Name: Differenziazione efficiente delle pluripotenti cellule staminali per NKX6-1 + progenitori pancreatici (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Scopri un protocollo a quattro stadi per differenziare cellule staminali pluripotenti umane in progenitori pancreatici NKX6.1+. Questo metodo genera alte percentuali di cellule progenitrici per studiare lo sviluppo del pancreas umano e le potenziali applicazioni nel trattamento del diabete.

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Questo manoscritto è stato sostenuto da un finanziamento della Toronto Generale e Fondazione occidentale e il premio Graduate Banting &amp; Best Diabetes Centre-University Health Network.

1. preparazione di soluzioni e supporti NOTA: Preparare tutti i supporti per colture cellulari in un ambiente sterile. Media deve essere fatto e utilizzato immediatamente. Dettagli reagenti sono forniti nella tabella materiali. <ol><li> differenziazione media <ol><li> Preparare Giorno 0 differenziazione di media: RPMI medio con 1% glutammina, 2 micron CHIR 99021, 100 ng / ml Activin A, 10 4 M MTG. </li><li> Preparare Giorno 1-2 Differenziazione di media: RPMI medio con 1% glutammina, 100 ng / ml Activin A, 10 4 M MTG, 5 ng / ml bFGF, Acid 50 mg / ml ascorbico. </li><li> Preparare Giorno 3-5 Differenziazione di media: RPMI medio con 1% glutammina, 1% B27, 10 4 M MTG, 0,75 micron Dorsomorphin, 50 ng / ml FGF10. </li><li> Preparare Giorno 6-7 Differenziazione di media: DMEM con 1% glutammina, 1% B27, 50 mg / ml di acido ascorbico, 50 ng / ml FGF10, 0,25 micron SANT-1, 2 mM acido retinoico, 50 ng / ml NOGGIN. NOTA: retinoicoAcido deve essere aggiunto ai media dell&#39;ultimo e dei media deve essere protetto dalla luce per evitare la degradazione ossidativa 15. </li><li> Preparare Giorno 8-12 Differenziazione di media: DMEM con 1% glutammina, 1% B27, 50 mg / ml di acido ascorbico, 50 ng / ml NOGGIN, 100 ng / ml hEGF, 10 mM nicotinamide. </li></ol></li><li> Preparare FACS buffer: 10% FBS in PBS, meno calcio e magnesio. </li></ol> 2. HESC Differenziazione NOTA: HESC vengono scongelati, diversi passaggi e ampliato di topo irradiati fibroblasti embrionali in presenza di un supporto KOSR-based integrato con bFGF 16. HESCs sono pronti per la differenziazione quando le cellule raggiungono 80-95% di confluenza. In questo momento le colonie dovrebbero essere grandi con bordi definiti e un &#39;a forma di cupola&#39; struttura (Figura 1A). Tutti coltura cellulare viene eseguita in fondo piatto, tessuto di coltura trattata piastre rivestite con 0,1% di gelatina. Tipicamente, le cellule sono coltivate in 6 opiastre da 12 pozzetti, in volumi dei media di 2 ml o 1 ml, rispettivamente. <ol><li> Il giorno 0, iniziare la differenziazione sostituendo il materiale KOSR-based con Giorno 0 Differenziazione Media. </li><li> Nei giorni 1 e 2, agitare delicatamente la piastra per rimuovere tutte le cellule morte dal monostrato prima aspirazione. Sostituire con il giorno 1-2 Differenziazione Media. </li><li> Il giorno 3, Celle di raccolta per citometria a flusso. Se le cellule esprimono più del 90% CXCR4 + / CD117 +, procedere al punto 2.4. </li><li> Nei giorni 3 e 5, agitare delicatamente la piastra per rimuovere tutte le cellule morte dal monostrato prima di aspirazione. Sostituire con il giorno 3-5 Differenziazione Media. </li><li> Nei giorni 6 e 7, sostituirlo con il giorno 6-7 Differenziazione Media. </li><li> Nei giorni 8, 10 e 12, sostituire con la Giornata 8-12 Differenziazione Media. </li><li> Il giorno 13, Celle di raccolta per citometria a flusso per determinare PDX1 ed espressione NKX6-1. </li></ol> 3. Cellule di raccolta per l&#39;analisi Citometria a Flusso <ol><li> Separa celle consoluzione di tripsina commerciale 1x secondo il protocollo del produttore e incubare a 37 ° C per 3 min. </li><li> Rimuovere la soluzione tripsina commerciale e sospendere nuovamente le cellule singole a 1.000 ml FACS tampone con 30 microlitri DNasi I. </li><li> Celle filtranti con un colino cella di rete di nylon 35 micron e trasferire in una provetta. </li><li> cellule centrifugare a 455 xg per 5 min. Preparare le cellule sia per la colorazione dal vivo o fisso. </li></ol> 4. La colorazione per citometria a flusso <ol><li> Flusso di preparazione per la colorazione dal vivo il giorno 3 <ol><li> Risospendere le cellule in 1.000 ml FACS tampone. Trasferimento 200 ml (circa 1-3 x 10 5 cellule) in due pozzetti di una piastra a 96 pozzetti (per entrambi i campioni non colorati e macchiati). </li><li> Centrifugare la piastra a 931 xg per 2 min. Rimuovere il surnatante invertendo la piastra. </li><li> Macchia con anticorpi primari coniugati, CXCR4: APC e CD117: PE (vedi Tabella M ateriali) per 30 min a temperatura ambiente al riparo dalla luce. </li><li> Centrifugare la piastra a 931 xg per 2 min. Rimuovere il surnatante invertendo la piastra. </li><li> campioni risospendere in 100 microlitri FACS tampone. </li><li> Centrifugare la piastra a 931 xg per 2 min. Rimuovere il surnatante invertendo la piastra. </li><li> Risospendere ogni campione e trasferimento in un volume totale di 300-500 microlitri FACS tampone a 1 ml provette micro o 5 ml tubi a fondo rotondo. </li><li> Campioni eseguito sul citofluorimetro 17. Se i campioni non possono essere eseguite immediatamente, conservare a 4 ° C al riparo dalla luce. </li></ol></li><li> Flusso di preparazione per la colorazione fissato il giorno 13 <ol><li> Risospendere il pellet di cellule in soluzione di fissaggio / permeabilizzazione commerciale per 24 ore a 4 ° C. </li><li> Centrifugare il campione a 455 xg per 5 min. Risospendere in 400 ml soluzione di Perm / Wash. </li><li> Trasferire 200 microlitri del campione (circa 0,5-1 x 10 6 cellule) per twO pozzetti di una piastra a 96 pozzetti (per il controllo IgG e PDX1 / NKX6-1 colorazione). Centrifugare a 931 xg per 2 minuti. </li><li> Risospendere il pellet di cellule in 100 microlitri soluzione di Perm / Wash contenente anti-PDX1 e gli anticorpi di controllo primario o isotipo anti--NKX6-1 (vedi Materiali Tavolo). Incubare per una notte a 4 ° C. </li><li> Centrifugare la piastra a 931 xg per 2 min. Rimuovere il surnatante invertendo la piastra. campioni risospendere in 100 microlitri soluzione di Perm / Wash. </li><li> Centrifugare la piastra a 931 xg per 2 min. Rimuovere il surnatante invertendo la piastra. </li><li> Risospendere i campioni in 100 microlitri Perm / Wash contenenti anticorpi secondari a temperatura ambiente per 1 ora al riparo dalla luce. </li><li> Centrifugare la piastra a 931 xg per 2 min. Rimuovere il surnatante invertendo la piastra. </li><li> campioni risospendere in 100 microlitri Perm Solution / lavaggio. </li><li> Centrifugare la piastra a 931 xg per 2 min. Rimuovere il surnatante invertendo la piastra. </li><li> rappresentantemangiare passo 4.2.9 e 4.2.10. </li><li> Risospendere ogni campione e trasferimento in un volume totale di 300-500 microlitri FACS tampone a 1 ml provette micro o 5 ml tubi a fondo rotondo. </li><li> Campioni eseguito sul citofluorimetro 17. Se i campioni non possono essere eseguite immediatamente, conservare a 4 ° C al riparo dalla luce. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Canadian Diabetes Association. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.diabetes.ca/about-diabetes/types-of-diabetes">http://www.diabetes.ca/about-diabetes/types-of-diabetes</a> (2016).</li>
<li>Cogger, K., Nostro, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+cell+replacement+therapies+for+the+treatment+of+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Recent advances in cell replacement therapies for the treatment of type 1 diabetes.</a> Endocrinology. 156 (1), 8-15 (2015).</li>
<li>Nostro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+NKX6-1%2B+pancreatic+progenitors+from+multiple+human+pluripotent+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines.</a> Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).</li>
<li>Pagliuca, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Functional+Human+Pancreatic+beta+Cells+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of Functional Human Pancreatic beta Cells In Vitro.</a> Cell. 159 (2), 428-439 (2014).</li>
<li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+diabetes+with+insulin-producing+cells+derived+in+vitro+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. , (2014).</li>
<li>Kroon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+endoderm+derived+from+human+embryonic+stem+cells+generates+glucose-responsive+insulin-secreting+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Pancreatic endoderm derived from human embryonic stem cells generates glucose-responsive insulin-secreting cells in vivo.</a> Nat Biotechnol. 26 (4), 443-452 (2008).</li>
<li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+pancreatic+progenitors+into+functional+islets+capable+of+treating+pre-existing+diabetes+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice.</a> Diabetes. 61 (8), 2016-2029 (2012).</li>
<li>D'Amour, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+definitive+endoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm.</a> Nat Biotechnol. 23 (12), 1534-1541 (2005).</li>
<li>Gouon-Evans, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP-4+is+required+for+hepatic+specification+of+mouse+embryonic+stem+cell-derived+definitive+endoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">BMP-4 is required for hepatic specification of mouse embryonic stem cell-derived definitive endoderm.</a> Nat Biotechnol. 24 (11), 1402-1411 (2006).</li>
<li>Jonsson, J., Carlsson, L., Edlund, T., Edlund, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-promoter-factor+1+is+required+for+pancreas+development+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Insulin-promoter-factor 1 is required for pancreas development in mice.</a> Nature. 371 (6498), 606-609 (1994).</li>
<li>Pan, F. C., Wright, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreas+organogenesis%3A+from+bud+to+plexus+to+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Pancreas organogenesis: from bud to plexus to gland.</a> Dev Dyn. 240 (3), 530-565 (2011).</li>
<li>Schaffer, A. E., Freude, K. K., Nelson, S. B., Sander, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nkx6+transcription+factors+and+Ptf1a+function+as+antagonistic+lineage+determinants+in+multipotent+pancreatic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Nkx6 transcription factors and Ptf1a function as antagonistic lineage determinants in multipotent pancreatic progenitors.</a> Dev Cell. 18 (6), 1022-1029 (2010).</li>
<li>Zhou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multipotent+progenitor+domain+guides+pancreatic+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">A multipotent progenitor domain guides pancreatic organogenesis.</a> Dev Cell. 13 (1), 103-114 (2007).</li>
<li>Sander, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeobox+gene+Nkx6.1+lies+downstream+of+Nkx2.2+in+the+major+pathway+of+beta-cell+formation+in+the+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Homeobox gene Nkx6.1 lies downstream of Nkx2.2 in the major pathway of beta-cell formation in the pancreas.</a> Development. 127 (24), 5533-5540 (2000).</li>
<li>Sharow, K. A., Temkin, B., Asson-Batres, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+stability+in+stem+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid stability in stem cell cultures.</a> Int J Dev Biol. 56 (4), 273-278 (2012).</li>
<li>Korytnikov, R., Nostro, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+polyhormonal+and+multipotent+pancreatic+progenitor+lineages+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Generation of polyhormonal and multipotent pancreatic progenitor lineages from human pluripotent stem cells.</a> Methods. , 56-64 (2016).</li>
<li>Baumgarth, N., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+approach+to+multicolor+flow+cytometry+for+immunophenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping.</a> J Immunol Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).</li>
<li>Nostro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage-specific+signaling+through+TGFbeta+family+members+and+WNT+regulates+patterning+and+pancreatic+specification+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Stage-specific signaling through TGFbeta family members and WNT regulates patterning and pancreatic specification of human pluripotent stem cells.</a> Development. 138 (5), 861-871 (2011).</li>
<li>Schulz, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+scalable+system+for+production+of+functional+pancreatic+progenitors+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A scalable system for production of functional pancreatic progenitors from human embryonic stem cells.</a> PLoS One. 7 (5), e37004(2012).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Generando con successo NKX6-1 + progenitori pancreatici da hPSCs in vitro si basa su l&#39;uso di colture di alta qualità di hPSCs e differenziazione diretto che coinvolgono la regolazione precisa delle specifiche vie di segnalazione che regolano principali fasi di sviluppo durante lo sviluppo del pancreas. Sebbene questo protocollo può essere usato per indurre robusta espressione di NKX6-1 attraverso una varietà di linee HPSC come precedentemente indicata 3, per assicurare la...

La prevalenza del diabete è in aumento e, secondo la Canadian Diabetes Association, si stima che oltre 11 milioni di persone in Canada sono diabetici o prediabetici, con il 5-10% di questi individui che hanno il diabete di tipo 1 (diabete di tipo 1) 1. T1D è una malattia autoimmune che è causata dalla distruzione delle cellule beta produttrici di insulina che si trovano all&#39;interno delle isole di Langerhans. Attualmente, le persone che vivono con diabete di tipo 1 richiedono fonti esogene di insulina 2. Nonostante i progressi nella terapia insulinica, i pazienti T1D continuano ad avere un momento difficile che regola i livelli di glucosio nel sangue e continua a soffrire sia ipo e iperglicemia. Una forma promettente trattamento per ripristinare la normoglicemia nel diabete di tipo 1 è l&#39;uso di cellule staminali embrionali umane (hESC), che potrebbero essere utilizzati per generare una quantità illimitata di cellule produttrici di insulina beta sia in vivo che in vitro 3, <sfino class = &quot;xref&quot;&gt; 4, 5, 6, 7. Differenziare hESC ai beta-come le cellule potrebbero rendere possibile lo studio del diabete in vitro, consentendo l&#39;identificazione di nuovi bersagli terapeutici per il diabete di tipo 2 e di fornire cellule per il trapianto in pazienti T1D. Il tentativo più riuscito a generare le cellule produttrici di insulina dalle hESC in vitro è di ricapitolare gli eventi embrionali che si verificano durante lo sviluppo del pancreas 4, 5. Ciò comporta la manipolazione di vie di segnalazione distinti per modellare con precisione le fasi essenziali del pancreas in via di sviluppo. Sviluppo pancreas inizia con l&#39;induzione della endoderma definitiva, che si caratterizza per l&#39;espressione di CXCR4 e CD117 (c-KIT) 8, 9. regolazione precisa della definitorganizzazione endoderma ive è necessaria per la formazione del tubo intestinale, che poi subisce anteriore-posteriore patterning e ventrale-dorsale. La dorsale e gemme pancreatico ventrale emergono dalla regione del foregut posteriori che esprime il gene homeobox pancreatiche e duodenali (Pdx1), che è necessario per lo sviluppo del pancreas 10. Il fusibile dorsale e ventrale gemme per formare il pancreas, che poi viene ampiamente rimodellamento epiteliale e di espansione 11. L&#39;impegno per il sistema endocrino e esocrina lignaggio è accompagnata dalla generazione di cellule progenitrici multipotenti (PPM) che esprimono, tra gli altri, i fattori di trascrizione Pdx1, Nkx6.1 e Ptf1a 12, 13. PPM che diventeranno cellule endocrine e duttali continuano ad esprimere Nkx6-1 riducendo espressione Ptf1a. Contrariamente a questo, le cellule esocrine lignaggio perderanno expression di Nkx6-1 e mantenere Ptf1a espressione 12. Il fattore di trascrizione Nkx6-1 ha un ruolo chiave nello sviluppo del pancreas, in particolare durante la differenziazione delle cellule progenitrici endocrine di beta cellule. Come descritto in precedenza, l&#39;eliminazione di Nkx6-1 risultati in formazione ridotta di cellule beta durante lo sviluppo del pancreas 14. Pertanto, generando cellule ß che producono insulina sia in vitro che in vivo richiede l&#39;induzione efficiente Nkx6-1. Recentemente abbiamo sviluppato un protocollo per generare in modo efficiente Pdx1 + / + NKX6-1 progenitori pancreatici da hPSCs. Questi progenitori pancreatici HPSC-derivati generano cellule beta mature su trapianto in topi immunodeficienti 3. Il protocollo differenziazione può essere diviso in 4 stadi caratteristici di: 1) induzione endoderma definitivo, 2) posteriori foregut patterning, 3) le specifiche del pancreas e 4) l&#39;induzione NKX6-1. Qui forniamo una descrizione dettagliata di ogni fase della differenziazione diretto.

<table><tbody><tr><td><forte>Media e citochine</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-tioglicerina (MTG)</td><td>Sigma</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>Activina A</td><td>R& D</td><td>338-AC/CF&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Acido ascorbico</td><td>Sigma</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>B-27 supplemento</td><td>Life Technologies</td><td>12587-010&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm Buffer</td><td>BD Bioscience</td><td>554722</td><td></td></tr><tr><td>BD Perm/Wash Buffer, 1x</td><td>BD Bioscience</td><td>554723</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R& D</td><td>233-FB</td><td></td></tr><tr><td>CHIR990210</td><td>Tocris</td><td>4423A</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Eagle Medium modificato (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>VWR</td><td>80510-412&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dorsomorfina</td><td>Sigma</td><td>P5499</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>R& D</td><td>236-EG</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Wisent</td><td>88150</td><td></td></tr><tr><td>FGF10</td><td>R& D</td><td>345-FG</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina da pelle suina</td><td>Sigma</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>Glutammina</td><td>Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma</td><td>NO636</td><td></td></tr><tr><td>NOGGIN</td><td>R& D</td><td>3344-NG</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td><td>Life Technologies</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Acido retinoico</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640</td><td>Life Technologies</td><td>11875</td><td></td></tr><tr><td>SANT-1</td><td>Tocris</td><td>1974</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme (1x), rosso fenolo</td><td>Life Technologies</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Antibodies for flow cytometry (diluizioni di lavoro)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD117 PE (1:100)</td><td>Life Technologies</td><td>CD11705</td><td></td></tr><tr><td>CXCR4 APC (1:50)</td><td>BD&nbsp; Bioscienze</td><td>551966</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-topo d'asino (H+L), coniugato Alexa Fluor 647 (1:400)</td><td>Life Technologies</td><td>A-31571</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-capra d'asino (H+L), Alexa Fluor 488 (1:400)&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.</td><td>705-546-147</td><td></td></tr><tr><td>Mouse per il controllo dell'isotipo IgG&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.</td><td>015-000-003</td><td></td></tr><tr><td>Controllo isotipo IgG di capra</td><td>R& D&nbsp; &nbsp;</td><td>AB-108-C</td><td></td></tr><tr><td>NKX6-1 (1:2.000)</td><td>DSHB</td><td>F55A10</td><td></td></tr><tr><td>PDX1 (1:100)</td><td>R& D</td><td>AF2419</td><td></td></tr></tbody></table>

differenziazione efficiente delle pluripotenti cellule staminali per nkx6-1<sup&gt; +</sup&gt; progenitori pancreatici

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

cellule staminali pluripotenti hanno la capacità di auto rinnovarsi e differenziarsi in molteplici linee cellulari, che li rende una fonte interessante per la generazione di cellule progenitrici pancreatiche che può essere utilizzato per lo studio di e futuro trattamento del diabete. Questo articolo descrive un protocollo di differenziazione a quattro stadi progettato per generare cellule progenitrici del pancreas da cellule staminali embrionali umane (hESC). Questo protocollo può essere applicato a un numero di (HPSC) linee di cellule staminali pluripotenti umana. L&#39;approccio adottato per generare cellule progenitrici del pancreas è quello di differenziare hESC per modellare con precisione le fasi chiave dello sviluppo del pancreas. Questo inizia con l&#39;induzione della endoderma definitiva, che si ottiene coltivando le cellule in presenza di Activin A, fattore base di crescita dei fibroblasti (bFGF) e CHIR990210. Ulteriore differenziazione e patterning con fibroblasti fattore di crescita 10 (FGF10) e Dorsomorphin genera cellule simili a foregut posteriore. L&#39;aggiunta di RetinOico, NOGGIN, SANT-1 e FGF10 differenzia le cellule posteriore foregut in cellule caratteristici di endoderma al pancreas. Infine, la combinazione di Epidermal Growth Factor (EGF), nicotinammide e NOGGIN porta alla generazione efficiente di cellule PDX1 + / + NKX6-1. Citometria a flusso viene eseguita per confermare l&#39;espressione di marcatori specifici nelle fasi chiave dello sviluppo del pancreas. I Pdx1 + / + NKX6-1 progenitori pancreatici al termine della fase 4 sono in grado di generare cellule beta mature sul trapianto in topi immunodeficienti e possono essere ulteriormente differenziati per generare cellule che producono insulina in vitro. Così, l&#39;efficiente generazione di PDX1 + / + NKX6-1 progenitori pancreatici, come dimostrato in questo protocollo, è di grande importanza in quanto fornisce una piattaforma per studiare lo sviluppo del pancreas umano in vitro e fornisce una fonte di cellule con il potenziale di differenziazione per le cellule beta che potrebbe eVentually essere utilizzato per il trattamento del diabete.

Generazione efficiente di progenitori pancreatici basa sulla corretta crescita e il mantenimento di cellule indifferenziate seguita dalla precisa aggiunta di specifiche molecole di segnalazione durante il protocollo di differenziazione, come illustrato nello schema di Figura 1A. Il giorno 0, cellule indifferenziate dovrebbe essere 80-95% confluenti e le colonie devono avere bordi definiti (Figura 1A). Durante la fase 1, i media sarà probabilmente apparir...

Qui si descrive un protocollo a 4 stadi per differenziare le cellule staminali embrionali umane per NKX6-1 + progenitori pancreatici in vitro. Questo protocollo può essere applicata ad una varietà di linee di cellule staminali pluripotenti umane.

Differenziazione efficiente delle pluripotenti cellule staminali per NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; progenitori pancreatici

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

L'obiettivo generale di questa procedura è generare in modo efficiente progenitori pancreatici esprimenti NKX6.1 a partire da cellule staminali pluripotenti umane in vitro, differenziando le cellule attraverso quattro stadi chiave dello sviluppo pancreasico. Differenziando le cellule staminali pluripotenti umane attraverso quattro stadi fondamentali dello sviluppo pancreasico, questo protocollo fornisce un modello per studiare lo sviluppo del pancreas umano in vitro. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai protocolli esistenti è la capacità di generare alte percentuali di cellule progenitrici pancreatiche positive per NKX6.1 utilizzando diverse linee cellulari di cellule staminali pluripotenti umane.Dato che i progenitori pancreatici hanno la capacità di generare cellule simili a cellule beta produttrici di insulina, questa tecnica ci offrirà l'opportunità di sviluppare cellule per il trattamento del diabete, per la scoperta di farmaci e per la modellizzazione delle malattie. Al giorno zero, iniziare la differenziazione sostituendo il mezzo contenente il sostituto sierico KnockOut con il mezzo di differenziazione del giorno zero. Successivamente, ai giorni uno e due, agitare delicatamente la piastra per rimuovere eventuali cellule morte dal monostrato prima di aspirare il mezzo.In seguito, sostituirlo con il mezzo di differenziazione del primo o secondo giorno. Al terzo giorno, raccogliere le cellule per la citometria a flusso. Se le cellule esprimono più del 90% di CXCR4 e CD117, l'efficienza è stata raggiunta.Quindi agitare delicatamente la piastra per rimuovere eventuali cellule morte dal monolayer prima dell'aspirazione e sostituire con il mezzo di differenziazione del giorno tre-cinque. È importante verificare un'efficiente induzione dell'endoderma definitivo entro il giorno tre mediante citometria a flusso. Se la percentuale di cellule che esprimono sia CXCR4 che CD117 è inferiore al 90%, la differenziazione in progenitori pancreatici sarà probabilmente compromessa.Nel sesto e settimo giorno, sostituire il mezzo con il mezzo di differenziazione per i giorni sei e sette. Negli ottavo, decimo e dodicesimo giorno, sostituire il mezzo con il mezzo di differenziazione per i giorni otto e dodici. Quindi, al tredicesimo giorno, raccogliere le cellule per la citometria a flusso al fine di determinare l'espressione di PDX1 e NKX6.1.Per raccogliere le cellule per l'analisi mediante citometria a flusso, dissociare le cellule utilizzando una soluzione commerciale di tripsina seguendo il protocollo del produttore e incubare le cellule a 37 gradi Celsius per tre minuti. Trascorsi tre minuti, rimuovere la soluzione di tripsina e risospendere le cellule singole in 1.000 microlitri di buffer fax con 30 microlitri di DNA One. Quindi filtrare le cellule attraverso un filtro in nylon da 35 micrometri e trasferirle in una provetta per microcentrifuga.Centrifugare le cellule a 455 volte g per cinque minuti prima di prepararle per la colorazione vitale o fissata. Ri-sospendere ora le cellule in 1.000 microlitri di buffer fax. Trasferire 200 microlitri in due pozzetti di una piastra a 96 pozzetti sia per i campioni non colorati che per quelli colorati.In seguito, centrifugare la piastra a 931 ×g per due minuti, quindi rimuovere il soprannatante capovolgendo la piastra, colorare le cellule con l'anticorpo primario coniugato in un volume finale di 100 microlitri per 30 minuti a temperatura ambiente e proteggere dalla luce. Successivamente, centrifugare la piastra a 931 ×g per due minuti, dopo due minuti rimuovere il soprannatante capovolgendo la piastra. In seguito, risospendere i campioni in 100 microlitri di buffer fax.Quindi centrifugare la piastra a 931 ×g per due minuti ed eliminare il soprannatante capovolgendo la piastra. Successivamente, risospendere i campioni in 300-500 microlitri di buffer fax, trasferirli in provette microcentrifuga da un millilitro o in provette rotonde da cinque millilitri e analizzare i campioni mediante citometria a flusso.Se i campioni non possono essere analizzati immediatamente, conservarli a quattro gradi Celsius e proteggerli dalla luce. In questo procedimento, risospendere il pellet cellulare in soluzione di fissazione e permeabilizzazione commerciale per 24 ore a quattro gradi Celsius. Dopo 24 ore, centrifugare il campione a 455 ×g per cinque minuti, quindi risospendere il pellet in 400 microlitri di soluzione perm wash commerciale.Successivamente, trasferire 200 microlitri del campione in due pozzetti di una piastra a 96 pozzetti per il controllo IGG e la colorazione di PDX1 e NKX6.1, quindi centrifugare la piastra a 931 ×g per due minuti. Successivamente, risospendere i pellet cellulari in 100 microlitri di soluzione di permeabilizzazione e lavaggio commerciale contenente gli anticorpi primari anti-PDX1 e anti-NKX61 o gli anticorpi di controllo isotopici. Incubare il tutto durante la notte a quattro gradi Celsius.Il giorno successivo, centrifugare la piastra a 931 ×g per due minuti, rimuovere il soprannatante capovolgendo la piastra e risospendere i campioni in 100 microlitri di soluzione di permeabilizzazione e lavaggio commerciale. Successivamente, centrifugare nuovamente la piastra a 931 ×g per due minuti. Rimuovere il soprannatante capovolgendo la piastra.Quindi risospendere i campioni in 100 microlitri di soluzione di permeabilizzazione e lavaggio contenente l'anticorpo secondario a temperatura ambiente per un'ora, proteggendo dalla luce. Dopo un'ora, centrifugare la piastra a 931 ×g per due minuti, quindi rimuovere il soprannatante capovolgendo la piastra; successivamente, risospendere i campioni in 100 microlitri di soluzione di permeabilizzazione e lavaggio commerciale, centrifugare nuovamente la piastra a 931 ×g per due minuti ed eliminare il soprannatante capovolgendo la piastra. Quindi, risospendere il campione in 100 microlitri di soluzione di permeabilizzazione e lavaggio commerciale e centrifugare la piastra a 931 ×g per due minuti prima di rimuovere il soprannatante.Successivamente, risospendere i campioni in 300-500 microlitri di buffer per fax e trasferirli in provette separate da un millilitro o in provette rotonde da cinque millilitri per l'analisi in citometria a flusso. Qui viene mostrato uno schema dell'induzione di progenitori pancreatici da cellule staminali embrionali umane, che indica il giorno di differenziamento, lo stadio di sviluppo, il mezzo basale e le citochine aggiunte a ogni stadio. Ecco invece le immagini a contrasto di fase nei principali stadi del differenziamento pancreatico.Le cellule H1 sono state differenziate secondo il protocollo di differenziazione in quattro fasi illustrato. Con cellule staminali embrionali umane indifferenziate al giorno zero, endoderma definitivo alla fase uno, intestino posteriore alla fase due, endoderma pancreatico alla fase tre ed endoderma pancreatico progenitore positivo per NKX6.1 alla fase quattro. Questa figura mostra i grafici rappresentativi della citometria a flusso al giorno tre per la colorazione con gli anticorpi CXCR4 PE e CD117 APC.Ecco il campione non colorato e qui il campione colorato. Questa figura mostra i grafici rappresentativi della citometria a flusso al giorno 13 per le cellule progenitrici pancreatiche derivate allo stadio quattro che esprimono NKX61 e PDX1. Questo è il controllo IGG e questo è il campione colorato.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 13 giorni. Tuttavia, questo periodo può variare a seconda della linea cellulare utilizzata. Durante il tentativo di questa procedura, è importante testare tutti gli agenti a causa della variabilità tra un lotto e l'altro.Dopo aver seguito la procedura, le cellule progenitrici pancreatiche positive per NKX6.1 possono essere ulteriormente differenziate in cellule simili ai beta produttrici di insulina utilizzando altri protocolli pubblicati. Questo fornisce una piattaforma per lo studio della maturazione e dello sviluppo delle cellule beta in vitro. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come differenziare in modo efficiente le cellule staminali pluripotenti umane in progenitori pancreatici, guidando le cellule attraverso quattro stadi chiave dello sviluppo.

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Questo video dimostra la generazione di cellule progenitrici neurali da cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) non transgeniche e transgeniche. Le hPSC sono differenziate in cellule progenitrici neurali utilizzando un mezzo di differenziazione neuronale. Mentre la differenziazione è indotta nelle cellule non transgeniche utilizzando piccole molecole, le hPSC transgeniche vengono differenziate aggiungendo un antibiotico che induce il promotore di un fattore di trascrizione specifico per la...

Differenziazione di cellule staminali pluripotenti umane non transgeniche e transgeniche in cellule progenitrici neurali

Qui, si descrive un metodo per la purificazione delle cellule staminali embrionali differenziate umane che si sono impegnati verso l'endoderma definitivo per il miglioramento delle applicazioni a valle e ulteriori differenziazioni.

Un metodo rapido ed efficace per la purificazione delle cellule endoderma generato da cellule staminali embrionali umane

Protocolli per generare linee mutanti HPSC che utilizzano la piattaforma iCRISPR e di differenziare hPSCs in cellule beta-come il glucosio-reattiva sono descritti. La combinazione di tecnologia di editing genoma con differenziazione HPSC-diretto fornisce una piattaforma potente per l'analisi sistematica del ruolo dei determinanti lignaggio nello sviluppo umano e la progressione della malattia.

Genome Editing e di differenziazione Regia di hPSCs per interrogare determinanti Lineage in Sviluppo Umano del pancreas

Questo protocollo descrive un metodo per la generazione di corticale Interneurone progenitori e precursori post-mitotici Interneurone da cellule staminali embrionali di topo usando un metodo modificato embryoid corpo-a-monostrato. Questi progenitori/precursori possono essere usati in vitro o fluorescente ordinati e trapiantate nel neocortex neonatale per lo studio della determinazione di destino o usati in applicazioni terapeutiche.

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Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per differenziare cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs) in proteina di pancreas/duodeno homeobox 1+ (PDX1+) cellule per la generazione dei lignaggi del pancreas basano sulla crescita di monostrato di tipo non-Colonia di dissociato singole cellule. Questo metodo è adatto per la produzione di cellule derivate da hPSC omogenee, manipolazione genetica e di screening.

Efficiente generazione di Pancreas/duodeno Homeobox Protein 1+ posteriore del Foregut/pancreatico progenitori da hPSCs nelle culture di adesione

Questo protocollo descrive in dettaglio un metodo monostrato e privo di siero-per generare in modo efficiente cellule simili a epatociti da cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) in 18 giorni. Ciò comporta sei passaggi in quanto gli hPSC si differenziano in sequenza in tipi di cellule intermedie come la striscia primitiva, l'endoderma definitivo, il foregut posteriore e i progenitori del germoglio epatico prima di formare cellule simili a epatociti.

Differenziazione efficiente delle cellule staminali pluripotenti umane nelle cellule del fegato

In questo protocollo, descriviamo una strategia di differenziazione stabile e altamente efficiente per la generazione di neuroni simpatici postganglionici dalle cellule staminali pluripotenti umane. Questo modello renderà i neuroni disponibili per l'uso di studi di disturbi autonomici multipli.

Differenziazione efficiente dei neuroni simpatici postganglionici utilizzando cellule staminali pluripotenti umane in condizioni di coltura senza alimentatore e definite chimicamente

L'obiettivo di questo articolo è quello di fornire un approccio standardizzato per indurre la differenziazione del progenitore epatico umano dalle cellule staminali pluripotenti. Lo sviluppo di questa procedura con formulazioni di media pronti all'uso offre all'utente un sistema facile per generare cellule epatiche umane per la ricerca e la traduzione biomedica.

Specifica del progenitore epatico da cellule staminali pluripotenti utilizzando un sistema di differenziazione definito

Il presente protocollo descrive un metodo potenziato per aumentare la co-espressione dei fattori di trascrizione PDX1 e NKX6.1 nei progenitori pancreatici derivati da cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) in monostrati planari. Ciò si ottiene reintegrando la matrice fresca, manipolando la densità cellulare e dissociando le cellule endodermiche.

Differenziazione di cellule staminali pluripotenti umane in precursori di cellule beta pancreatiche in un sistema di coltura 2D

La differenziazione delle cellule staminali in cellule insulari fornisce una soluzione alternativa al trattamento convenzionale del diabete e alla modellizzazione della malattia. Descriviamo un protocollo dettagliato di coltura di cellule staminali che combina un kit di differenziazione commerciale con un metodo precedentemente convalidato per aiutare a produrre isole derivate da cellule staminali secernenti insulina in un piatto.

Differenziazione di cellule staminali pluripotenti umane in gruppi di isole produttrici di insulina

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Protocollo ottimizzato per la generazione di cellule pancreatiche funzionali secernenti insulina da cellule staminali pluripotenti umane

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Differenziazione efficiente delle pluripotenti cellule staminali per NKX6-1

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