Name: Intracellulare colorazione e citometria a flusso per lidentificazione dei linfociti sottoinsiemi allinterno murino Aorta, rene e linfonodi in un modello di ipertensione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Impara a identificare i sottoinsiemi di linfociti T nel rene, nell'aorta e nei linfonodi murini mediante colorazione intracellulare e citometria a flusso. Questo metodo consente l'analisi delle risposte immunitarie nell'ipertensione indotta da angiotensina II.

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Questo lavoro è stato sostenuto da un&#39;associazione Fellowship Award American Heart (16POST29950007) per FL, una borsa di formazione da parte del National Institutes of Health (NIH T32 HL069765) a BLD, un&#39;associazione Fellowship Award American Heart (14POST20420025) per MA Saleh, e di un NIH premio K08 (HL121671) per MSM. MSM è anche supportato da un assegno di ricerca da Gilead Sciences, Inc.

Comitato Cura e uso istituzionale degli animali del Vanderbilt University ha approvato le procedure descritte nel presente documento. I topi sono alloggiati e curati in conformità con la guida per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio (National Academies Press. Revised 2010). 1. L&#39;isolamento della Drenante aortica linfonodi, reni e aorta di topi <ol><li> Euthanize i topi da CO 2 inalazione. Spruzzare il petto con il 70% di etanolo e aprire con cautela la pelle e la parete toracica con le forbici per esporre il cuore. </li><li> Per profumato la vascolarizzazione, eseguire una piccola incisione nell&#39;atrio destro e costantemente iniettare almeno 10 ml di PBS freddo (circa 1 ml / sec) nella all&#39;apice del ventricolo sinistro con un ago 21 G o 23. Profumato fino a quando tutti gli organi sono scottati. Il cuore blanches prima. Imbiancamento del fegato indica che la perfusione è stata ben eseguita. </li><li> Utilizzando piccole pinze e forbici sottili, delicatamente tagliare ed estrarre l&#39;intestino,stomaco, milza, pancreas e del fegato per visualizzare meglio l&#39;aorta. NOTA: Questa operazione deve essere effettuata con estrema precisione come danni al tratto gastrointestinale può indurre contaminazione. </li><li> Tagliare e rimuovere ogni polmone con le forbici. Risciacquare la cavità toracica con tampone fosfato (PBS) con una siringa senza ago. Rimuovere il sangue in eccesso e di liquidi utilizzando garza sterile. </li><li> Rimuovere i nodi dell&#39;aorta addominale drenanti linfatici utilizzando dissettore sottili. Assicurarsi di non rompere la capsula. Rimuovere il grasso che rimane sulla superficie di ogni linfonodo con le pinze dissezione. Tagliare i due reni con forbici sottili. </li><li> Sezionare l&#39;intero dell&#39;aorta (aorta toracica e addominale) con sottili, forbici curve. Inizia a livello del cuore e con attenzione sezionare dalla esofago e le vertebre fino al livello della biforcazione iliaca evitando di mettere il grasso circostante perivascolare attaccata all&#39;aorta. NOTA: Ulteriore dissezione dell&#39;aorta Remove strutture circostanti possono essere fatte al microscopio. In particolare, rimuovere rami arteriosi (arterie carotidi, arterie succlavia, celiaci, mesenterici, e arterie renali) e linfonodi. Non tenere uno strato consistente di grasso perivascolare attorno ad ogni aorta dal momento che questo è un sito dove molte cellule infiammatorie risiedono nella cornice di ipertensione. Mettere ogni tessuto in provette separate contenenti PBS freddo. </li></ol> 2. Generazione di sospensioni singola cellula da ogni tessuto <ol><li> i reni NOTA: Il rene può essere dissociata in una sospensione singola cella mediante la combinazione di dissociazione meccanica più digestione enzimatica. <ol><li> Preparare la soluzione di digestione renale aggiungendo collagenasi D (2 mg / ml) e DNasi I (100 ug / ml) di terreno RPMI 1640 (integrato con siero fetale bovino al 5% (FBS)). Preparare 10 ml per campione di rene. </li><li> Utilizzare pinze per trasferire i due reni in un tubo di dissociazione contenente 10 ml di rene digeriresoluzione di ioni. </li><li> Eseguire la dissociazione meccanica utilizzando un dispositivo dissociatore semi-automatico in base alle istruzioni del produttore. </li><li> Dopo la dissociazione meccanica, staccare il tubo dal dispositivo ed eseguire la digestione enzimatica. Incubare i campioni per 20 min a 37 ° C sotto rotazione continua. fermare immediatamente la digestione enzimatica con l&#39;aggiunta di freddo medie RPMI 1640 supplementato con 5% FBS. </li><li> Trasferire la soluzione pipettando in un tubo conico da 50 ml dopo che filtra attraverso un colino 40 micron. Tease il tessuto rimanente parte premendo con lo stantuffo di una siringa da 1 ml. Agglomerare le cellule (500 XG, 8 min, 4 ° C). </li><li> Risospendere il pellet in 3 ml di 36% mezzi centrifugazione in gradiente di densità. Trasferire la sospensione in una provetta conica da 15 ml. Delicatamente aggiungere 3 ml di 72% dei media gradiente di densità di centrifugazione sotto la sospensione cellulare 3 ml di 36% senza alcuna interruzione. Centrifuga (1.000 xg senza freno, 20 min, 4 ° C). &lt;/ Li&gt; <li> Le cellule immunitarie saranno posizionati all&#39;interfaccia. Rimuovere lo strato più alto giallastro contenente detriti cellulari e quindi portare il volume fino a 15 ml con PBS freddo. Agitare bene per rottura del gradiente. Spin le cellule (300 XG, 8 min, 4 ° C) e risospendere il pellet in 3 ml di RPMI con il 5% FBS. Contare il numero di cellule vive su un emocitometro utilizzando trypan blu. </li></ol></li><li> L&#39;aorta <ol><li> Preparare la soluzione di digestione aorta aggiungendo collagenasi A (1 mg / ml), collagenasi B (1 mg / ml), e DNasi I (100 ug / ml) di terreno RPMI 1640 (integrato con il 5% FBS). </li><li> Utilizzando una pinza sottile, trasferire l&#39;aorta in una provetta 2 ml contenente 1 ml di soluzione dell&#39;aorta digestione. Tritare l&#39;intera aorta in pezzi molto piccoli con le forbici sottili nella soluzione di digestione 1 ml. Tenere in ghiaccio. Incubare i campioni per 30 minuti a 37 ° C sotto rotazione continua. </li><li> Trasferire la soluzione in un piatto di coltura di tessuti e fermare la Enzymadigestione tic aggiungendo 5 volte il volume del freddo RPMI con 5% FBS. </li><li> Trasferire la soluzione pipettando in un tubo conico da 50 ml dopo che filtra attraverso un colino 40 micron. Tease il tessuto rimanente parte in una sospensione singola cella premendo con lo stantuffo di una siringa da 1 ml. Lavare il filtro e agglomerare le cellule (300 XG, 8 min, 4 ° C). </li><li> Lavare il pellet aggiungendo 10 ml di RPMI con 5% FBS. Spin le cellule (300 XG, 8 min, 4 ° C) e risospendere il pellet in 3 ml di RPMI con il 5% FBS. Contare il numero di cellule vive su un emocitometro utilizzando trypan blu. </li></ol></li><li> I aortici linfonodi drenanti <ol><li> Collocare un filtro 40 micron in un piatto di coltura di tessuti (60 mm x 15 mm). Posizionare i linfonodi sul filtro e li prendere in giro a parte in una sospensione singola cella premendo con lo stantuffo di una siringa da 1 ml. Lavare il filtro con 2 ml di RPMI con il 5% FBS. Raccogliere le cellule nel piatto. </li><li> Trasferimentole cellule in una provetta da 15 ml falco e agglomerare le cellule (300 XG, 8 min, 4 ° C). Risospendere il pellet in 500 ml di RPMI con 5% FBS. Contare il numero di cellule vive su un emocitometro utilizzando trypan blu. </li></ol></li></ol> 3. Ex Vivo Stimolazione per citochine rilevamento mediante citometria di flusso <ol><li> Preparare il mezzo di coltura: RPMI con 5% FBS, 0,1 mM di aminoacidi non essenziali, 50 mM β-mercaptoetanolo e 1% di penicillina / streptomicina. </li><li> Centrifugare ogni sospensione cellulare ottenuta dai nodi reni, aorta e linfatici (300 xg, 8 min, 4 ° C). Risospendere ogni pellet con il mezzo di coltura ad una concentrazione di 1 x 10 6 cellule per ml. </li><li> Stimolare le cellule con l&#39;aggiunta di 2 ml di cocktail di attivazione delle cellule (contenente Phorbol 12-Myristate 13-acetato (PMA), il ionomicina ionoforo del calcio, e l&#39;inibitore Golgi brefeldina a) per ogni 1 ml di coltura cellulare. NOTA: La concentrazione finales di ogni componente sono: 81 nM di PMA, 1,33 micron di ionomicina e 5 mg / ml di brefeldin A. Il trattamento con PMA e ionomicina attiva le cellule per la produzione di citochine. Le citochine sono secreti proteine ​​che devono essere intrappolati nelle celle da rilevare. Brefeldina a causa l&#39;accumulo di proteine ​​secrete normalmente nell&#39;apparecchiatura reticolo endoplasmatico e Golgi. Pertanto, la tecnica qui descritta migliora la rilevabilità dei linfociti producenti citochine mediante citometria di flusso. </li><li> Piastra 1 a 2 milioni di cellule in un 12-pozzetti (aorta o renali) o 24 pozzetti (linfonodi) piastre a bassa aderenza. Porre la piastra in un 37 ° C umidificata CO 2 incubatore per 3 ore. NOTA: Il numero di cellule placcato può essere inferiore nei linfonodi di topi di controllo. Inoltre, il tempo di stimolazione deve essere determinato empiricamente per ciascuna popolazione cellulare e citochine studiate. Nel caso di cellule T isolate da nodi aorta, reni o linfatici, si consiglia di stimolante per 3-4 ore. Una più lunga stimolazione wmalato non aumentare la secrezione di citochine e indurrà un ulteriore down-regulation di diversi marcatori di superficie delle cellule T come CD3, CD4 e CD8. (Si noti che anche una stimolazione 3-4 ore indurrà alcuni down-regulation di questi marcatori.) </li></ol> La colorazione 4. Superficie <ol><li> Trasferire le cellule in una provetta di polistirene FACS e centrifugare (300 xg, 8 min, 4 ° C). Lavare le cellule due volte con tampone FACS (Ca 2+ e Mg + free PBS contenente 4% FBS e 2 mM EDTA) e dividere la sospensione cellulare equamente in diversi tubi FACS base al numero di pannelli di anticorpi desiderate e il numero dei tubi di controllo necessari ( vedi sotto). </li><li> Per eseguire la compensazione per ogni pannello, preparare i tubi di controllo non colorati e singoli tubi colorati per ogni tipo di tessuto e il pannello di anticorpi. Inoltre, preparare tubi fluorescenza meno uno (FMO) controllo per ciascun pannello anticorpi sommando tutti tranne uno degli anticorpi. </li><li> Regolare il volume di ciascuna provetta a 2 ml con FACSBuffer. Centrifugare la sospensione cellulare (300 xg, 8 min, 4 ° C), rimuovere i recettori surnatante e blocco Fc incubando le cellule con 0,5 ug di anticorpi anti-CD16 / CD32 per milione di cellule per 10 min in ghiaccio. NOTA: CD16 è bassa affinità IgG Fc recettore III (CFR III) e CD32 è FcR II. CD16 / CD32 sono espressi su granulociti, mastociti, monociti / macrofagi, le cellule natural killer, linfociti B, cellule dendritiche e alcune cellule mature T attivate. </li><li> Eseguire la vitalità colorazione: Lavare le cellule con PBS 1x, centrifuga (300 xg, 8 min, 4 ° C) e risospendere in 1.000 ml di PBS 1x. Aggiungere 1 ml di una ammina-reattiva colorante (macchia la vitalità delle cellule)-impermeant. Incubare per 15 minuti a 4 ° C al riparo dalla luce. </li><li> Durante l&#39;incubazione, preparare il cocktail di anticorpi (per la colorazione superficiale) in un volume adeguato di tampone FACS. Lavare le cellule due volte con 1-2 ml di tampone FACS, centrifuga (300 xg, 8 min, 4 ° C) e risospendere ogni pellet con 100 microlitridella miscela di anticorpi. Incubare per 30 min a 4 ° C al riparo dalla luce. NOTA: per ogni flusso citometria anticorpo, è utile per determinare la quantità ottimale di anticorpo necessaria una curva di titolazione della dose. </li><li> Lavare le cellule due volte con 2 ml di tampone FACS e agglomerare le cellule (300 XG, 8 min, 4 ° C). </li></ol> 5. fissazione, permeabilizzazione e intracellulare colorazione <ol><li> Eseguire la colorazione intracellulare con un kit di fissaggio e permeabilizzazione contenente tamponi appropriati seguendo le istruzioni del produttore. Fissare e permeabilize le cellule da essi risospendere in tampone appropriato. Incubare i campioni per 40 minuti a 4 ° C al riparo dalla luce. </li><li> Aggiungere 1 ml di 1x permeabilizzazione e tampone di lavaggio direttamente alle cellule fisse e permeabilizzate. Centrifuga (500 xg, 8 min, 4 ° C) e rimuovere il surnatante. Risospendere il pellet con 2 ml di tampone di lavaggio 1X. </li><li> Preparare le miscele di ANTIBodies (solo per la colorazione intracellulare) in un volume adeguato di tampone di lavaggio 1x (di solito 100 ml per provetta). NOTA: Come descritto in precedenza, la concentrazione ottimale di anticorpi deve essere determinato per ciascun anticorpo nel pannello. Ad esempio, per gli anticorpi anti IL-17A o IL-17F, usiamo un fattore di diluizione di 1:30, ma per gli anticorpi anti IFNγ e T-bet, si usa un fattore di diluizione di 1: 100. </li><li> Centrifugare le cellule (500 xg, 8 min, 4 ° C) e risospendere ogni pellet con 100 microlitri della miscela di anticorpi. Incubare per 40 minuti a 4 ° C al riparo dalla luce. </li><li> Lavare le cellule due volte con 2 ml di tampone di lavaggio 1x e agglomerare le cellule (500 XG, 8 min, 4 ° C). Risospendere il pellet con 300 ml di soluzione di lavaggio 1x e analizzare su un citofluorimetro con filtri appropriati. </li><li> Per la quantificazione del numero totale di cellule per campione di tessuto, utilizzare conteggio sfere. Prima di acquisizione, aggiungere il volume / numero consigliato di contare perle ad ogni provetta. </li></ol> 6. compensazione, gate, la normalizzazione, e suggerimenti <ol><li> Compensazione e gating <ol><li> provette di controllo Run non colorati e singole macchiati di risarcimento per regolare per sovrapposizione spettrale. NOTA: L&#39;uso di sfere di compensazione piuttosto che i controlli di compensazione a base di cellule è necessaria nei casi in cui è presente a livelli così bassi che la compensazione utilizzando cellule sarà difficile l&#39;antigene di interesse o popolazione di cellule in un campione. Anche di nota, quando si utilizza coloranti tandem, è consigliabile preparare compensazioni per ogni esperimento da coloranti tandem variano da lotto a lotto e con ogni giorno. </li><li> Eseguire fluorescenza meno uno dei controlli (QOR) per tutti i fluorofori nel pannello quando si inizia un nuovo esperimento multicolore. NOTA: I controlli FMO sono campioni che contengono tutti gli anticorpi nel pannello ad eccezione di uno. Questi controlli consentono una discriminazione accurata dei positiva rispetto segnali negativi per l&#39;anticorpo omesso di adjus correttamentet i cancelli. Questi controlli sono particolarmente importante quando i livelli di espressione sono bassi o quando la separazione della popolazione bersaglio è povero (ad esempio, quando il bersaglio è una citochina o fattore di trascrizione). Anche se non sempre necessario, in alcuni casi, i controlli isotipo possono essere preferiti in luogo di FMO controlla quanto forniscono un&#39;adeguata compensazione per isotipo dell&#39;anticorpo e fluoroforo reagenti con la specificità dell&#39;antigene. </li><li> Impostare la porta principale: regolare Forward Scatter Area (FSC-A) e Side Scatter Area (SSC-A) di tensione al fine di individuare la popolazione leucocitaria. </li><li> Escludere le cellule morte. NOTA: La macchia redditività reagisce con ammine liberi presenti sia sulla superficie e all&#39;interno delle cellule. In contrasto a vivere cellule, le cellule morte (con membrane compromessi) permettono il colorante di entrare nel citoplasma, aumentando la quantità di etichettatura proteine. Così, le cellule morte saranno più luminoso di cellule vive che permettono facile discriminazione. Porta sul vivocellule. NOTA: La vitalità delle sospensioni cellulari dalla aorta e rene può essere inferiore alla vitalità delle sospensioni cellulari da linfonodi a causa della fase di digestione aggiuntivo. </li><li> Trama Forward Scatter Area (FSC-A) [asse y] e Forward Scatter Altezza (FSC-H) [asse x]. Canottiere appaiono come una diagonale su questo terreno dot. Porta su questa diagonale per escludere doppietti. Poi tracciare SSC-A [y] e CD45 [asse x]. </li><li> La popolazione CD45 + leucociti può essere facilmente identificato. Porta su questa popolazione. popolazioni successive possono essere identificate da questa popolazione. </li></ol></li><li> La normalizzazione della conta delle cellule <ol><li> conteggio sfere hanno caratteristiche che si traducono in bassa SSC FSC e alto. Ad esempio, se 50.000 perle sono aggiunti in 300 microlitri della sospensione cellulare singolo, l&#39;equazione per il calcolo del numero assoluto di qualsiasi dato tipo di cellula per provetta è il seguente: Numero di celle ptubo di ER = (50.000 / numero di perline contati dal citofluorimetro) x numero di cellule contate. Usando questo calcolo, il numero assoluto di un dato tipo di cellula per provetta può essere determinato. Sulla base di quante tubi sono stati generati da ogni organo, il numero di cellule per organo può essere calcolato. NOTA: Tenere tutte le cellule e reagenti a 4 ° C durante il protocollo. Evitare vortex vigorosa perché può danneggiare le cellule. Utilizzare le forze minime per agglomerare le cellule. Evitare di fare bolle nel tubo FACS dal momento che può precipitare la morte delle cellule. Non lasciate che il pellet asciugare in qualsiasi momento. </li></ol></li></ol>

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MSM è sostenuto da una sovvenzione da Gilead Sciences cardiovascolari.

Il protocollo qui descritto è stato ottimizzato per identificare correttamente i sottogruppi di cellule T presenti all'interno di reni, aorta e linfonodi murini. Questo protocollo può essere facilmente adattato per esaminare altri sottogruppi di cellule immunitarie come i linfociti B e le cellule immunitarie innate e può essere modificato per includere altri tipi di tessuto. La fase di digestione è fondamentale e deve essere modificata e ottimizzata per ogni tessuto9. Una fase di digestione prolungata o l'uso ...

Recenti evidenze dimostra che il sistema immunitario adattativo, in particolare i linfociti T, giocano un ruolo fondamentale nello sviluppo di diverse malattie cardiovascolari 1,2,3,4,5. Ad esempio, nel modello di angiotensina II ipertensione indotta, un accumulo di cellule T nei vasi e nei reni dei topi è stato descritto 6. L&#39;accumulo vascolare è prevalentemente nel avventizia e il grasso perivascolare. Nel rene, cellule T accumulano sia midollo e corteccia renale. A seconda di quale sottoinsieme è coinvolto, queste cellule T danno luogo a diverse citochine che possono influenzare la funzione vascolare e renale e portare allo sviluppo della patologia (recensione da McMaster et al. 6). Linfociti T helper CD4 + possono essere suddivisi in diversi sottogruppi: cellule (TFH) T helper 1 (Th1), Th2, Th9, Th17, Th22, regolatori (Treg), le cellule T, e T helper follicolare in base alle loro funzioni e la firma citokines 7. Allo stesso modo, le cellule CD8 + T citotossici possono essere classificati come Tc1, Tc2, TC17 o TC9 8. Ci sono anche doppie cellule T negative (cioè le cellule che non esprimono CD4 o marcatori cellulari T CD8). Un sottoinsieme di queste cellule possiedono una gamma delta recettore delle cellule T alternativo (al posto dei classici alfa e beta recettori) e sono quindi indicato come cellule T gamma delta. L&#39;analisi multi-parametro mediante citometria di flusso del marcatore di superficie, citochine e fattori di trascrizione costituisce l&#39;approccio migliore per identificare queste cellule. Anche se questo metodo è ampiamente usato nel campo della immunologia, è meno ben descritto in organi solidi e nel contesto delle malattie cardiovascolari. Storicamente, l&#39;identificazione dei linfociti nei tessuti era limitato a immunoistochimica o approcci RT-PCR. Sebbene immunoistochimica e immunofluorescenza sono metodi efficaci per determinare la distribuzione tissutale di un antigene di interest, essi sono inadeguati per identificare fenotipicamente i sottoinsiemi coinvolti. Inoltre, mentre l&#39;analisi RT-PCR è utile per rilevare l&#39;espressione mRNA di antigeni, citochine o fattori di trascrizione, non permette la rilevazione di più proteine ​​simultaneamente a livello delle singole cellule. L&#39;avvento della citometria a flusso, specialmente se combinata con la colorazione intracellulare per rilevare citochine e fattori di trascrizione, fornisce gli investigatori con una tecnica potente che permette l&#39;identificazione e la quantificazione a livello di singola cellula di sottoinsiemi di cellule immunitarie in organi solidi. Abbiamo ottimizzato un test colorazione intracellulare per identificare mediante citometria di flusso principali sottogruppi di cellule T presenti nel rene murino, aorta e aortici linfonodi drenanti in un modello di angiotensina II ipertensione indotta. L&#39;ottimizzazione di ogni fase: la digestione dei tessuti, ex vivo di attivazione, permeabilizzazione, e la superficie e risultati di colorazione intracellulare in un grande retest producibile che può essere applicato ad altri modelli di malattie cardiovascolari e renali.

<table><tbody><tr><td>Collagenasi D</td><td>ROCHE</td><td>11088882001</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi A</td><td>ROCHE</td><td>10103586001</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi B</td><td>ROCHE 11088815001</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dnase</td><td>ROCHE</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>1x tampone per lisi di globuli rossi</td><td>eBioscience</td><td>00-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Medium 1614 1x</td><td>Gibco</td><td>11835-030</td><td></td></tr><tr><td>DPBS senza calcio e magnesio</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5445-02</td><td>Per centrifugazione in gradiente di densità</td></tr><tr><td>GentleMACS&trade; Tubo C</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-334</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo dissociatore GentleMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td>Utilizzare il programma SPLEEN_04</td></tr><tr><td>Cocktail di attivazione cellulare (con Brefeldin A)</td><td>Biolegend</td><td>423303</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD16/32</td><td>eBioscience</td><td>14-0161-81</td><td>diluito 1:100</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD kit di colorazione per cellule morte viola riparabile</td><td>Life Technologies</td><td>L34955</td><td></td></tr><tr><td>Set di tamponi per fattori di trascrizione</td><td>BD Pharmingen</td><td>562725</td><td></td></tr><tr><td>OneComp eBeads&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>01-1111-42</td><td></td></tr><tr><td>123 count eBeads</td><td>eBioscience</td><td>01-1234-42</td><td></td></tr><tr><td>CD45 AmCyan (clone 30-F11)</td><td>BioLegend</td><td>103138</td><td></td></tr><tr><td>CD3 PerCP-Cy5.5 (clone 17A2)</td><td>BioLegend</td><td>100218</td><td></td></tr><tr><td>IL-17A FITC (clone TC11-18H10.1)</td><td>BioLegend</td><td>506910</td><td></td></tr><tr><td>IL-17F APC (clone 9D3.1C8)</td><td>BioLegend</td><td></td><td></td>517004</tr><tr><td>CD4 APC-Cy7 (clone GK1.5)</td><td>BD Biosciences</td><td>560181</td><td></td></tr><tr><td>CD8 APC (clone 53-67)</td><td>eBioscience</td><td>17-0081-82</td><td></td></tr><tr><td>T-bet PE-Cy7 (clone 4B10)</td><td>BioLegend</td><td>644823</td><td></td></tr><tr><td>IFN&gamma; FITC (clone XMG1.2)</td><td>BD Biosciences</td><td>557724</td><td></td></tr></tbody></table>

intracellulare colorazione e citometria a flusso per l&#39;identificazione dei linfociti sottoinsiemi all&#39;interno murino aorta, rene e linfonodi in un modello di ipertensione

Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension

È ormai noto che i linfociti T svolgono un ruolo critico nello sviluppo di diverse malattie cardiovascolari1,2,3,4,5. Ad esempio, gli studi del nostro gruppo hanno dimostrato che l'ipertensione è associata a un eccessivo accumulo di cellule T nei vasi e nei reni durante lo sviluppo dell'ipertensione sperimentale6. Una volta in questi tessuti, le cellule T producono diverse citochine che influenzano sia la funzione vascolare che quella renale, portando a vasocostrizione e ritenzione di sodio e acqua1,2. Per comprendere appieno come le cellule T causano malattie cardiovascolari e renali, è importante essere in grado di identificare e quantificare i sottogruppi specifici di cellule T presenti in questi tessuti. I sottogruppi di cellule T sono definiti da una combinazione di marcatori di superficie, le citochine che secernono e i fattori di trascrizione che esprimono. La complessità della popolazione di cellule T rende la citometria a flusso e la colorazione intracellulare una tecnica inestimabile per sezionare i fenotipi dei linfociti presenti nei tessuti. Qui, forniamo un protocollo dettagliato per identificare i marcatori di superficie e intracellulari (citochine e fattori di trascrizione) nelle cellule T isolate da rene murino, aorta e linfonodi drenanti dell'aorta in un modello di ipertensione indotta da angiotensina II. Vengono descritte in dettaglio le seguenti fasi: isolamento dei tessuti, generazione delle sospensioni di singole cellule, stimolazione ex vivo, fissazione, permeabilizzazione e colorazione. Inoltre, vengono discussi diversi principi fondamentali delle analisi citofluorimetriche, tra cui la scelta dei controlli appropriati e le strategie di gating appropriate.

Il protocollo consente descritto l&#39;identificazione di marcatori di superficie ed intracellulari in cellule T isolate dal rene murino, aorta e aortici linfonodi drenanti in un modello di angiotensina II ipertensione indotta. I risultati rappresentativi sono presentati di seguito. La Figura 1 mostra la strategia di gating utilizzato per identificare la popolazione di cellule T in una sospensione di cellule s...

Questo articolo fornisce una metodologia dettagliata per identificare e quantificare i sottoinsiemi dei linfociti T funzionali presenti all&#39;interno dei nodi del rene murino, aorta e linfatici mediante colorazione intracellulare e citometria a flusso. Il modello di angiotensina II ipertensione indotta è stato scelto per spiegare, passo-passo, le procedure ei principi fondamentali della citometria a flusso e colorazione intracellulare.

Intracellulare colorazione e citometria a flusso per l&#39;identificazione dei linfociti sottoinsiemi all&#39;interno murino Aorta, rene e linfonodi in un modello di ipertensione

It is now well known that T lymphocytes play a critical role in the development of several cardiovascular diseases1,2,3,4,5. For example, studies from our ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è ottenere sospensioni di singole cellule dall'aorta murina, dai reni e dai linfonodi al fine di quantificare e caratterizzare le cellule immunitarie in un modello di ipertensione indotta da angiotensina II. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo delle malattie cardiovascolari, ad esempio quali due sottopopolazioni di linfociti promuovono lo sviluppo dell'ipertensione. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente l'identificazione e la quantificazione di sottopopolazioni di cellule immunitarie in organi solidi a livello di singola cellula.Prima di iniziare la procedura, disinfettare il torace del mouse con etanolo al 70%. Quindi utilizzare le forbici per aprire con attenzione la cute e la parete toracica ed esporre il cuore. Per perfondere la vascolarizzazione, praticare un piccolo incisione nell'atrio destro ed iniettare in modo costante almeno 10 millilitri di PBS freddo al vertice del ventricolo sinistro a una velocità di circa un millilitro al secondo.Quando tutti gli organi saranno diventati pallidi, utilizzare pinzette da dissezione fini per rimuovere i linfonodi drenanti dell'aorta addominale, avendo cura di non rompere le capsule. Sotto un microscopio stereoscopico, rimuovere i due reni con forbici fini. Successivamente, utilizzare forbici curve fini per dissezionare l'intera aorta toracica e addominale a partire dal cuore fino alla biforcazione iliaca, avendo cura di mantenere il tessuto adiposo perivascolare circostante adeso all'aorta.Successivamente, trasferire i reni in un tubo di dissociazione contenente 10 millilitri di soluzione di digestione renale e utilizzare un dissociatore semi-automatico per disaggregare meccanicamente il tessuto renale seguendo le istruzioni del produttore. Al termine della dissociazione, incubare i campioni a 37 gradi Celsius sotto rotazione continua. Dopo 20 minuti, arrestare immediatamente la digestione enzimatica con mezzo RPMI 1640 freddo integrato con 5% di FBS e filtrare la sospensione tissutale risultante attraverso un filtro da 40 micron in un tubo conico da 50 millilitri.Usare lo stantuffo di una siringa da un millilitro per separare i resti di tessuto. Quindi, pellettizzare le cellule mediante centrifugazione. Risospendere il pellet in tre millilitri di mezzo di gradiente di densità al 36% e trasferire le cellule in un tubo conico da 15 millilitri.Aggiungere delicatamente tre millilitri di mezzo a gradiente di densità al 72% sotto le cellule, avendo cura di non disturbare gli strati, e separare le cellule mediante centrifugazione. Le cellule immunitarie si troveranno all'interfaccia. Rimuovere lo strato superiore giallastro contenente i detriti cellulari, quindi portare il volume a 15 millilitri utilizzando PBS freddo.Agitare bene per rompere il gradiente e quindi lavare le cellule mediante centrifugazione. Per isolare le cellule immunitarie aortiche, trasferire l’aorta in un tubo da due millilitri contenente un millilitro di soluzione di digestione per l’aorta appena preparata, posta sul ghiaccio, e utilizzare forbici fini per tritare l’intera aorta in piccoli pezzi. Incubare quindi i frammenti a 37 gradi Celsius per 30 minuti con rotazione continua.Al termine della digestione, aggiungere RPMI freddo integrato con FBS al 5% in un volume pari a cinque volte quello della soluzione di digestione e filtrare la sospensione tissutale risultante attraverso un setaccio da 40 micron. Successivamente, raccogliere la sospensione di singole cellule mediante centrifugazione e risospendere il pellet in RPMI fresco con FBS. Per ottenere una sospensione di singole cellule dai linfonodi drenanti dell'aorta, trasferire i linfonodi su un setaccio da 40 micron posto in una piastra per colture cellulari da 60 × 15 millimetri e utilizzare lo stantuffo di una siringa da un millilitro per disgregare il tessuto.Quindi lavare il filtro con due millilitri di RPMI aggiunti di FBS e trasferire le cellule liberate in un tubo conico da 15 millilitri. Per stimolare le cellule, regolare innanzitutto ogni sospensione cellulare a una concentrazione di uno per 10 alla sesta cellule per millilitro nel mezzo di coltura cellulare. Successivamente, aggiungere due microlitri del cocktail di attivazione cellulare a ogni gruppo di cellule per ogni millilitro di mezzo.Successivamente, trasferire da una a due volte 10 alla sesta cellule aortiche o renali per pozzetto in una piastra a 12 pozzetti e da una a due volte 10 alla sesta cellule di linfonodo per pozzetto in una piastra a 24 pozzetti. Collocare le piastre in un incubatore umidificato con anidride carbonica a 37 gradi Celsius per tre ore. Quindi trasferire le cellule nei rispettivi tubi FACS in polistirene e formare il pellet cellulare mediante centrifugazione.Dopo aver lavato le cellule due volte con buffer FACS fresco nelle stesse condizioni di centrifugazione, bloccare il legame superficiale non specifico con FC block e lavare le cellule in PBS. Risospendere i pellet in un millilitro di PBS fresco e colorare le cellule con un microlitro di un colorante vitalità reattivo verso le ammine e impermeante alle cellule per 15 minuti a quattro gradi Celsius, protetto dalla luce. Al termine dell'incubazione, lavare nuovamente le cellule altre due volte in uno-due millilitri di buffer FACS e risospendere i pellet in 100 microlitri del cocktail appropriato di anticorpi per la colorazione della superficie cellulare.Dopo 30 minuti a quattro gradi Celsius e protetto dalla luce, lavare le cellule altre due volte in due millilitri di buffer FACS fresco e fissare e permeabilizzare le cellule con un kit di fissazione e permeabilizzazione seguendo le istruzioni del produttore. Successivamente, etichettare le cellule con il cocktail di anticorpi intracellulari di interesse e lavare nuovamente le cellule nel buffer FACS. Per l'analisi citofluorimetrica della produzione intracellulare di citochine stimolata, eseguire prima i tubi di controllo non colorati e colorati singolarmente per correggere l'overlap spettrale, seguiti dai controlli fluorescenza-meno-uno per ciascun fluorocromo nel pannello.Dopo aver impostato i parametri di base per l'analisi della fluorescenza, utilizzare un grafico a dispersione area di scattering anteriore rispetto a scattering laterale per definire il cancello primario per il rilevamento della popolazione di leucociti, seguito da un ulteriore gating per escludere le cellule morte in base alla mancata espressione del marcatore di vitalità. Riportare l'area dello scattering anteriore rispetto all'altezza dello scattering anteriore e applicare un cancello per escludere i doppietti. I leucociti possono quindi essere identificati in base alla loro espressione di CD45.Per determinare la presenza di cellule T produttrici di IL-17A o IL-17F nel rene o nell'aorta murino, è possibile preparare sospensioni cellulari singole come appena illustrato per l'analisi del controllo con fluorescenza meno uno per ciascuna citochina. Come previsto, pochissime cellule risultano positive per IL-17A o IL-17F nei controlli con fluorescenza meno uno, consentendo una corretta discriminazione tra segnali positivi e negativi per l'adeguato posizionamento delle porte di selezione nell'identificazione di cellule positive per IL-17A o IL-17F nei campioni sperimentali. La colorazione intracellulare rappresentativa di cellule T isolate dal rene e dall'aorta di topi wild-type trattati con veicolo o angiotensina II rivela la presenza di una sotto-popolazione di cellule T esprimenti IL-17A o IL-17F in entrambi i tessuti.Inoltre, la colorazione intracellulare dei linfociti T provenienti dai linfonodi drenanti dell'aorta dimostra che i linfociti T positivi per CD8 esprimono interferone gamma e T-bet in seguito alla stimolazione con angiotensina II. Una volta acquisita padronanza, questa tecnica può essere eseguita in sei-nove ore a seconda del numero di tessuti da processare. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante lavorare rapidamente ed in modo efficiente per minimizzare la morte cellulare.Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come generare una sospensione di singole cellule da rene murino, aorta e linfonodi, e di come caratterizzare e quantificare i sottoinsiemi di cellule immunitarie provenienti da questi organi. Questa tecnica consente ai fisiologi cardiovascolari e renali di esplorare i cambiamenti nelle popolazioni di cellule immunitarie che potrebbero contribuire all'ipertensione e ad altre malattie pro-infiammatorie.

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Questo articolo presenta un metodo basato citometria di flusso per studiare la composizione immunitario dei aorte. Il documento illustra anche una tecnica aggiuntiva che consente di esaminare avventizia circostante e parete del vaso a parte. Questo metodo apre la possibilità di eseguire analisi fenotipica dei leucociti aortica e applicare diversi saggi immunologici per gli studi di aterosclerosi.

Analisi Citometria a flusso di cellule immunitarie all&#39;interno aorte Murine

Descriviamo le procedure per quantificare e caratterizzare le lesioni aterosclerotiche in modelli murini utilizzando il sezionamento di precisione del seno aortico e dell'aorta ascendente combinato con analisi istochimica e immunoistochimica.

Analisi quantitativa e caratterizzazione delle lesioni aterosclerotiche nel seno aortico murino

La funzione delle cellule vascolari dipende dall'attività dei messaggeri intracellulari.  Qui descritto è un metodo di imaging ex vivo a due fotoni che consente la misurazione dei livelli intracellulari di calcio e ossido nitrico in risposta a stimoli fisiologici e farmacologici in singole cellule endoteliali e muscolari lisce di un'aorta isolata.

A due fotoni Imaging di Intracellulare Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Manipolazione e l&#39;ossido nitrico Produzione in endoteliale e della muscolatura liscia cellule di un isolato Rat Aorta

I monociti sono mediatori importanti di arteriogenesi nel contesto della malattia arteriosa periferica. Utilizzando una matrice del tipo di membrana basale e la microscopia intravital, questo protocollo indaga l'angiogenesi di homing e tumore-relativa del monocito dopo l'iniezione del monocito nel modello murino di legatura dell'arteria femorale.

Microscopia intravital del monocito Homing e l'angiogenesi tumore-relativa in un modello murino della malattia arteriosa periferica

Questo manoscritto descrive l'uso di topi transgenici reporter e vie di somministrazione differenti di coloranti fluorescenti in angiotensina II-ipertensione indotta mediante videomicroscopia video microscopia dei vasi sanguigni per valutare l'attivazione di cellule immunitarie e loro capacità di rotolare e aderire all'endotelio.

Visualizzazione del leucocita rotolamento e adesione in angiotensina II-infuso topi: tecniche e insidie

L'obiettivo del presente protocollo è quello di identificare popolazioni di cellule endoteliali linfatiche all'interno del fegato usando gli indicatori descritti. Utilizziamo collagenasi IV e DNasi e una delicata macinazione del tessuto, combinato con citometria a flusso, per identificare una popolazione distinta di cellule endoteliali linfatiche.

Digestione del fegato murino per un'analisi citofluorimetrica delle cellule endoteliali linfatiche

Vi proponiamo un protocollo standardizzato per caratterizzare la composizione cellulare delle lesioni aterosclerotiche murine di stadio avanzato compreso di metodi sistematici di dissezione animale, inclusione di tessuti, taglio, colorazione e analisi delle arterie brachiocefaliche dai topi di atheroprone del muscolo liscio delle cellule lignaggio traccia.

Analisi quantitativa della composizione cellulare nelle lesioni aterosclerotiche avanzate del muscolo liscio delle cellule Lineage-Tracing topi

Qui, descriviamo un protocollo di citometria di flusso dettagliato e riproducibile per identificare sottoinsiemi monociti/macrofamiglia e t-cell utilizzando saggi di colorazione extra e intracellulare all'interno della milza murina, del midollo osseo, dei linfonodi e del tessuto sinoviale, utilizzando un modello chirurgico stabilito di osteoartrite murina.

Analisi della citometria del flusso di sottoinsiemi di cellule immunitarie all'interno della milza murina, del midollo osseo, dei nodi linfociti e del tessuto sinoviale in un modello di osteoartrite

A seguito di infezione virale, il rene ospita un numero relativamente elevato di cellule CD8+ T e offre l'opportunità di studiare le cellule T RM nonmucose. Qui descriviamo un protocollo per isolare i linfociti renali del topo per l'analisi della citometria del flusso.

Isolamento delle cellule CD8 + T residenti neireni del topo per l'analisi della citometria a flusso

Il reclutamento di leucociti e piastrine costituisce una componente essenziale necessaria per l'efficace crescita delle arterie collaterali durante l'arteriogenesi. La microscopia multifotonica è uno strumento efficiente per tracciare la dinamica cellulare con alta risoluzione spazio-temporale in vivo e meno fototossicità per studiare il reclutamento e lo stravaso dei leucociti durante l'arteriogenesi.

Multiphoton Intravital Imaging per il monitoraggio del reclutamento dei leucociti durante l'arteriogenesi in un modello murino di arti posteriori

Qui, presentiamo protocolli ottimizzati di pulizia dei tessuti per visualizzare l'aorta murina in tre dimensioni (3D). Delineiamo procedure all'avanguardia per l'immunocolorazione, la pulizia ottica e l'imaging con l'intento di definire la prossimità anatomica del sistema nervoso periferico con le placche aterosclerotiche e l'avventizia nell'aterosclerosi.

Imaging tridimensionale dei tessuti aortici nell'aterosclerosi

Impara a identificare i sottoinsiemi di linfociti T nel rene, nell'aorta e nei linfonodi murini mediante colorazione intracellulare e citometria a flusso. Questo metodo consente l'analisi delle risposte immunitarie nell'ipertensione indotta da angiotensina II.

Intracellulare colorazione e citometria a flusso per lidentificazione dei linfociti sottoinsiemi allinterno murino Aorta, rene e linfonodi in un modello di ipertensione (Video) | JoVE Journal

Intracellulare colorazione e citometria a flusso per l'identificazione dei linfociti sottoinsiemi all'interno murino Aorta, rene e linfonodi in un modello di ipertensione

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