In alternativa, prendere una temperatura ambiente di indio-stagno Oxide (ITO) slitta (o piastra di metallo) e premere leggermente verso il basso sezione di tessuto congelato sulla superficie della piattaforma affettare, lato conduttivo verso il basso. Questo porterà alla scongelamento sezione di tessuto in modo uniforme sulla superficie del vetrino con poco arricciatura o ripiegamento del tessuto. NOTA: La condensa può apparire sotto la sezione per il montaggio si utilizza questo metodo, che possono portare alla perdita di alcune proteine ​​e lipidi. </li></ol></li><li> Collocare i vetrini con il tessuto in un essiccatore per 5 - 10 minuti. </li></ol> 2. sublimatore Apparato Set-up NOTA: Effettuare queste operazioni in una cappa aspirante. <ol><li> Inserire un bagno di sabbia in un contenitore di alluminio su una piastra calda, con la piastra su un elevatore di metallo forbicedi un&#39;adeguata superficie (cioè maggiore della piastra). Accendere la piastra calda e impostare la temperatura a 140 ° C. NOTA: Il punto di fusione per matrice DAN è compresa tra 187-190 ° C. Non superare questa temperatura sulla piastra. <ol><li> Se la piastra è dotata di una sonda di retroazione di temperatura, utilizzarlo per monitorare la temperatura della sabbia tutto l&#39;esperimento e garantire la coerenza della temperatura. Questa caratteristica può aiutare con l&#39;esperimento riproducibilità attraverso vari esperimenti di sublimazione. NOTA: Il bagno di sabbia deve essere contenuta all&#39;interno di un contenitore di alluminio come un contenitore di vetro possono rompersi a temperature elevate. </li></ol></li><li> Mettere 300 mg di matrice DAN sulla superficie inferiore dell&#39;apparecchio sublimazione. Posizionare la matrice al centro dell&#39;apparato e sparsi in uno strato uniforme nella larghezza approssimativa e la lunghezza della slitta essendo sublimata. ATTENZIONE: matrix DAN è tossico. Pertanto, è importante indossare guanti, maschere, e sicurezzaocchiali di protezione in ogni momento durante la manipolazione della matrice in polvere. DAN deve essere conservato al buio in quanto è sensibile alla luce. </li><li> Nastro una piastra di metallo sulla superficie interna dell&#39;apparecchio con la piastra di entrare in contatto diretto con la parte inferiore del condensatore al fine di garantire una distribuzione uniforme di raffreddare tutta la superficie del vetrino durante sublimazione temperatura. In alternativa, la sabbia sul fondo del condensatore al fine di garantire una superficie piana. <ol><li> Posizionare il nastro lungo i bordi esterni della piastra e aderire ai lati del vetro interno. Se il nastro viene posizionato sotto la piastra e aderisce al fondo della superficie di vetro interna, la distribuzione della temperatura non può essere uniforme e può causare distribuzione matrice uniforme su tutta la superficie del vetrino. </li><li> Nastro uno spazio (test) scivolare diagonalmente attraverso la superficie della piastra metallica con il nastro nuovo posto sui bordi esterni della slitta. </li></ol></li><li> Collegare le porzioni superiore e inferiore dell&#39;apparecchiatura, with un O-ring in gomma nel mezzo per garantire una tenuta completa. </li><li> Inserire un metallo giunto cardanico attorno al centro dell&#39;apparato e serrare vizi fino alla metà superiore e inferiore dell&#39;apparecchiatura sono sigillati ermeticamente insieme. Mettere in O-ring di metallo sopra il bagno di sabbia. </li><li> Prendete una manciata di ghiaccio tritato e metterlo nel condensatore. Riempire condensatore ¼ a ½ con acqua fredda per creare granita di ghiaccio. La fanghiglia ghiaccio raffreddare la piastra metallica all&#39;interno dell&#39;apparecchio e successivamente il vetrino aderito ad esso. Attendere almeno 5 minuti per la temperatura di raggiungere uno stato stazionario. </li><li> Versare 300 mL di etanolo nel contenitore trappola fredda e posizionare il vetro nel contenitore. Goccia 2 - 3 piccoli pezzi di ghiaccio secco in etanolo nel fondo del contenitore trappola fredda. L&#39;ingresso trappola fredda ha un tubo di vetro in esecuzione al fondo del cilindro, mentre l&#39;uscita no. </li><li> Collegare la pompa del vuoto al freddo uscita trappola utilizzando tubi in gomma. Utilizzare un altro pezzo di gommatubo per collegare l&#39;ingresso trappola fredda all&#39;apparato sublimazione. Assicurarsi che il tubo sia ben fissato con fascette metalliche, se disponibile. </li><li> Utilizzare la pompa a vuoto per fornire un vuoto di 30 - 50 mt. Lasciare che la pompa di funzionare per almeno 5 minuti per il raggiungimento dell&#39;equilibrio di pressione. Morse su U-ring di apparecchi sublimazione possono essere serrati nuovamente dopo la pompa da vuoto viene attivato a causa della riduzione della pressione nell&#39;apparecchiatura. NOTA: Si raccomanda che un vacuometro essere collegato alla pompa per monitorare la pressione di vuoto durante l&#39;esperimento e testare perdite in pressione al fine di ottenere la massima riproducibilità possibile tra esperimenti. Tuttavia, la maggior parte delle pompe sono progettati per mantenere una pressione costante, quindi l&#39;indicatore non sia essenziale per gli utenti esperti. Inoltre, il grasso guarnizione di vuoto può essere utilizzato per aiutare a mantenere la pressione di vuoto. </li></ol> 3. sublimazione <ol><li> Assicurarsi che la temperatura del bagno di sabbia ha stabilzata a 140 ° C e che l&#39;apparecchio sia fissato nella O-ring di metallo sopra il bagno di sabbia con tutti i tubi collegati e il vuoto acceso. </li><li> Impostare il timer per 7 minuti ma non avviare il timer. Lentamente sollevare la forbice e sabbia vasca fino all&#39;apparato sublimazione finché il giunto a U del sublimatore è ben sopra l&#39;O-ring di metallo. Questo spazio permette di regolare l&#39;apparecchio sulla sabbia. <ol><li> Premere rapidamente il sublimatore delicatamente sulla superficie di sabbia per assicurare che l&#39;apparecchio è seduto uniformemente sulla sabbia, e quindi iniziare immediatamente il timer. </li></ol></li><li> Quando il timer suona, spegnere la pompa del vuoto e con attenzione abbassare il sollevatore a forbice fino alla sublimatore non è a contatto con il bagno di sabbia ed è seduto saldamente l&#39;O-ring in metallo. <ol><li> Lentamente allentare la valvola di micro-sfogo per scaricare la pressione nell&#39;apparato. Allentare la fascetta metallica attorno al tubo di gomma dell&#39;apparato sublimazione e lentamente cominciano ad allentare il tubo. Una volta che il rutubo bBER è stato allentato un po &#39;, piegare il tubo da un lato per consentire pressione residua di fuoriuscire. </li><li> Quando ritorna a pressione ambiente, rimuovere con attenzione il tubo di gomma dall&#39;apparato sublimazione. </li></ol></li><li> Allentare i vizi sul giunto cardanico dell&#39;apparecchiatura e rimuovere. separare con cautela le due metà dell&#39;apparato sublimazione ed estrarre il vetrino dalla parte superiore del vetro interno. Esaminare scivolo per confermare una distribuzione uniforme della matrice. NOTA: Se matrice è irregolare, la matrice in polvere in fondo alla sublimatore può essere riposizionato o dell&#39;apparato sublimatore può essere riposizionata nella sabbia per la diapositiva successiva. Il processo di sublimazione può essere ripetuto più volte usando la stessa matrice, tuttavia, la matrice finirà per diventare più scura da calore ripetuta e la quantità di polvere diminuirà tale che il tempo sublimazione dovrà essere lievemente modificate per compensare. Per questa ragione, è importante controllare la quantità di matrice being sublimato dopo ogni esperimento per garantire la coerenza nella deposizione di matrice tra le diapositive </li><li> Se la distribuzione e la quantità di matrice sublimato è sufficiente, il nastro una nuova diapositiva con il tessuto sulla parte interna del sublimatore e ripetere Sezione 3. NOTA: Per controllo di qualità (QC) scopi, la quantità di matrice sublimato può essere misurata dopo ogni esperimento pesando il vetrino prima e dopo sublimazione e dividendo il peso di matrice sublimato con la superficie del vetrino 2, va notato che a causa della mancanza di precisione della maggior parte delle scale oltre 4 punti decimali e la variabilità tra le scale, queste misure dovrebbero essere essere utilizzato solo una guida per la deposizione ottimale della matrice piuttosto che un mezzo completamente quantificabili di controllo di qualità a meno che non si utilizzi un equilibrio di alta precisione (si veda la Figura 3). </li></ol> 4. tessuto di stoccaggio / reidratazione <ol><li> Dopo sublimazione, negozio scivola in un contenitore sigillato o piccola cassette in sacchetto di plastica sigillato. </li><li> Incubare i vetrini a -20 ° C freezer per 2 ore o durante la notte. NOTA: L&#39;obiettivo del processo di congelamento è di agire come una fase di reidratazione per il desorbimento di materiali tessuti nella matrice. Il processo di congelamento è stato anche dimostrato di prevenire il degrado dei segnali di lipidi per fino a 1 settimana, se conservato a -80 ° C 12. Per questo motivo, la quantità di tempo i campioni vengono conservati nel congelatore può essere variato in una certa misura per soddisfare le esigenze dello sperimentatore senza alterare significativamente rilevazione del segnale (come osservato nel nostro laboratorio). Tuttavia, abbiamo notato un po &#39;di scolorimento della matrice quando i campioni sono congelati per più di 24 ore a -20 ° C. Così, si consiglia l&#39;imaging del tessuto sublimato prima di quel momento o conservare il tessuto a -80 ° C per periodi di incubazione più lunghi. </li><li> Estrarre i vetrini dal congelatore (e contenitore) e posto in un essiccatore per 5 - 10 minuti. </li></ol> 5. Imaging e AANALISI <ol><li> Estrarre i vetrini da essiccatore e applicare standard strumento per garantire l&#39;accuratezza di massa dello strumento MALDI durante l&#39;imaging. Il tipo di standard varierà secondo strumentazione. Gli standard sono generalmente applicati in modo uniforme su tutta scorrevole, tessuto circostante per essere ripreso (Figura 3D). </li><li> Inserisci diapositiva in strumento MALDI e seguire le istruzioni del produttore per esperimenti di imaging (metodi strumento dovrebbe essere ottimizzati per una 1.000 - 2.000 range di massa). Risultato rappresentativo (figura 4) è stata acquisita in modalità negativa reflectron con un raster 70 micron e 20 colpi / spettro (acquisizione in tempo ~ 2 h). </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Dettagli Questo lavoro un protocollo standardizzato di matrice sublimazione sul tessuto per la rilevazione di lipidi carichi negativamente, come gangliosidi, in esperimenti MALDI IMS. Preparazione del campione per MALDI IMS è altamente variabile e deve essere personalizzato per soddisfare le proprietà uniche del analita di interesse. L&#39;applicazione della matrice sulla superficie del campione di tessuto è un aspetto cruciale del processo di preparazione del campione per quanto riguarda la qualità dei risultati in IMS...

Matrix-Assisted Laser desorbimento / ionizzazione (MALDI) Imaging Mass Spectrometry (IMS) sta diventando una tecnica molto ricercato per la visualizzazione della distribuzione spaziale dei lipidi, peptidi e proteine ​​su superfici campione intatte. MALDI IMS era precedentemente conosciuto come una tecnica analitica per analiti pre-purificato, ma negli ultimi anni, ha attirato l&#39;attenzione in molte altre discipline causa della capacità di combinare la precisione della spettrometria di massa ad alta risoluzione punti di riferimento anatomici / visivi senza bisogno di alcuna etichettatura esterna. Come la piscina scientifica dei ricercatori che utilizzano questa tecnica continua a crescere, vi è una maggiore necessità di standardizzati, protocolli facili da seguire per assistere nello sviluppo e ottimizzazione di esperimenti IMS. I gangliosidi, un gruppo di lipidi di membrana altamente abbondanti nel sistema nervoso centrale, sono ideali per esperimenti MALDI IMS come loro ubicazione, incorporato all&#39;interno della membrana, rende certi species impossibile da rilevare con i convenzionali Immuno-etichettatura. Inoltre, abbiamo dimostrato, utilizzando MALDI IMS, che questi lipidi, che funzionano come modulatori di segnalazione cellulare, tra le altre cose, hanno modelli di distribuzione anatomica unici nel cervello dei roditori sani che vengono modificate dopo lesione cerebrale 3, 4, 5. I gangliosidi sono situati in un range di massa più elevata rispetto alla maggior parte delle specie di lipidi, e sono quindi più adatto alla piattaforma di imaging MALDI. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55254/55254fig1.jpg" /> Figura 1: Flusso di lavoro di MALDI IMS Experiment. Diagramma dello schema generale di un esperimento MALDI IMS tramite sublimazione. Tessuti congelati a -80 ° C è sezionato in un criostato e 10 sezioni micron sono disgelo montato su vetrini ITO conduttivo. Il vetrino viene quindi posto in un essiccatore fino sublimazione. Slides sono inseriti nell&#39;apparecchiatura sublimazione e uno strato uniforme di matrice viene applicata alla superficie del campione di tessuto. I campioni sono congelati durante la notte in un congelatore C -20 ° poi messo in essiccatore per 10 minuti. Una volta applicate norme, i campioni vengono inseriti nello strumento MALDI cui un laser è diretto attraverso il tessuto causando molecole desorbiti nella matrice a ionizzare. Gli ioni viaggiano lungo un tubo di volo e separati in base alla loro massa (tempo di volo / TOF) fino a raggiungere il rilevatore. Le informazioni sulla abbondanza ionica di analiti in un intervallo predeterminato di massa-carica (m / z) viene visualizzata come sia un&#39;immagine molecolare e spettro di massa. Questi dati possono essere utilizzati sia per visualizzare e quantificare l&#39;abbondanza ionica dell&#39;analita di interesse all&#39;interno del tessuto con immagini stampate. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55254/55254fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> preparazione del campioneper MALDI IMS è molto variabile in ogni fase del processo deve essere personalizzato per gli analiti di interesse. La caratteristica distintiva di esperimenti MALDI-base è l&#39;uso di un rivestimento a matrice depositata sulla superficie del campione prima dell&#39;analisi. Oltre al ruolo di assorbire e trasferire energia di radiazione dal laser durante il processo di ablazione, la matrice serve anche ad isolare vari analiti dal campione, facilitando così l&#39;analisi di composti di interesse 6, 7. applicazione omogenea della matrice alla superficie del campione è il passo più importante nel processo di preparazione del campione. Deposizione di matrice non corretta può portare a grandi formazioni eterogenee cristallo matrice e lo sviluppo di artefatti, ionico segnale basso, e scarsa riproducibilità 7. A causa della affinità di alcune matrici per isolare analiti specifici, il tipo di matrice selezionata per un esperimento puòalterare in modo significativo l&#39;esito. Le matrici utilizzate per l&#39;imaging di proteine ​​e peptidi spesso differiscono da quelli utilizzati per i lipidi di imaging e il processo è ulteriormente complicata dalla necessità di procedure aggiuntive come lavaggio e reidratazione passaggi per rilevare correttamente i segnali dal tessuto. Sebbene esistano fasi di lavaggio per la valorizzazione dei segnali lipidi 8, non sono un prerequisito per la rilevazione della maggior parte delle specie di lipidi. Quando si seleziona una matrice per un esperimento di imaging lipidi, è importante considerare la polarità del lipide di interesse come questo restringere la gamma di matrici adatte. Ad esempio, gangliosidi contengono residui di acido sialico che conferiscono loro una polarità negativa complessiva. Ci sono una serie di matrici che possono efficacemente desorbire e ionizzare gangliosidi dal tessuto; Tuttavia, fattori come picchi matrice derivata nello spettro e stabilità della matrice sotto vuoto devono essere presi in considerazione. 1,5-diaminonapthalene (DAN matrice) è sufficientemente stabile in condizioni di vuoto strumento per la maggior parte delle applicazioni di imaging e ha dimostrato un alto grado di sensibilità per lipidi desorbimento e può essere utilizzato per l&#39;analisi dei lipidi in entrambe le modalità di ioni positivi e negativi 2. matrix DAN, rispetto ad altre matrici negative lipidico affinità come acido diidrossibenzoico (DHB), 9-aminoacridine (9-AA), e 5-cloro-2-mercaptobenzotiazolo (CMBT), era in grado di desorbire più efficiente gangliosidi di cervello di ratto tessuto in modalità ioni negativi (manoscritto in preparazione). Selezione del metodo appropriato di deposizione di matrice è di uguale importanza alla selezione matrice stessa. Wet metodi di deposizione di matrice in cui la matrice solida viene disciolto in un solvente organico, e depositato dal pneumatico o spruzzatori o spotters automatizzate, sono particolarmente efficaci per il desorbimento di proteine ​​e peptidi come liquido permea il campione per consentire supplementarection di composti e co-cristallizzazione con la matrice. Sebbene queste tecniche possono essere usate anche per applicazioni lipidici, analita delocalizzazione e formazioni cristalline matrice irregolare sono fenomeni comuni a causa della grande abbondanza e la solubilità dei lipidi in solventi, particolarmente nel tessuto 2, 9. Poiché i lipidi sono facilmente ionizzati dal tessuto, secco tecniche di deposizione di matrice, come sublimazione, offrono una semplice, economica alternativa alla irroratrici che aggirano molti lo svantaggio di queste tecniche. Il successo di sublimazione in esperimenti MALDI IMS è attribuita a caratteristiche quali la morfologia matrice microcristallina che aumenta la superficie di matrice analita vincolante, maggiore purezza della matrice, e la deposizione di matrice omogenea che aumentano la riproducibilità rispetto alle tecniche matrice umido 1, 10. sublimazione involves riscaldamento di una matrice di polvere sotto vuoto immediatamente sotto una superficie del campione raffreddato con conseguente solida transizione in fase gas della matrice polvere seguita dalla deposizione sulla superficie del campione di tessuto. Durante sublimazione, deposizione di matrice può essere controllata da diversi fattori quali tempo, temperatura e pressione per fornire risultati altamente riproducibili. Un singolo esperimento sublimazione può richiedere da 5 a 20 min a seconda del tipo di matrice selezionata, che può essere riutilizzato più volte prima dello smaltimento. L&#39;apparecchio può essere acquistato commercialmente ad una frazione del prezzo delle irroratrici automatizzate ed è facilmente smontato per pulizia e manutenzione. Il basso costo e la relativa semplicità di questa tecnica di deposizione di matrice rendono ideale per i ricercatori che iniziano o in espansione su applicazioni di imaging di lipidi in MALDI IMS. Anche se le informazioni in dettaglio i protocolli per sublimazione dei tessuti per IMS sono stati riportati 11, alcuni protocolli standardizzati esistono which concentrarsi sul flusso di lavoro di base coinvolto con la realizzazione di un esperimento di sublimazione per l&#39;imaging lipidi alta massa in modalità di ioni negativi, il che rende difficile stabilire la tecnica senza vasta tentativi ed errori. Il seguente è un protocollo sperimentale che mira a colmare questa lacuna per la sublimazione della matrice di DAN su sezioni di cervello di ratto per imaging ad alta risoluzione e la rilevazione dei gangliosidi. <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/55254/55254fig2.jpg" /> Figura 2: sublimazione Apparatus. Fotografico (A) e schema (B) dell&#39;apparecchiatura sublimazione. La pompa per vuoto è collegata con un tubo in gomma per una trappola a freddo riempito con 300 mL di etanolo. La trappola fredda è poi collegata con un tubo in gomma per l&#39;apparato sublimazione. L&#39;apparecchiatura è costituita da due pezzi separati di vetro che sono sigillati insieme con un metallo giunto cardanico. La metà superiore della sublimatorecontiene il condensatore che è riempito di fanghiglia di ghiaccio. La piastra campione viene registrato sul fondo del condensatore, all&#39;interno dell&#39;apparato di vetro sigillato. La metà inferiore del dispositivo sublimazione contiene la matrice DAN, distribuite in modo uniforme di fronte al piatto del campione. Durante sublimazione, l&#39;apparecchio di vetro è posto su un bagno di sabbia riscaldata a 140 ° C da una piastra calda direttamente sotto di esso. La sonda di temperatura aiuta a mantenere una temperatura stabile durante l&#39;esperimento sublimazione attraverso il feedback della temperatura del bagno di sabbia rispetto alla temperatura preimpostata per l&#39;esperimento. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55254/55254fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Sublimatore</td><td>Chemglass Life Sciences</td><td>CG3038-01</td><td></td></tr><tr><td>matrice 1,5-Diaminonapthalene (DAN)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D21200&nbsp;</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Cry-Fisher</td><td>Scientific CryoStar</td><td></td><td>NX50</td></tr><tr><td>Piastra riscaldante con feedback di temperatura</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>HP88857290</td><td>Isotemp ADVD 7x7 HP 100 - 120 V</td></tr><tr><td>Jack in acciaio inox</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>2216479</td><td>10x10</td></tr><tr><td>Cold Trap Pompa</td><td></td><td></td> per vuoto <td>costruita su misura in loco</td></tr><tr><td></td><td>Franklin Electric</td><td>1102180403</td><td>Savant VP100 Vetrini a due stadi</td></tr> in <tr><td>ossido di indio-stagno (ITO) Tecnologia di</td><td>superficie Hudson</td><td>PSI 1111000</td><td>tipo II, 1,1 mm/25 ciascuno</td></tr><tr><td>MALDI TOF/TOF 5800 Strumento</td><td>AB Essiccatore Sciex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Essiccatore</td> da <td>tavolo</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D2797</td></tr></tbody></table>

sublimazione di dan matrix per la rilevazione e visualizzazione dei gangliosidi nel cervello di ratto tissue per maldi imaging mass spectrometry

Sublimation of DAN Matrix for the Detection and Visualization of Gangliosides in Rat Brain Tissue for MALDI Imaging Mass Spectrometry

La preparazione del campione è la chiave per la rilevazione ottimale e la visualizzazione di analiti a laser desorbimento / ionizzazione (MALDI) Imaging Mass Spectrometry (IMS) esperimenti di Matrix-assistita. Determinare il protocollo appropriato per seguire tutto il processo di preparazione del campione può essere difficile in quanto ogni passo deve essere ottimizzato per rispettare le caratteristiche uniche di analiti di interesse. Questo processo implica non solo trovare una matrice compatibile che può desorbire e ionizza le molecole di interesse in modo efficiente, ma anche selezionando la tecnica di deposizione matrice appropriata. Ad esempio, una tecnica di deposizione di matrice bagnata, che comporta sciogliendo una matrice in solvente, è superiore per desorbimento maggior parte delle proteine ​​e peptidi, che secchi tecniche di deposizione di matrice sono particolarmente efficaci per la ionizzazione di lipidi. Sublimazione stato segnalato come un metodo altamente efficiente di deposizione di matrice secca per la rilevazione di lipidi nei tessuti di MALDI IMS causa della homogeneity di deposizione di cristalli di matrice e minimale delocalizzazione analita rispetto a molti metodi di deposizione bagnata 1, 2. In generale, si prevede che il campione e la matrice in polvere in una camera sottovuoto con i campioni pressati contro una superficie fredda. L&#39;apparecchiatura viene quindi abbassata in un bagno riscaldato (sabbia o olio), risultando in sublimazione della matrice polvere sulla superficie del campione di tessuto raffreddata. Qui si descrive un protocollo sublimazione usando matrice 1,5-diamminonaftalene (DAN) per il rilevamento e la visualizzazione dei gangliosidi nel cervello di ratto utilizzando MALDI IMS.

Al termine dell&#39;esperimento sublimazione, le due metà del apparecchio di vetro vengono separati nella cappa e la slitta, registrato al condensatore, può essere rimosso (Figura 3A). A questo punto, il vetrino deve essere esaminato per la distribuzione uniforme della matrice e il tempo, la temperatura, o il posizionamento dell&#39;apparecchio in bagno di sabbia può essere adeguato per la diapositiva successiva. Un esperimento sublimazione successo DAN comporterà uno st...

Viene presentato un protocollo per la sublimazione della matrice DAN su tessuto cerebrale di ratto per la rilevazione di gangliosidi utilizzando la spettrometria di massa per immagini MALDI.

Sublimazione di DAN Matrix per la rilevazione e visualizzazione dei gangliosidi nel cervello di ratto Tissue per MALDI Imaging Mass Spectrometry

Sample preparation is key for optimal detection and visualization of analytes in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) Imaging Mass ...

L'obiettivo generale di questo protocollo di sublimazione è fornire un processo dettagliato e di facile esecuzione per la preparazione del campione, finalizzato alla rilevazione dei gangliosidi negli esperimenti di spettrometria di massa con imaging MALDI. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della neurobiologia, tra cui la distribuzione anatomica e la funzione dei gangliosidi, sia nel cervello sano che nelle patologie cerebrali. Il principale vantaggio di questa tecnica è che può essere adattata per ottenere immagini di alta qualità di numerose specie lipidiche con poche modifiche al protocollo.Per iniziare questa procedura, estrarre il tessuto cerebrale dal ratto e prepararlo per il criostato come descritto nel protocollo testuale. Quindi posizionare il tessuto nel criostato. Tagliare il tessuto fino alla localizzazione anatomica desiderata.Assicurarsi che lo spessore di taglio sia compreso tra otto e 12 micron. Utilizzando la barra anti-rotazione del criostato, sezionare lentamente il campione di tessuto appiattito. Possono verificarsi fori o segni sul tessuto se la posizione della barra di rotolamento è errata o se la lama è smussata.Spostare il tessuto al centro della piattaforma di sezionamento utilizzando pennelli puliti. Per mappare il tessuto, congelare le lamelle conduttive o le piastre metalliche posizionandole nel criostato durante il sezionamento. Quando la lamella è completamente congelata, spostare con attenzione il tessuto sezionato sulla superficie conduttiva della lamella utilizzando pennelli puliti.Una volta posizionate correttamente tutte le sezioni di tessuto sul vetrino, appoggiare un dito sotto il vetrino dalla parte opposta rispetto al tessuto e premere fino a quando la sezione non si scongela. Successivamente, collocare i vetrini con il tessuto in un essiccatore per cinque-dieci minuti. In alternativa, utilizzare un vetrino caldo e premere delicatamente, con il lato conduttivo rivolto verso il basso, contro le sezioni di tessuto appiattite.Operando nella cappa, posizionare un bagno di sabbia in un contenitore di alluminio su un piastra riscaldante. La piastra riscaldante deve trovarsi su un sollevatore metallico a forbice con superficie adeguata. Accendere la piastra riscaldante e impostare la temperatura a 140 gradi Celsius.Utilizzare la sonda di feedback della temperatura per monitorare la temperatura della sabbia durante tutto l'esperimento e garantire la costanza della temperatura. Successivamente, posizionare 300 milligrammi di matrice DAN sulla superficie inferiore dell'apparato di sublimazione. Distribuire la matrice in uno strato uniforme al centro dell'apparato, con larghezza e lunghezza approssimativamente corrispondenti a quelle del vetrino da sublimare.Posizionare una piastra metallica sulla superficie interna dell'apparato, in modo che la piastra entri in contatto diretto con la parte inferiore del condensatore. Fissare diagonalmente una lametta per prova vuota sulla superficie della piastra metallica, applicando del nastro ai bordi esterni della lametta. Collegare le parti superiore e inferiore dell'apparato con un anello di gomma a forma di O al centro, per garantire una chiusura ermetica.Posizionare un giunto metallico a U al centro dell'apparato e stringere le morse fino a quando la metà superiore e inferiore dell'apparato non sono sigillate saldamente insieme. Successivamente, inserire l'apparato nell'anello metallico circolare posto sul bagno di sabbia. Poi, aggiungere una manciata di ghiaccio tritato nel condensatore.Riempire il condensatore per un quarto o fino a metà con acqua fredda per creare una sospensione di ghiaccio. La sospensione di ghiaccio raffredderà la piastra metallica all'interno dell'apparecchiatura e, di conseguenza, il vetrino ad essa aderente. Attendere almeno cinque minuti affinché la temperatura raggiunga uno stato stazionario.Quindi, versare 300 mL di metanolo nel contenitore della trappola fredda e posizionare la vetreria all'interno del contenitore. Collegare la pompa a vuoto all'uscita della trappola fredda utilizzando un tubo di gomma. Utilizzare un altro pezzo di tubo di gomma per collegare l'ingresso della trappola fredda all'apparato di sublimazione.Assicurarsi che il tubo sia saldamente fissato utilizzando morsetti metallici. Utilizzare la pompa a vuoto per ottenere un vuoto compreso tra 30 e 50 millitorr. Lasciare funzionare le pompe per almeno cinque minuti per consentire l'equilibrazione della pressione.Aggiungere due o tre piccoli pezzi di ghiaccio secco nell'etanolo, sul fondo del contenitore della trappola fredda. La trappola fredda aiuta a impedire l'accumulo di particelle della matrice nella pompa a vuoto. Le viti sull'anello a U dell'apparato di sublimazione potrebbero richiedere un serraggio una volta accesa la pompa a vuoto, a causa della diminuzione della pressione all'interno dell'apparato.Assicurarsi che la temperatura del bagno di sabbia si sia stabilizzata a 140 gradi Celsius. Verificare inoltre che il vuoto sia attivo e che l'apparato sia fissato nell'anello metallico sopra il bagno di sabbia, con tutti i tubi collegati. Impostare il timer su sette minuti, ma non avviare ancora il timer.Sollevare lentamente il sollevatore a forbice e il bagno di sabbia fino all'apparato di sublimazione, finché il giunto a U del sublimatore si trovi ben al di sopra della guarnizione metallica a O. Questo spazio aggiuntivo consente di regolare l'apparato sulla sabbia. Premere rapidamente e delicatamente il sublimatore sulla superficie della sabbia per assicurarsi che l'apparato sia posizionato in modo uniforme.E quindi, avviare immediatamente il cronometro. Quando suona il cronometro, spegnere la pompa a vuoto e abbassare con attenzione il sollevatore a forbice finché il sublimatore non tocca più il bagno di sabbia e si trova saldamente nell'anello metallico a forma di O. Allentare lentamente la valvola microvent per rilasciare la pressione nell'apparato.Allentare la fascetta metallica intorno al tubo di gomma dell'apparato di sublimazione e iniziare lentamente a serrarlo. Una volta che il tubo di gomma è stato leggermente allentato, piegare il tubo da un lato per permettere al gas residuo di fuoriuscire. Quando la pressione ambiente è stata ripristinata, rimuovere con attenzione il tubo di gomma dall'apparato di sublimazione.Successivamente, allentare i morsetti sul giunto a U dell'apparecchiatura e rimuoverli. Separare con attenzione le due metà dell'apparecchio per sublimazione ed estrarre il vetrino dalla parte superiore del recipiente di vetro interno. Esaminare il vetrino per verificare una distribuzione uniforme della matrice.Se la distribuzione e la quantità di matrice sublimata sono sufficienti, fissare con del nastro un nuovo vetrino con il tessuto all'interno del sublimatore e ripetere il processo di sublimazione. Procedere quindi con l'acquisizione delle immagini e l'analisi come descritto nel protocollo testuale. Lo spettro di massa mostra l'abbondanza ionica degli anoliti in un intervallo di massa compreso tra 1000 e 2000.I principali gangliosidi della serie A sono indicati lungo lo spettro. Qui è mostrata l'immagine molecolare corrispondente dei gangliosidi nel cervello del ratto. L'immagine molecolare mostra la distribuzione anatomica di diverse specie di gangliosidi mediante codifica a colori, sovrapposte e colorate artificialmente utilizzando il software ImageJ.Generalmente, le persone nuove rispetto a questo metodo potrebbero incontrare difficoltà, poiché nel processo di preparazione del campione vi sono molte variabili che possono influenzare la qualità dei risultati di IMS e che spesso vengono omesse nei protocolli riportati. Durante il tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di monitorare la quantità di matrice sublimata dopo ogni esperimento e di modificare di conseguenza il tempo di sublimazione per il vetrino. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori per esplorare il ruolo dei lipidi di membrana come i gangliosidi, dopo lesioni cerebrali, la malattia di Ner-jone e il processo naturale di invecchiamento.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'abbondanza e sulla distribuzione anatomica dei lipidi nel cervello, può essere applicato anche ad altri sistemi, inclusi tessuti al di fuori del cervello e persino modelli vegetali e di insetti. Lavorare con radici danneggiate può essere estremamente pericoloso e precauzioni come l'uso di guanti, maschere e protezioni per gli occhi devono essere sempre adottate durante l'esecuzione di questa procedura.

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Dithranol (DT; 1,8-diidrossi-9 ,10-dihydroanthracen-9-one) è stato precedentemente segnalato come una matrice MALDI per l'imaging tessuto di piccole molecole; protocolli per l'uso di DT per l'imaging MALDI di lipidi endogeni sul superficie di sezioni di tessuto di positivo-ion MALDI-MS su uno strumento quadrupolo-FTICR altissima risoluzione sono forniti qui.

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Una sorgente di imaging per spettrometria di massa (MSI) operata a pressione atmosferica è stata sviluppata accoppiando il desorbimento laser nel medio infrarosso e la post-ionizzazione elettrospray. La matrice di ghiaccio esogena è stata utilizzata come matrice di assorbimento dell'energia per facilitare il desorbimento risonante del materiale correlato ai tessuti. Questo manoscritto fornisce un protocollo passo-passo per l'esecuzione dell'IR-MALDESI MSI di topo neonatale di tutto il corpo.

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Sublimazione di DAN Matrix per la rilevazione e visualizzazione dei gangliosidi nel cervello di ratto Tissue per MALDI Imaging Mass Spectrometry (Video) | JoVE Journal

Sublimazione di DAN Matrix per la rilevazione e visualizzazione dei gangliosidi nel cervello di ratto Tissue per MALDI Imaging Mass Spectrometry

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