Name: Mirata In Situ mutagenesi dellistone geni in germogliamento lievito (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Impara la mutagenesi mirata dei geni istonici in Saccharomyces cerevisiae per studiare la funzione cromatinica. Questo metodo consente di generare mutazioni specifiche nei siti endogeni e analizzare i processi di trascrizione del DNA.

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Ringraziamo Reine Protacio per gli utili commenti durante la preparazione di questo manoscritto. Esprimiamo la nostra gratitudine alla National Science Foundation (sovvenzioni n. 1243680 e 1613754) e all'Hendrix College Odyssey Program per il sostegno finanziario.

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

L&#39;elevata omologia di sequenza tra due geni non alleliche che codificano ciascuno dei quattro proteine essenziali istoniche delle cellule S. cerevisiae aploidi possa rappresentare sfida per investigatori vogliano indirizzare specificamente uno dei due geni per mutagenesi. In precedenza descritto lievito metodologie di mutagenesi, compreso il Delitto Perfetto, genomica mutagenesi sito-specifica (SSG), e PCR-based metodi pezzi allele-free clonazione 5, <sup class="x...

I quattro proteine ​​di base dell&#39;istone H2A, H2B, H3, H4 e giocano un ruolo centrale nella compattazione, l&#39;organizzazione e la funzione dei cromosomi eucariotiche. Due insiemi di ciascuna di tali istoni formano la ottamero istoni, un rocchetto molecolare che dirige l&#39;avvolgimento ~ 147 paia di basi del DNA su se stessa, che si traduce nella formazione di un nucleosoma 1. I nucleosomi sono partecipanti attivi in ​​una varietà di processi cromosomiche-based, come ad esempio la regolazione della trascrizione genica e la formazione di eucromatina e heterochromatin tra cromosomi, e come tali sono stati al centro di un&#39;intensa ricerca nel corso degli ultimi decenni. Un certo numero di meccanismi sono stati descritti da cui nucleosomi può essere manipolato in modi che possono facilitare l&#39;esecuzione di processi specifici - Questi meccanismi comprendono modificazione post-traslazionale di residui degli istoni, rimodellamento nucleosomi ATP-dipendente, e la riorganizzazione nucleosomi ATP-indipendentee montaggio / smontaggio 2, 3. Il lievito Saccharomyces cerevisiae erba è particolarmente potente organismo modello per la comprensione della funzione istone negli eucarioti. Questo può essere in gran parte attribuito all&#39;elevato grado di conservazione evolutiva delle proteine istone tutto il eucarioti dominio e la riconducibilità di lievito ad una varietà di sperimentale genetico e biochimico approcci 4. approcci Reverse-genetici nel lievito sono stati ampiamente utilizzati per studiare gli effetti di specifiche mutazioni istoni su vari aspetti della biologia della cromatina. Per questi tipi di esperimenti è spesso preferibile utilizzare cellule in cui gli istoni mutanti sono espressi dal loro loci genomici nativa, come espressione da plasmidi autonome può portare a anormali livelli intracellulari di proteine ​​istoni (a causa di un numero variabile di plasmidi in cellule) e alterazione concomitante di cromatina environments, che alla fine possono confondere l&#39;interpretazione dei risultati. Qui, si descrive una tecnica PCR-based che consente di mutagenesi mirata di geni istone alle loro posizioni nativi genomiche che non richiede una fase di clonazione e risultati nella generazione della mutazione desiderata (s) senza rimanenti sequenze di DNA esogene nel genoma. Questa tecnica sfrutta l&#39;efficiente sistema di ricombinazione omologa nel lievito e ha diverse caratteristiche in comune con altre tecniche simili sviluppati da altri gruppi - in particolare il Delitto Perfetto, genomica mutagenesi sito-specifica (SSG), e la clonazione senza PCR allele-based metodi sostitutivi 5, 6, 7. Tuttavia, la tecnica descriviamo ha un aspetto che lo rende particolarmente adatto per la mutagenesi dei geni istoni. In cellule di lievito aploidi, ciascuno dei quattro istoni nucleo è codificata da due non-ageni llelic e altamente omologhi: per esempio, l&#39;istone H3 vengono codificati dai geni HHT1 e HHT2, e le fasi di lettura aperte (ORF) dei due geni sono oltre il 90% identica in sequenza. Questo elevato grado di omologia può complicare esperimenti progettati per indirizzare specificamente uno dei due geni istone-codifica per la mutagenesi. Considerando che i suddetti metodi richiedono spesso l&#39;uso di almeno alcune sequenze all&#39;interno della ORF del gene bersaglio di guidare ricombinazione omologa, la tecnica descriviamo qui fa uso di sequenze fiancheggianti le ORF dei geni istoni (che condividono molto meno omologia di sequenza) per la fase di ricombinazione, aumentando così la probabilità di successo di targeting mutagenesi al locus desiderata. Inoltre, le regioni omologhe che guidano la ricombinazione possono essere molto ampia, contribuendo ulteriormente alla efficiente ricombinazione omologa mirato.

<table><tbody><tr><td>1 kb Scala del DNA (standard del DNA)</td><td>New England BioLabs</td><td>N3232L</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A5093-100G</td><td></td></tr><tr><td>Acido borico</td><td>Sigma</td><td>B0394-500G</td><td></td></tr><tr><td>Miscela dNTP (10 mM ciascuno)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R0192</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione EDTA (0,5 M, pH 8,0)</td><td>AmericanoBio</td><td>AB00502-01000</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo (200 Proof)</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-824</td><td></td></tr><tr><td>Acido etilendiamminotetraacetico sale disodico diidrato (EDTA)</td><td>Sigma</td><td>E4884-500G</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di litio diidrato</td><td>Sigma</td><td>L6883-250G</td><td></td></tr><tr><td>MyCycler Termociclatore</td><td>BioRad</td><td>170-9703</td><td></td></tr><tr><td>Poli(glicole etilenico) (PEG)</td><td>Sigma</td><td>P3640-1KG</td><td></td></tr><tr><td>PrimeSTAR HS DNA POLIMERASI (DNA polimerasi ad alta fedeltà)&nbsp; e 5x tampone</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-443-960</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di DNA di sperma di salmone</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15632-011</td><td></td></tr><tr><td>Sigma 7-9 (base Tris, in polvere)</td><td>Sigma</td><td>T1378-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di sodio triidrato</td><td>Sigma</td><td>236500-500G</td><td></td></tr><tr><td>Supra Sieve GPG Agarosio (agarosio a bassa temperatura di metling)</td><td>AmericanBio</td><td>AB00985-00100</td><td></td></tr><tr><td>Taq Polimerasi e 10x tampone</td><td>New England BioLabs</td><td>M0273X</td><td></td></tr><tr><td>Stuzzicadenti</td><td>Fisher Scientific</td><td>S67859</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl (1 M, pH 8.0)</td><td>AmericanBio</td><td>AB14043-01000</td><td></td></tr><tr><td>A-D(+)-Glucosio</td><td>Fisher Scientific AC170080025</td><td></td><td>per terreni di lievito</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0140-01-0</td><td>per terreni di lievito</td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0118-07-2</td><td>per YPD medio</td></tr><tr><td>Estratto di lievito</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0127-17-9</td><td>per YPD medio</td></tr><tr><td>acido 4-aminobenzoico</td><td>Sigma</td><td>A9878-100G</td><td>per completo minimo dropout medio&nbsp;</td></tr><tr><td>Adenina</td><td>Sigma</td><td>A8626-100G</td><td>per un mezzo di caduta minimo completo</td></tr><tr><td>Glicina cloridrato</td><td>Sigma</td><td>G2879-100G</td><td>per un mezzo di caduta minimo completo&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Alanina</td><td>Sigma</td><td>A7627-100G</td><td>per un mezzo di caduta minimo completo&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Arginina monocloridrato</td><td>Sigma</td><td>A5131-100G</td><td>per un mezzo di caduta minimo completo&nbsp;</td></tr><tr><td>L-asparagina monoidrato</td><td>Sigma</td><td>A8381-100G</td><td>per un mezzo di caduta minimo completo&nbsp;</td></tr><tr><td>Acido L-aspartico sale sodico monoidrato</td><td>Sigma</td><td>A6683-100G</td><td>per un mezzo di caduta minimo completo.</td></tr><tr><td>L-cisteina cloridrato monoidrato</td><td>Sigma</td><td>C7880-100G</td><td>per un mezzo di caduta minimo completo</td></tr><tr><td>Acido L-glutammico cloridrato</td><td>Sigma</td><td>G2128-100G</td><td>per un mezzo di caduta minimo completo&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Glutammina</td><td>Sigma</td><td>G3126-100G</td><td>per un mezzo di caduta minimo completo&nbsp;</td></tr><tr><td>L-istidina monocloridrato monoidrato</td><td>Sigma</td><td>H8125-100G</td><td>per un mezzo di caduta minimo completo&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Isoleucina</td><td>Sigma</td><td>I2752-100G</td><td>per un mezzo di caduta minimo completo</td></tr><tr><td>L-Leucina</td><td>Sigma</td><td>L8000-100G</td><td>per un mezzo di caduta minimo completo</td></tr><tr><td>L-lisina monocloridrato</td><td>Sigma</td><td>L5626-100G</td><td>per un mezzo di caduta minimo completo.</td></tr><tr><td>L-Metionina</td><td>Sigma</td><td>M9625-100G</td><td>per un mezzo di caduta minimo completo</td></tr><tr><td>L-Fenilalanina</td><td>Sigma</td><td>P2126-100G</td><td>per un mezzo di caduta minimo completo&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Proline</td><td>Sigma</td><td>P0380-100G</td><td>per un mezzo di caduta minimo completo&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Serine</td><td></td><td>Sigma S4500-100G</td><td>per un mezzo di caduta minimo completo&nbsp;</td></tr><tr><td>L-treonina</td><td>Sigma</td><td>T8625-100G</td><td>per un mezzo di caduta minimo completo&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Triptofano</td><td>Sigma</td><td>T0254-100G</td><td>per un mezzo di caduta minimo completo&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Tirosina</td><td>Sigma</td><td>T3754-100G</td><td>per un mezzo di caduta minimo completo</td></tr><tr><td>L-Valina</td><td>Sigma</td><td>V0500-100G</td><td>per un mezzo di caduta minimo completo&nbsp;</td></tr><tr><td>myo-Inositol</td><td>Sigma</td><td>I5125-100G</td><td>per un mezzo di caduta minimo completo&nbsp;</td></tr><tr><td>Uracil</td><td>Sigma</td><td>U0750-100G</td><td>per un mezzo di caduta minimo completo</td></tr><tr><td>Solfato di ammonio</td><td>Fisher Scientific</td><td>A702-500</td><td>per un mezzo di caduta minimo completo&nbsp;</td></tr><tr><td>Lievito a base di azoto</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0919-07-3</td><td>per un mezzo di caduta minimo completo</td></tr><tr><td>Acido 5-fluoroorotico (5-FOA)</td><td>AmericanoBio</td><td>AB04067-00005</td><td>per&nbsp; 5-FOA terreno</td></tr></tbody></table>

mirata<em&gt; in situ</em&gt; mutagenesi dell&#39;istone geni in germogliamento lievito

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Descriviamo un sistema basato sulla PCR e sulla ricombinazione omologa per generare mutazioni mirate nei geni istonici in cellule di lievito in gemmazione. Gli alleli mutanti risultanti risiedono nei loro siti genomici endogeni e nessuna sequenza di DNA esogena rimane nel genoma dopo la procedura. Poiché nelle cellule di lievito aploidi ciascuna delle quattro proteine istoniche principali è codificata da due geni non allelici con frame di lettura aperti (ORF) altamente omologhi, indirizzare la mutagenesi specificamente a uno dei due geni che codificano una particolare proteina istonica può essere problematico. La strategia che descriviamo qui aggira questo problema utilizzando sequenze all'esterno, piuttosto che all'interno, dell'ORF dei geni bersaglio per la fase di ricombinazione omologa. Un'altra caratteristica di questo sistema è che le regioni del DNA che guidano i passaggi di ricombinazione omologa possono essere rese molto estese, aumentando così la probabilità di eventi di integrazione di successo. Queste caratteristiche rendono questa strategia particolarmente adatta per la mutagenesi genica degli istoni, ma può anche essere adattata per la mutagenesi di altri geni nel genoma del lievito.

Descriviamo la generazione di un allele hht2 esprimere un istone H3 mutante proteina ospitare una sostituzione nella posizione 53 da un arginina ad acido glutammico (H3-R53E mutante) come un esempio rappresentativo della mirata strategia situ mutagenesi. Abbiamo generato un ceppo in cui l&#39;intera ORF di HHT2 è sostituito dal gene URA3 (vedi punto 1 del protocollo). Questo ceppo, ...

Viene presentata una strategia per generare mutazioni nei geni istonici nella loro posizione endogena in Saccharomyces cerevisiae.

Mirata<em&gt; In Situ</em&gt; mutagenesi dell&#39;istone geni in germogliamento lievito

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

L'obiettivo generale di questa procedura è generare mutazioni specifiche nei geni delle istoni nelle loro posizioni cromosomiche endogene nelle cellule di lievito in gemmazione. Questo metodo può essere utilizzato per determinare il contributo di residui specifici delle istoni in una varietà di processi che utilizzano la cromatina come substrato, come la trascrizione del DNA, in ogni combinazione. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è possibile indirizzare geni specifici delle istoni alla mutagenesi nonostante il fatto che nel lievito ogni proteina istonica sia codificata da due geni non allelici altamente omologhi.Dopo aver generato una ceppa di lievito con il gene istonico bersaglio eliminato e sostituito da URA3, genera prodotti di PCR per due frammenti parzialmente sovrapposti del gene istonico bersaglio impostando la seguente reazione per la prima metà del gene. Per la seconda metà del gene, imposta una reazione PCR simile utilizzando primer diversi. Posiziona le reazioni in un termociclatore e imposta il seguente programma.Eseguire da 20 a 50 microlitri delle reazioni PCR su un gel di agarosio a basso punto di fusione allo 0,9% in tampone TBE. Quindi utilizzare una lametta pulita per tagliare i prodotti PCR dal gel e trasferire ciascun frammento in una provetta da 1,5 millilitri. Conservare i pezzi di agarosio a 20 gradi Celsius fino al momento dell'uso.Per preparare il DNA stampo per le reazioni di PCR al fine di generare prodotti PCR di dimensione completa, sciogliere le sezioni di agarosio in un blocco termico a 65 gradi Celsius per cinque minuti. Vortexare i tubi ogni uno o due minuti per favorire lo scioglimento. Trasferire una quantità definita di agarosio fuso da ogni campione in un singolo tubo da microcentrifuga e mescolare il tubo mediante vortexaggio.Utilizzare questo come modello per la PCR di fusione e conservare a 20 gradi Celsius fino all'uso. Per amplificare una grande quantità di prodotto PCR di dimensione completa, preparare sei reazioni di PCR ciascuna con i seguenti reagenti. Posizionare i tubi nel termociclatore ed eseguire le reazioni con le seguenti impostazioni.Concentrare i prodotti della PCR mediante precipitazione e utilizzarli per la cotrasformazione con il plasmide di base seguendo il protocollo indicato nel testo. Per selezionare la perdita del gene URA3 in seguito all'integrazione del prodotto della PCR, effettuare una replica delle cellule dalle piastre da 1 a 20 rimuovendo il coperchio della piastra e premendo la piastra contenente le colonie su della stoffa di velluto sterile. Trasferire le cellule dal velluto su una piastra contenente 5-FOA premendo la piastra sul velluto.Incubare le piastre a 30 gradi Celsius per due giorni. Successivamente, esaminare attentamente le piastre per verificare la crescita. Dopo aver effettuato lo streaking e l'incubazione delle colonie candidate su piastre YPD secondo il protocollo descritto nel testo, effettuare un replica plating di ciascuna piastra di purificazione YPD su una piastra YPD fresca, su una piastra dropout priva di uracile per verificare la perdita del gene URA3 e su una seconda piastra dropout per monitorare la presenza o l'assenza del plasmide backbone.Dopo l'incubazione, identificare una colonie da ciascun campione candidato che sta crescendo sulla piastra YPD ma non sta crescendo su nessuna delle piastre dropout. Riettere queste colonie su piastre YPD fresche. Come indicato, verificare l'integrazione corretta dell'allele mutato mediante PCR secondo il protocollo descritto nel testo.Questa figura mostra i risultati della PCR per la generazione di due frammenti parzialmente sovrapposti di HHT2 con le mutazioni desiderate che determinano, in ultima analisi, un cambiamento del codone da AGA a GAA, producendo una mutazione R53E. Qui viene illustrato il risultato di una reazione di PCR di fusione che ha generato prodotti PCR di dimensione completa. I prodotti PCR di dimensione completa contenevano regioni di 195 e 220 paia di basi omologhe alle regioni rispettivamente a monte e a valle del frame di lettura aperto di HHT2, al fine di indurre il ricongiungimento omologo.In questo esempio di trasformazione, i prodotti PCR di dimensioni complete sono stati cotrasformati insieme al plasmide marcato con HIS-3 e i trasformanti sono stati selezionati su piastre prive di istidina. Le colonie positive per HIS sono state quindi analizzate per la resistenza al 5-FOA. Sono mostrati esempi di candidati, così come di campioni poco probabili a rappresentare gli eventi di integrazione desiderati.Sono stati identificati 12 campioni candidati e sottoposti ad analisi PCR per verificare la sostituzione del gene URA3 con prodotti PCR mutati. Quattro candidati hanno mostrato l'integrazione di un prodotto PCR nella posizione corretta. Uno di questi candidati è mostrato nella corsia quattro.Poiché la mutazione AG2GA genera un nuovo sito di restrizione EcoR1, è stata effettuata una digestione con EcoR1 su uno dei campioni PCR di integrazione di successo per dimostrare che la sequenza mutata era effettivamente stata incorporata nel genoma. Una volta disponibili tutti i reagenti, dovrebbe essere possibile ottenere cellule di lievito che portano le mutazioni istoniche desiderate nell'arco di 15-20 giorni. Una volta generata la mutazione desiderata nel ceppo ospite, le cellule che esprimono la proteina istonica bersaglio esclusivamente dal gene mutagenizzato possono essere ottenute mediante opportuni incroci genetici.Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare che i parametri per le reazioni di PCR potrebbero necessitare di essere aggiustati in base alla natura dei primer specifici utilizzati negli esperimenti e alle dimensioni previste dei prodotti di PCR. Sebbene questa procedura sia particolarmente adatta alla mutagenesi dei geni delle istoni, poiché consente di mirare un gene specifico delle istoni nonostante la presenza di un secondo gene non allelico altamente omologo, può anche essere utilizzata per generare mutazioni in altre posizioni genomiche. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come generare mutazioni mirate nei geni delle istoni NC2 nel lievito in gemmazione, utilizzando una combinazione di approcci di PCR e tecniche di genetica del lievito.Non dimenticare che l'esposizione alla luce UV può essere estremamente pericolosa e che occhiali protettivi, schermi e indumenti protettivi devono sempre essere utilizzati quando si lavora con un transilluminatore UV. Indossare inoltre guanti, occhiali protettivi e abbigliamento protettivo durante la maggior parte delle fasi della procedura.

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Gli studi genetici nel lievito può essere impiegato per studiare le funzioni cellulari e molecolari dei geni umani nel metabolismo del DNA cellulare. I metodi sono descritti per la caratterizzazione genetica della persona...

Studi genetici di proteine ​​umane di riparazione del DNA Utilizzando lievito come sistema modello

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Fonte: Bennett, S. A., et al., Caratterizzazione delle alterazioni delle modificazioni post-traduzionali degli istoni nei modelli di proteinopatia neurodegenerativa del lievito. J. Vis. Exp. (2019). Questo video mostra la procedura di valutazione delle modificazioni istoniche nelle cellule di lievito che sovraesprimono proteine neurodegenerative. Le fasi includono la lisi cellulare, la centrifugazione, l'elettroforesi, il trasferimento della membrana e la rilevazione basata su anticorpi degli...

Rilevamento delle modificazioni istoniche nelle cellule di lievito con sovraespressione di proteine neurodegenerative

Geneticamente codificato istone-miniSOG induce genome-wide mutazioni ereditarie in un modo dipendente dalla luce blu. Questo metodo mutagenesi è semplice, veloce, privo di sostanze chimiche tossiche, e ben si adatta per lo screening genetico in avanti e l'integrazione del transgene.

Optogenetic caso Mutagenesi Utilizzando istone-miniSOG in<em&gt; C. elegans</em

Qui, descriviamo un protocollo per immunoprecipitazione della cromatina degli istoni modificati dal lievito Saccharomyces cerevisiae. DNA immunoprecipitato viene successivamente utilizzato per PCR quantitativa per interrogare l'abbondanza e la localizzazione di modifiche post-traduzionali degli istoni in tutto il genoma.

Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) di modificazioni istoniche da Saccharomyces cerevisiae

Questo articolo descrive una metodologia dettagliata per mutagenesi casuale di un determinato gene in lievito di fissione. Ad esempio, noi target rpt4 +, che codifica per una subunità del proteasoma 19S e schermo per le mutazioni che destabilizzare eterocromatina.

Gene targeting mutagenesi casuale per selezionare eterocromatina-destabilizzare Proteasome mutanti in lievito di fissione

Questo protocollo delinea le procedure sperimentali per caratterizzare il genoma cambiamenti nei livelli di modifiche post-traduzionali degli istoni (PTM) che si verificano in relazione la sovraespressione di proteine associate con ALS e malattia del Parkinson in Modelli di Saccharomyces cerevisiae . Dopo la separazione di SDS-PAGE, vengono rilevati livelli PTM istone individuali con gli anticorpi specifici di modifiche tramite Western blotting.

Alterazioni di modificazione post-traduzionale istone caratterizzante nel lievito Neurodegenerative Proteinopathy modelli

Vi presentiamo un protocollo di schermo semplice soppressore in fissione lievito. Questo metodo è efficiente, privo di sostanza mutagena e selettivo per le mutazioni che si verificano spesso in un singolo locus genomico.  Il protocollo è adatto per isolare i soppressori che alleviare i difetti di crescita in coltura liquida che sono causati da una mutazione o una droga.

Una schermata di soppressore Deep-sequenziamento-assistita, spontanea nel lievito a fissione Schizosaccharomyces pombe

Questo lavoro descrive un protocollo per uno screening genetico multicopia soppressore in Schizosaccharomyces pombe. Questa schermata utilizza una libreria plasmidica dell'intero genoma per identificare cloni soppressori di un fenotipo con perdita di funzione associato a un ceppo mutante di query. Nuovi soppressori genetici del mutante nullo ell1 sono stati identificati utilizzando questa schermata.

Screening genetico per l'identificazione di soppressori multicopia in Schizosaccharomyces pombe

La microscopia time-lapse è uno strumento prezioso per studiare la meiosi nel lievito in erba. Questo protocollo descrive un metodo che combina la sincronizzazione del ciclo cellulare, la microscopia time-lapse e l'esaurimento condizionale di una proteina bersaglio per dimostrare come studiare la funzione di una proteina specifica durante la segregazione cromosomica meiotica.

Uso della microscopia time-lapse e della deplezione nucleare stadio-specifica delle proteine per studiare la meiosi in S. cerevisiae

L'arricchimento e il sequenziamento del DNA nascente associato alle proteine (eSPAN) sono stati sviluppati per rilevare l'abbondanza relativa di una proteina associata alla cromatina su due filamenti di DNA replicanti, rivelando così una comprensione molecolare della replicazione della cromatina e dei suoi processi accoppiati. Questo protocollo descrive le procedure eSPAN nelle cellule staminali embrionali (ES) di lievito e topi.

Analisi specifica dei filamenti di proteine in replicazione di filamenti di DNA tramite arricchimento e sequenziamento del metodo del DNA nascente associato a proteine

Impara la mutagenesi mirata dei geni istonici in Saccharomyces cerevisiae per studiare la funzione cromatinica. Questo metodo consente di generare mutazioni specifiche nei siti endogeni e analizzare i processi di trascrizione del DNA.

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