Intracellulare colorazione e citometria a flusso per l'identificazione dei linfociti sottoinsiemi all'interno murino Aorta, rene e linfonodi in un modello di ipertensione

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di ottenere sospensioni di singole cellule dall'aorta murina, dal rene e dai linfonodi per quantificare e caratterizzare le cellule immunitarie in un modello di ipertensione indotta da angiotensina II. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle malattie cardiovascolari, come ad esempio quali due sottogruppi di linfociti promuovono lo sviluppo dell'ipertensione. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente l'identificazione e la quantificazione di sottogruppi di cellule immunitarie in organi solidi a livello di singola cellula.

Prima di iniziare la procedura, disinfettare il torace del topo con etanolo al 70%. Quindi usa le forbici per aprire con cura la pelle e la parete toracica per esporre il cuore. Per perfondere il sistema vascolare, praticare una piccola incisione nell'atrio destro e iniettare costantemente almeno 10 millilitri di PBS freddo a una velocità di circa un millilitro al secondo nell'apice del ventricolo sinistro.

Quando tutti gli organi sono sbiancati, utilizzare una pinza da dissezione fine per rimuovere i linfonodi drenanti l'aorta addominale, facendo attenzione a non rompere le capsule. Sotto un microscopio da dissezione, rimuovere i due reni con le forbici sottili. Quindi utilizzare forbici curve fini per sezionare l'intera aorta toracica e addominale a partire dal cuore e terminando alla biforcazione iliaca, facendo attenzione a mantenere il grasso perivascolare circostante attaccato all'aorta.

Successivamente, trasferire i reni in una provetta di dissociazione contenente 10 millilitri di soluzione per la digestione dei reni e utilizzare un dissociatore semiautomatico per disaggregare meccanicamente il tessuto renale secondo le istruzioni del produttore. Al termine della dissociazione, incubare i campioni a 37 gradi Celsius in rotazione continua. Dopo 20 minuti, interrompere immediatamente la digestione enzimatica con il terreno RPMI 1640 freddo integrato con il 5% di FBS e filtrare il liquame tissutale risultante attraverso un colino da 40 micron in un tubo conico da 50 millilitri.

Usa lo stantuffo di una siringa da un millilitro per separare il tessuto rimanente. Quindi pellettare le celle mediante centrifugazione. Risospendere il pellet in tre millilitri di terreno con gradiente di densità del 36% e trasferire le celle in un tubo conico da 15 millilitri.

Stratificare delicatamente tre millilitri di terreno con gradiente di densità del 72% sotto le cellule, facendo attenzione a non disturbare gli strati, e separare le cellule mediante centrifugazione. Le cellule immunitarie saranno localizzate all'interfaccia. Rimuovere lo strato giallastro più superficiale contenente detriti cellulari e quindi portare il volume fino a 15 millilitri utilizzando il PBS freddo.

Agitare bene per abbattere il gradiente e poi lavare le cellule mediante centrifugazione. Per isolare le cellule immunitarie dell'aorta, trasferire l'aorta in una provetta da due millilitri contenente un millilitro di soluzione di digestione aorta-digestiva appena preparata su ghiaccio e utilizzare le forbici sottili per tritare l'intera aorta in pezzi sottili. Quindi incubare i frammenti a 37 gradi Celsius per 30 minuti di rotazione continua.

Al termine della digestione, aggiungere RPMI freddo integrato con il 5% di FBS a cinque volte il volume della soluzione di digestione e filtrare l'impasto tissutale risultante attraverso un colino da 40 micron. Quindi raccogliere la sospensione a cella singola mediante centrifugazione e risospendere il pellet in RPMI fresco con FBS. Per generare una sospensione unicellulare dai linfonodi drenanti l'aortica, trasferire i linfonodi su un colino da 40 micron in una piastra di coltura tissutale di 60 x 15 millimetri e utilizzare uno stantuffo della siringa da un millilitro per disaggregare il tessuto.

Quindi sciacquare il filtro con due millilitri di RPMI più FBS e trasferire le cellule liberate in un tubo conico da 15 millilitri. Per stimolare le cellule, regolare prima ciascuna sospensione cellulare a una concentrazione di una volta per 10 al sesto di cellule per millilitro nel terreno di coltura cellulare. Quindi aggiungere due microlitri del cocktail di attivazione cellulare a ciascun gruppo di cellule per ogni millilitro di terreno.

Successivamente, trasferire una o due volte 10 al sesto cellulare aortico o renale per pozzetto in una piastra a 12 pozzetti e una o due volte 10 al sesto linfonodo per pozzetto in una piastra a 24 pozzetti. Metti le piastre in un incubatore ad anidride carbonica umidificato a 37 gradi Celsius per tre ore. Quindi trasferire le celle nelle apposite provette FACS di polistirene corrispondenti e pellettare le celle mediante centrifugazione.

Dopo aver lavato le celle due volte con tampone FACS fresco nelle stesse condizioni di centrifuga, bloccare il blocco e il legame superficiale non specifico con FC e lavare le celle in PBS. Risospendere i pellet in un millilitro di PBS fresco e colorare le cellule con un microlitro di una colorazione di vitalità reattiva all'ammina immerina per 15 minuti a quattro gradi Celsius, al riparo dalla luce. Al termine dell'incubazione, lavare le cellule altre due volte in uno o due millilitri di tampone FACS e risospendere i pellet in 100 microlitri del cocktail di anticorpi che colorano la superficie cellulare appropriato.

Dopo 30 minuti a quattro gradi Celsius e al riparo dalla luce, lavare le cellule altre due volte in due millilitri di tampone FACS fresco e fissare e permeabilizzare le cellule con un kit di fissazione e permeabilizzazione secondo le istruzioni del produttore. Quindi, etichettare le cellule con il cocktail di anticorpi intracellulari di interesse e lavare nuovamente le cellule nel tampone FACS. Per l'analisi citofluorimetrica della produzione di citochine intracellulari stimolata, eseguire prima le provette di controllo non colorate e colorate singolarmente per regolare la sovrapposizione spettrale, quindi i controlli a fluorescenza meno uno per ciascun fluoroforo nel pannello.

Una volta impostati i parametri di base dell'analisi della fluorescenza, utilizzare un grafico dell'area di dispersione forward by-side per impostare il gate primario per il rilevamento della popolazione leucocitaria, seguito da un gating per escludere le cellule morte in base alla loro mancanza di espressione della colorazione di vitalità. Tracciare l'area di dispersione in avanti rispetto all'altezza di dispersione in avanti e al gate per escludere i doppietti. I leucociti possono quindi essere identificati dalla loro espressione di CD45.

Per determinare la presenza di cellule T produttrici di IL-17A o IL-17F con il rene murino o l'aorta, è possibile preparare sospensioni di singole cellule, come appena dimostrato, per l'analisi di controllo a fluorescenza meno uno di ciascuna citochina. Come previsto, pochissime cellule sono positive per IL-17A o IL-17F nei controlli a fluorescenza meno uno, consentendo l'accurata discriminazione dei segnali positivi rispetto a quelli negativi per regolare correttamente i gate per l'identificazione delle cellule positive per IL-17A o IL-17F nei campioni sperimentali. La colorazione intracellulare rappresentativa delle cellule T isolate dal rene e dall'aorta di topi wild-type infusi con veicolo o angiotensina II rivela la presenza di un sottogruppo di cellule T che esprimono IL-17A o IL-17F all'interno di entrambi i tessuti.

Inoltre, la colorazione intracellulare delle cellule T dai linfonodi drenanti l'aorta dimostra che le cellule T CD8 positive esprimono interferone gamma e T-bet in seguito alla stimolazione dell'angiotensina II. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in sei-nove ore a seconda del numero di tessuti da trattare. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante lavorare in modo rapido ed efficiente per ridurre al minimo la morte cellulare.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come generare una sospensione unicellulare dal rene, dall'aorta e dai linfonodi murini e di caratterizzare e quantificare i sottogruppi di cellule immunitarie da questi organi. Questa tecnica consente alle fisiologie cardiovascolari e renali di esplorare i cambiamenti nelle popolazioni di cellule immunitarie che possono contribuire all'ipertensione e ad altre malattie pro-infiammatorie.