Name: Genome Editing e di differenziazione Regia di hPSCs per interrogare determinanti Lineage in Sviluppo Umano del pancreas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Scopri la piattaforma iCRISPR per l'editing genomico rapido nelle hPSC e la loro differenziazione in cellule pancreatiche. Questo metodo consente di studiare i determinanti del lineage nello sviluppo umano del pancreas e le basi molecolari del diabete.

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Questo lavoro è stato finanziato in parte dal NIH / NIDDK (R01DK096239) e New York State Stem Cell Science (NYSTEM C029156). ZZ è stato sostenuto dalla borsa di studio post-dottorato NYSTEM dal Center for Stem Cell Biology della Sloan Kettering Institute.

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Considerazioni Tempo per la generazione di mutanti Lines Anche se gli approcci più recenti basati su sistemi / Cas CRISPR per la modifica del genoma hanno portato a il targeting di successo, una piattaforma più efficace e universale sarebbe preferibile per i più grandi scala analisi della funzione del gene. La piattaforma iCRISPR offre un metodo rapido ed efficace per introdurre mutazioni a qualsiasi gene di interesse 5, 9. In primo luogo, il metodo di sintesi gRNA basato sulla PCR consente la produzione di centinaia di gRNAs in formato disposte in un giorno senza le fasi di clonazione in termini di tempo. In secondo luogo, con l&#39;espressione Cas9 doxiciclina-inducibile in iCas9 hPSCs, il passo che coinvolge gRNA trasfezione richiede solo una minima quantità di lavoro, e, quindi, più gRNA esperimenti di targeting può essere condotta contemporaneamente. In terzo luogo, a causa della elevata Targeting efficienze ottenibili con il nostro sistema, l&#39;analisi di ~ 24 - 48 colonie per gRNA transfettate dovrebbero essere sufficient stabilire monoallelic multiplo e linee mutanti biallelici per un singolo gene, anche se efficienze variano a seconda del locus bersaglio. Dal momento che è possibile per un individuo addestrato per raccogliere meccanicamente 384 colonie (lastre 4 x 96 pozzetti) in una sola seduta, che dovrebbe prendere ~ 4 ore sotto un microscopio da dissezione, un individuo addestrato può essere previsto per generare linee mutanti che interessano 12 geni all&#39;interno 12 mesi. La generazione di mutanti snella HPSC in poco tempo permette l&#39;analisi sistematica di una serie di fattori di trascrizione e / o componenti percorso di segnalazione che interagiscono tra di loro, che regolano il processo di sviluppo 9. Inoltre, il targeting efficiente gene multiplex apre anche la porta ad indagare le interazioni genetiche sottostanti tratti umani complessi. Generazione di Precise modifiche genetiche La derivazione di iPSCs-paziente specifici da facilmente accessibile tipo di cellule somatiche<html> s e la differenziazione in tipi di cellule malattie rilevanti forniscono una grande opportunità per la validazione funzionale delle mutazioni associate alla malattia. Tuttavia, a causa della notevole variabilità genetica tra individui, confronti diretti tra iPSCs da pazienti e da donatori sani potrebbero non consentire di distinguere fenotipi di malattia da effetti di sfondo. Pertanto, è necessario generare iPSCs controllo isogeni correggendo la malattia mutazione torna alla sequenza wild-type o di introdurre mutazioni specifiche del paziente in una wild-type HPSC sfondo, come proposto da altri 25, 26. Oltre a (nulli) mutazioni perdita di funzione, si può ora analizzare con maggiore precisione i meccanismi della malattia attraverso l&#39;introduzione di un paziente-specifici alterazioni di sequenza nel locus endogeno hPSCs, tra cui il paziente hypermorphic, hypomorphic, neomorphic, o dominante negativo mutazioni. S copi &quot;&gt; modifica genetica Precise impiega HDR per la riparazione DSB in presenza di un modello di riparazione. Dal momento che è molto meno efficiente di riparazione del DNA NHEJ-mediata, un plasmide donatore contenente la specifica mutazione-paziente, una cassetta selezione dei farmaci, e braccia omologia è stato precedentemente utilizzato come modello di riparazione 2. Dopo la selezione della droga e la verifica della specifica mutazione-paziente, un secondo passo è generalmente necessario per rimuovere la cassetta di selezione della droga. Mentre i più diffusi sistemi di Cre-loxP e FLP-FRT lasciano dietro sequenza residua nel locus endogena, l&#39;uso di piggyBac trasposone ha permesso la rimozione senza saldatura della cassetta di selezione droga 27. Più recentemente, i modelli ssDNA brevi hanno anche dimostrato di sostenere HDR efficiente con endonucleasi di DNA ingegnerizzati 28. Rispetto ad un plasmide donatore , ssDNA può essere sintetizzato direttamente aggira quindi il passo clonazione tempo. Qui, deve essereen dimostrato che, mediante co-trasfezione gRNA e un modello ssDNA per indurre riparazione omologia-diretto, iCRISPR può essere utilizzato per introdurre modifiche nucleotidiche specifiche con alta efficienza. Questo è fondamentale non solo per sezionare il ruolo dei nucleotidi essenziali all&#39;interno proteine ​​domini funzionali, ma anche per modellare malattia mutazioni umane e potenzialmente correggere queste mutazioni malattia-associato, per intervento terapeutico. A causa del gran numero di suscettibilità loci che sono ciascuno associato a più varianti di sequenza, modellando malattie complesse e multigenici come diabete è stata una sfida per i genetisti. Come la piattaforma iCRISPR è permissivo per la rapida generazione di una serie allelica o per il targeting canalizzabile gene, può facilitare la ricerca di più loci associata a malattia, singolarmente o in combinazione con sfondi isogenici. Targeting efficienze ed effetti fuori bersaglio abbiamo<html> trovato una buona correlazione tra la T7E1 e risultati del test RFLP e il numero di linee mutanti identificati mediante sequenziamento. Questo sottolinea l&#39;importanza di eseguire questi test in parallelo con la creazione di linee clonali. Mentre le efficienze di targeting ottenuti possono variare a seconda delle loci genomici, nella maggior parte degli esperimenti singolo gene targeting, 20 - 60% dei cloni sono stati trovati con entrambi gli alleli mutati (compresi in-frame e frameshift mutazioni) 9. Nei casi in cui è stata eseguita multiplex gene targeting, triple cloni mutanti bialleliche con il 5-10% di efficienza sono stati ottenuti 5. ssDNA mediata HDR di diversi geni sono stati anche eseguiti per ottenere precise alterazioni genetiche, con le efficienze di ottenere omozigote knock-in cloni che vanno da 1 - 10% 5. Lavorare con CRISPR / Cas in hPSCs, eventuali mutazioni nei potenziali siti off-bersaglio che non condividono la stessa sequenza bersaglio gRNA devono ancora essere rilevatalass = &quot;xref&quot;&gt; 5, 9, 12. Whole-sequenziamento del genoma eseguito in un recente studio ha anche omesso di individuare sostanziali mutazioni fuori bersaglio nelle linee clonali HPSC generata utilizzando CRISPR / Cas 29. Tuttavia, per ridurre al minimo qualsiasi potenziale effetto di confondimento fenotipi introdotte da mutazioni nei siti ad effetto fuori bersaglio, si consiglia di generare linee mutanti indipendenti utilizzando almeno due gRNAs indipendenti di targeting sequenze diverse all&#39;interno dello stesso gene. fenotipi simili osservati in più linee generati utilizzando diverse gRNAs potrebbe principalmente escludere la possibilità che il fenotipo proviene da un effetto centra la porta. Alimentatore-dipendente contro la cultura indipendente e targeting I metodi tradizionali per la cultura HPSC coinvolgono il loro mantenimento e l&#39;espansione su cellule feeder in supporti contenenti siero o sostituzione siero che include prod animaledotti, come albumina di siero bovino. cellule di alimentazione, siero, siero di sostituzione, e l&#39;albumina contengono tutti complessi, componenti non definiti e mostrano una notevole variabilità dei lotti. L&#39;adattamento alla condizione-alimentatore libero e chimica definita riduce in modo significativo gli sforzi per HPSC manutenzione e, soprattutto, aumenta la consistenza degli esperimenti di differenziazione. Allo stato attuale, ci sono pochi studi che descrivono le procedure di modifica del genoma su hPSCs coltivate in condizioni di coltura completamente definite 30. Abbiamo trovato maggiore CRISPR mira efficienza quando gRNA trasfezione e la deposizione clonale sono stati eseguiti in condizioni di assenza di alimentazione rispetto alle condizioni di coltura di alimentazione-dipendente. Noi crediamo che questo sia dovuto ad un aumento della sopravvivenza delle cellule dopo la trasfezione e semina cella singola per la formazione di colonie. Inoltre, cellule di alimentazione sono stati precedentemente dimostrato di sequestrare reagenti di trasfezione, riducendo così l&#39;efficienza di trasfezione. combinandoEditing Genome con differenziazione Regia Precedente protocolli di differenziazione hanno prodotto solo una piccola frazione di cellule insulino-positive, la maggior parte dei quali erano polyhormonal e assomigliava cellule endocrine fetali 23. I recenti progressi ha permesso la differenziazione di hPSCs in cellule più mature glucosio-responsive beta-come 16, 17, 19, 20. Siamo in grado di routine ottenere cellule endoderma definitivo almeno il 75%, il 40% Pdx1 + NKX6.1 + progenitrici del pancreas, e circa il 20% NKX6.1 + CPEP + cellule beta-come il glucosio-reattiva utilizzando HUES8 hPSCs 9. In combinazione con il sistema di editing genoma iCRISPR, questo più robusto protocollo di differenziazione ha facilitato l&#39;analisi dei fattori di trascrizione che sono cruciali per il progenitore e endocrini pancreatici fasi di differenziazione del pancreas. Questo renderàE &#39;possibile, in studi futuri, per esaminare un gran numero di geni-malattia candidato per la validazione funzionale e di indagine sui meccanismi che sono alla base del diabete 9. Applicazioni o Direzioni future Il nostro sistema di iCRISPR può facilitare la generazione di modifiche genomiche più complessi, come ad esempio la creazione di alleli giornalista attraverso gene targeting utilizzando lunga donatori modelli di DNA tag proteine di codifica o giornalisti fluorescenti 12 HDR-mediata. Abbiamo dimostrato che, a causa della elevata CRISPR di targeting efficienze raggiunte nel sistema, questo processo può essere eseguito in hPSCs, senza la necessità di selezionare ulteriori farmaci 12. Inoltre, gene multiplex mira può essere utilizzato per studiare le interazioni genetiche sottostante malattia umana complessa, come indicato nel nostro studio recente, che a nostro avviso è il primo esempio di tale lavoro 31. iCRISPR può essere utilizzato anche per capire il controllo normativo gene con la creazione di delezioni sia in RNA non codificanti del gene o in regioni regolatorie, come i promotori e stimolatori. Per generare in modo efficiente mutanti normativi utilizzando iCRISPR, gRNAs possono essere progettati per interrompere il sito di legame di una proteina di legame al DNA, compreso ma non limitato alla macchina di trascrizione basale o un fattore di trascrizione tessuto-specifica. ssDNA HDR modello mediata può essere utilizzato anche a mutare specifici siti di legame alle proteine. Infine, prevediamo che un&#39;ulteriore ottimizzazione consentirebbe l&#39;utilizzo della piattaforma iCRISPR in hPSCs per alte analisi genetiche di throughput di fenotipi pluripotenza o fenotipi di malattia in combinazione con un protocollo vitro differenziazione. Questi studi iCRISPR mediata possono consentire la più rapida identificazione dei candidati geni associati alla malattia e gli studi della loro rilevanza funzionale.

Le cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs) hanno la capacità di entrambi di auto-rinnovarsi e dare origine a tutti i derivati ​​delle tre linee germinali embrionali. Essi forniscono una risorsa preziosa per la terapia di sostituzione cellulare e modellazione malattia servendo come una piattaforma unica di ricapitolare processi cellulari in un contesto di sviluppo umano. Sono anche una fonte di cellule sperimentali per scalabili, analisi high-throughput. Tuttavia, il progresso è stato limitato a causa di due sfide principali: la mancanza di strumenti di modifica genetica efficienti e la difficoltà di ricapitolare le complesse fasi di sviluppo embrionale in un piatto di cultura. La modificazione genetica è uno strumento indispensabile per studiare la funzione del gene nello sviluppo normale e la malattia. Tuttavia, mentre genica classica mira approcci tramite ricombinazione omologa hanno dimostrato di essere un potente strumento per analizzare la funzione del gene in topo cellule staminali embrionali (mESCs) 1, questo approccioè stato estremamente inefficiente quando applicato hPSCs 2, 3. La recente adesione vivace di programmabili, nucleasi site-specific dalla natura a uso di laboratorio, tra cui nucleasi dita di zinco (ZFNs), trascrizione attivatore come nucleasi effettrici (Talens) ei cluster regolarmente intervallati brevi ripetizioni palindromi (CRISPR) / CRISPR associata (CAS) sistemi 4, significa che l&#39;ingegneria del genoma è diventato un compito molto più facile in una vasta gamma di organismi e linee cellulari, tra cui in hPSCs. Questi strumenti di editing gene approfittare del fatto che nucleasi chimerici come l&#39;endonucleasi Cas9 possono permettere tutta una serie di modificazioni genetiche inducendo rotture del doppio filamento (DSB) in punti precisi, innescando il meccanismo di riparazione del DNA endogeno per attivare o non omologa terminare l&#39;adesione (NHEJ) o riparare omologia-diretto (HDR). Entrambi i meccanismi possono essere sfruttate per la manipolazione genetica inducendo either l&#39;inserimento casuale e mutazioni per delezione (indels; via NHEJ), per creare frameshift mutazioni che annullano gli alleli del gene, o sostituzioni nucleotidiche precisi (via HDR), di ricapitolare le mutazioni del paziente per la modellazione malattia umana o per correggere una mutazione che causa la malattia per la terapia genica . CRISPR / ingegneria del genoma Cas-mediata richiede due componenti: la costante di RNA-guida Cas9 endonucleasi necessaria per scissione del DNA e RNA variabile CRISPR (crRNA) e duplex trans-attivazione (tracrRNA) che specifica il riconoscimento DNA bersaglio. Il duplex crRNA / tracrRNA può essere sostituito con un unico chimerico guida RNA (gRNA), che sono stati trovati a lavorare in modo più efficiente 5, 6, 7. Mentre il sistema / Cas9 CRISPR è stato adattato per gli organismi più sperimentali e linee cellulari, la consegna e l&#39;espressione di Cas9 e gRNA varia in modo significativo e deve essere ulteriormente ottimizzato per achivigilia editing efficiente genoma in molti sistemi, tra cui hPSCs 8. Una piattaforma efficiente genoma-editing, iCRISPR, è stata stabilita in hPSCs 5. In questo sistema, un approccio TALEN-mediata è stato usato per indirizzare entrambi gli alleli del AAVS1 &quot;transgene porto sicuro locus&quot; in trans, un allele con transattivatore inverso tetraciclina controllata (M2rtTA) e l&#39;altra con un elemento di risposta tetraciclina (TRE ) che guida l&#39;espressione di Cas9 (iCas9) nei hPSCs. Nelle linee clonali stabiliti (iCas9 hPSCs), Cas9 è altamente espresso con il trattamento doxiciclina. Nel frattempo, grazie alle sue dimensioni ridotte (100 nt), gRNAs singoli o multipli possono essere facilmente trasportati in iCas9 hPSCs con alta efficienza e possono dirigere Cas9 per la scissione site-specific, consentendo efficiente interruzione gene NHEJ mediata, così come HDR-mediata precise modifiche nucleotide in presenza di brevi modelli di donatori di DNA a singolo filamento (ssDNA). Il sistema può essere iCRISPRutilizzato per generare con successo un pannello di linee HPSC malattia mimando con biallelica (omozigote o eterozigote composto) o eterozigoti mutazioni perdita-di-funzione in importanti geni dello sviluppo 5, 9. Mentre un certo numero di gruppi hanno segnalato l&#39;editing gene efficiente utilizzando CRISPR / Cas in hPSCs, il successo rimane limitata a un piccolo numero di laboratori tecnologicamente abili. La piattaforma iCRISPR offre una soluzione efficace e semplice per l&#39;editing gene di routine da ricercatori di differenti livelli di abilità, ed è già stato utilizzato in una serie di studi pubblicati dal nostro gruppo e altri 9, 10, 11, 12. Questo approccio è stato ulteriormente esteso a tacere inducibile basata sull&#39;espressione di dCas9-KRAB 13. Insieme con il progresso nel genoma di modifica technologia, miglioramenti significativi sono stati raggiunti anche in HPSC manutenzione e la differenziazione diretto. Condizioni di coltura per hPSCs si sono evoluti da condizioni medie del mouse irradiato fibroblasti embrionali (IMEF) alimentatore-dipendenti a condizioni di libero-feeder sui componenti della matrice extracellulare definiti, e dalle formulazioni multimediali complessi di costituzione chimica definita 14. Tali miglioramenti hanno ridotto la variabilità in hPSCs a causa di differenze da lotto a lotto di componenti di ricambio Imef preparazione e siero eliminazione diretta, e quindi fornire un ambiente più riproducibile per la differenziazione HPSC. Nel frattempo, una migliore conoscenza delle vie di segnalazione che regolano lo sviluppo embrionale umano, così come le scoperte di high-throughput screening di droga, hanno portato ad un miglioramento dei protocolli di differenziazione 15, 16, 17, 18. Questi protocolli più strettamente imitano in vivo fasi di sviluppo e generare tipi di cellule che ricapitolano da vicino le loro controparti in vivo. Per HPSC differenziazione in lignaggio del pancreas, i protocolli iniziali imitato primi anni di sviluppo del pancreas relativamente bene, ma alla fine generato cellule beta polyhormonal che erano di fenotipi fetali immaturi e hanno risposto male alla stimolazione di glucosio. Recenti progressi 16, 17, 19, 20 hanno permesso per la generazione di cellule beta pancreatiche come glucosio-reattiva, che ci consentiranno di investigare eventi successivi, come la formazione e l&#39;ulteriore maturazione delle cellule beta monohormonal. Qui, abbiamo dettaglio l&#39;applicazione delle linee genoma modificato per lo studio dello sviluppo del pancreas, combinando il sistema iCRISPR con la piattaforma HPSC basata in vitro la differenziazione verso pancr glucosio-reattivacellule beta-like eatic. Questo accoppiamento di potenti strumenti di editing del genoma con un miglioramento del protocollo di differenziazione HPSC non solo offre la velocità e la scala necessarie a soddisfare la crescente domanda per la convalida malattia causalità, ma consente anche di sofisticate manipolazioni genetiche per ulteriori indagini meccanicistici in controllo trascrizionale alla base dello sviluppo normale e la malattia 9 .

<table><tbody><tr><td>Terreno chimicamente definito (E8)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1517001</td><td>Terreno basale Essential 8 e integratore Essential 8 inclusi</td></tr><tr><td>Forma umana ricombinante tronca di vitronectina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A14700</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore ROCK Y-27632</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1049</td><td></td></tr><tr><td>Reagente di dissociazione (enzima TrypLE Select)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12563029</td><td>1x, privo di origine animale, enzima ricombinante</td></tr><tr><td>G418 Solfato</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10131035</td><td>Geneticin Antibiotico selettivo</td></tr><tr><td>Puromicina dicloridrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8833</td><td>Puromicina Antibiotico selettivo</td></tr><tr><td>DNA polimerasi (Herculase II Fusion)</td><td>Agilent Technologies</td><td>600679</td><td>Kit PCR</td></tr><tr><td>MEGAshortscript T7 Trascrizione kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM1354</td><td></td></tr><tr><td>Kit di pulizia della trascrizione MEGAclear</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM1908</td><td></td></tr><tr><td>Idlato di doxiciclina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985062</td><td>Siero ridotto</td></tr><tr><td>Medium Lipofectamina RNAiMAX Reagente di trasfezione</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>13778150</tr><tr><td>DNeasy Blood & Kit di tessuti</td><td>QIAGEN</td><td>69504</td><td>Kit di estrazione del DNA genomico</td></tr><tr><td>Proteinasi K</td><td>Roche</td><td>3115879001</td><td></td></tr><tr><td>MCDB 131 medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10372-019</td><td></td></tr><tr><td>BLAR medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Realizzato su misura con una formulazione pubblicata (Rezania et al., 2014)</td></tr><tr><td>Integratore di L-glutammina (GlutaMAX)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>144-55-8</td><td></td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>LAMPIRE Biological Laboratories</td><td>7500855</td><td>Senza acidi grassi</td></tr><tr><td>GDF8</td><td>PeproTech</td><td>120-00</td><td></td></tr><tr><td>CHIR-99021</td><td>Stemgent</td><td>04-0004</td><td>Inibitore GSK-3</td></tr><tr><td>Acido L-ascorbico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544</td><td>Vitamina C</td></tr><tr><td>FGF7</td><td>R& D Systems</td><td>251-KG</td><td></td></tr><tr><td>SANT1</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1974</td><td>Inibitore del riccio</td></tr><tr><td>RA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625</td><td>Acido retinoico</td></tr><tr><td>LDN</td><td>Stemgent</td><td>04-0019</td><td>Inibitore BMP</td></tr><tr><td>IWP-2</td><td>Tocris Bioscience</td><td>3533</td><td>Antagonista Wnt&nbsp;</td></tr><tr><td>ITS-X</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51500-056</td><td></td></tr><tr><td>TPB</td><td>EMD Millipore</td><td>565740-1MG</td><td>Attivatore PKC</td></tr><tr><td>3,3',5-Triiodo-L-tironina (T3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>ALK5i II</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>ALX-270-445</td><td>ALK5 inibitore II</td></tr><tr><td>ZnSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z0251</td><td></td></tr><tr><td>Eparina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>GSiXX</td><td>EMD Millipore</td><td>565789</td><td>Inibitore della gamma secretasi XX, inibitore della segnalazione NOTCH</td></tr><tr><td>N-Cys (N-acetil cisteina)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>Trolox</td><td>EMD Millipore</td><td>648471</td><td>analogo della vitamina E</td></tr><tr><td>R428</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S2841</td><td>recettore AXL tirosin-chinasi inibitore</td></tr><tr><td>24 mm Transwell con inserto</td><td>Corning Life Sciences</td><td>3414</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser Xcell Electroporation System</td><td>Bio-Rad</td><td>1652660</td><td></td></tr><tr><td>0,4 cm Cuvette per elettroporazione</td><td>Bio-Rad</td><td>1652081</td><td></td></tr><tr><td>AAVS1-TALEN-L</td><td>Addgene</td><td>59025</td><td></td></tr><tr><td>AAVS1-TALEN-R</td><td>Addgene</td><td>59026</td><td></td></tr><tr><td>AAVS1-Neo-M2rtTA</td><td>Addgene</td><td>60843</td><td></td></tr><tr><td>AAVS1-Puro-iCas9</td><td>Addgene</td><td>58409</td><td></td></tr><tr><td>T7 Endonucleasi I</td><td>NEB</td><td>M0302L</td><td></td></tr><tr><td>Tampone 2</td><td>NEB</td><td>B7002S</td><td>NEBuffer 2</td></tr><tr><td>Oligonucleotide lungo</td><td>Eton Bioscience o IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SOX17 anticorpo</td><td>R & D Systems</td><td>AF1924</td><td>1:500</td></tr><tr><td>FOXA2 anticorpo</td><td>Millipore</td><td>07-633</td><td>1:100</td></tr><tr><td>CXCR4-APC anticorpo</td><td>R& D Systems</td><td>FAB170A</td><td>1:25</td></tr><tr><td>PDX1 anticorpo</td><td>R& D Systems</td><td>AF2419</td><td>1:500</td></tr><tr><td>NKX6.1 anticorpo</td><td>DSHB</td><td>F55A12</td><td>1:500</td></tr><tr><td>NKX2.2 anticorpo</td><td>DSHB</td><td>74.5A5</td><td>1:100</td></tr><tr><td>NEUROD1 anticorpo</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-1084</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Anticorpo insulina</td><td>Dako</td><td>A0564</td><td>1:2.000</td></tr><tr><td>Anticorpo peptide</td><td>C DSHB</td><td>GN-ID4-c</td><td>1:2.000</td></tr><tr><td>Anticorpo glucagone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2654</td><td>1:1.000</td></tr></tbody></table>

genome editing e di differenziazione regia di hpscs per interrogare determinanti lineage in sviluppo umano del pancreas

Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development

Interrogazione funzione del gene in auto-rinnovamento o differenziazione delle cellule staminali umane pluripotenti (hPSCs) offre una valida piattaforma per comprendere lo sviluppo umano e la dissezione dei meccanismi della malattia in un piatto. Per sfruttare al meglio questo potenziale applicazione richiede strumenti di genoma-editing efficiente per generare mutanti HPSC nei geni associati alla malattia, così come in vitro protocolli di differenziazione HPSC per la produzione di tipi di cellule malattie rilevante che ricapitolano da vicino le loro controparti in vivo. Una piattaforma genoma-editing efficiente per hPSCs chiamato iCRISPR è stata sviluppata attraverso targeting TALEN-mediata di una cassetta di espressione Cas9 nel locus AAVS1. Qui, i protocolli per la generazione di linee inducibili Cas9 HPSC utilizzando cellule coltivate in un mezzo chimicamente definito e una condizione priva di alimentazione sono descritti. Le procedure dettagliate per l&#39;utilizzo del sistema di iCRISPR per knockout gene o precise alterazioni genetiche in hPSCs, sia attraverso non-omologa end che unisce (NHEJ) o tramite precise alterazioni nucleotidiche utilizzando un modello di riparazione di omologia-diretto (HDR), rispettivamente, sono inclusi. Questi procedimenti tecnici sono descrizioni di progettazione, produzione, e trasfezione di RNA guida CRISPR (gRNAs); la misurazione del tasso di mutazione CRISPR mediante saggi T7E1 o RFLP; e la creazione e la validazione delle linee mutanti clonali. Infine, le procedure di cronaca per la differenziazione HPSC in cellule beta-pancreatiche come glucosio-reattiva imitando in vivo sviluppo embrionale del pancreas. Combinando la tecnologia iCRISPR con differenziazione HPSC diretto permette l&#39;esame sistematico della funzione del gene per migliorare la nostra comprensione dei meccanismi di sviluppo e di malattia diabete pancreatico.

Protocolli per generare linee mutanti HPSC che utilizzano la piattaforma iCRISPR e di differenziare hPSCs in cellule beta-come il glucosio-reattiva sono descritti. La combinazione di tecnologia di editing genoma con differenziazione HPSC-diretto fornisce una piattaforma potente per l&#39;analisi sistematica del ruolo dei determinanti lignaggio nello sviluppo umano e la progressione della malattia.

Genome Editing e di differenziazione Regia di hPSCs per interrogare determinanti Lineage in Sviluppo Umano del pancreas

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding ...

Questo protocollo illustra come stabilire la piattaforma iCRISPR per la modifica rapida del genoma nelle cellule staminali pluripotenti umane (hPSC), e come integrare linee con genoma modificato mediante differenziazione pancreatica diretta delle hPSC per studiare lo sviluppo e le malattie pancreatiche umane. Questi metodi possono contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dello sviluppo pancreas umano, come il controllo genetico dello sviluppo pancreas normale e la base molecolare del diabete. Il principale vantaggio di queste tecniche è che permettono di modificare in modo efficiente geni di interesse nelle hPSC e di utilizzare queste linee cellulari modificate per studi in vitro sullo sviluppo e le malattie pancreatiche umane.Coltivare le cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) in condizioni chimicamente definite e senza cellule di supporto, su piatti rivestiti con vitronectina umana troncata. Il giorno precedente l'elettroporazione, aggiungere 10 micromolar di inibitore ROCK durante il cambio del mezzo. Nel giorno dell'elettroporazione, preparare in anticipo piatti da 10 centimetri rivestiti con vitronectina.Quindi rimuovere il mezzo di coltura dalle cellule, lavare una volta con PBS senza calcio e magnesio, quindi trattare le cellule con il reagente di dissociazione 1X a 37 gradi Celsius per circa tre minuti. Successivamente, aspirare il reagente di dissociazione prima che le cellule si stacchino e aggiungere 10,5 millilitri di mezzo completo. Utilizzare un pipettaggio delicato per ottenere una sospensione monocellulare prima di trasferire nei tubi da centrifuga.Eseguire un conteggio cellulare su 500 microlitri di sospensione cellulare utilizzando un contatore cellulare automatico. Successivamente, centrifugare le hPSC a 200 × g per cinque minuti. Risospendere le cellule in PBS freddo a una concentrazione di 12,5 × 106 cellule per millilitro e aliquotare in volumi da 800 microlitri.Aggiungere i plasmidi in ciascuna sospensione di hPSC da 800 microlitri e mescolare bene. Trasferire la miscela in una cuvetta da 0,4 centimetri per elettroporazione e mantenere sul ghiaccio per circa cinque minuti. Elettroporare le cellule utilizzando un sistema di elettroporazione a 250 volt e 500 microfarad.È fondamentale utilizzare cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs) sane e in proliferazione per la modifica del genoma. Dopo l'elettroporazione, trasferire le cellule in un tubo conico da 15 millilitri contenente cinque millilitri di mezzo completo pre-riscaldato e quindi pellettizzare le cellule. Risospendere le cellule in 10 millilitri di mezzo completo con inibitore ROCK a 10 micromolare, e seminare uno per dieci alla sesta, 2,5 per dieci alla sesta e cinque per dieci alla sesta cellule provenienti da ciascuna elettroporazione su piastre rivestite con vitronectina, in modo che almeno una delle piastre presenti un numero sufficiente di colonie monocellulari da poter selezionare.Coltivare le cellule a 37 gradi Celsius. Al secondo giorno, iniziare la selezione con neomicina aggiungendo mezzo contenente 500 microgrammi per millilitro di solfato di G418. Al sesto giorno, iniziare la selezione con puromicina aggiungendo mezzo contenente un microgrammo per millilitro di cloridrato di puromicina.Nei giorni 10-12, le colonie di hPSC a cellula singola raggiungeranno un diametro di uno-due millimetri. A questo punto, selezionare 12-24 colonie al microscopio stereoscopico. Disaggregare meccanicamente le colonie di hPSC in piccoli frammenti utilizzando una punta da pipetta da 200 microlitri e trasferire direttamente le cellule in piastre da 24 pozzetti rivestite con vitronectina.Ventiquattro ore prima della trasfezione dell'RNA guida, trattare le iCas9 hPSCs con due microgrammi per millilitro di doxiciclina. Nel giorno della trasfezione, preparare piastre da 24 pozzetti rivestite con vitronectina e dissociare le cellule iCas9 in singole cellule utilizzando il reagente di dissociazione 1X come in precedenza. Successivamente, centrifugare le cellule a 200 volte G per cinque minuti e risospendere le cellule a 0,5 × 10⁶ cellule per millilitro in mezzo completo integrato con due microgrammi per millilitro di doxiciclina e 10 micromolari di inibitore della ROCK.Piastrare 500 microlitri delle cellule risospese in singoli pozzetti di una piastra a 24 pozzetti. Per ogni RNA guida, preparare le seguenti miscele di trasfezione. Miscela A, 50 microlitri di mezzo con siero ridotto più un microlitro di RNA guida.Mescolare B: 50 microlitri di mezzo con siero ridotto più tre microlitri di reagente di trasfezione. Combinare la miscela A e la miscela B per ottenere una miscela finale di 100 microlitri e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente. Aggiungere 50 microlitri della miscela alle cellule nelle pozzette duplicate della piastra a 24 pozzetti e mescolare accuratamente.Dopo quattro giorni, estrarre il DNA genomico, amplificare mediante PCR le regioni bersaglio adiacenti alle sequenze di targeting dell'RNA guida ed eseguire una stima dell'efficienza di editing mediante digestione con T7E1. Avviare la differenziazione delle linee di hPSC quando le cellule hanno raggiunto una confluenza dell'80% due giorni dopo la semina. Aggiungere il mezzo per il giorno zero di differenziazione, quindi cambiare il mezzo ogni giorno utilizzando le formule indicate qui.Al giorno 10, esaminare i marcatori del progenitore pancreatico tardivo PP2, PDX1 e NKX6.1, mediante colorazione immunofluorescente di un sottogruppo delle cellule. Procedere quindi alla coltura all'interfaccia aria-liquido trattando innanzitutto le cellule PP2 con un inibitore ROCK da 10 micromolar per quattro ore. Una volta trascorso il tempo di incubazione, dissociare le cellule come in precedenza.Minimizzare la durata del trattamento con il reagente di dissociazione per massimizzare la sopravvivenza cellulare durante la semina alla fase di differenziazione all'interfaccia aria-liquido. Aspirare il reagente di dissociazione prima che le cellule si stacchino. Quindi aggiungere 10 millilitri di mezzo boo-lah alla piastra e disperdere le cellule PP2 in cellule singole pipettando delicatamente su e giù.Recuperare la sospensione monocellulare. Contare il numero di cellule e formare il pellet cellulare. Dopo aver risospeso il pellet cellulare nel mezzo di differenziamento S5, depositare da cinque a dieci microlitri di cellule per spot su un filtro in inserto transwell.Aggiungere il mezzo S5 nella parte inferiore di ogni inserto transwell e incubare con cambi di mezzo fino a quando i marcatori endocrini pancreatici risultano rilevabili mediante colorazione immunofluorescente. Questa figura mostra la riparazione non omologa dei capi liberi mediata da iCRISPR nelle cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs). L’interruzione genica è altamente efficiente, poiché non prevede alcun processo di selezione, e si possono facilmente ottenere dal 20% al 50% di mutanti biallelici.Per alterazioni genetiche efficienti e precise, gli RNA guida vengono cotrasfettati insieme a un donatore di DNA a filamento singolo che porta la specifica alterazione di sequenza, mostrata in rosso. Spesso, per prevenire il re-taglio negli alleli modificati, si raccomanda di includere una mutazione silente nella sequenza PAM, mostrata qui in verde. Con questo sistema, è possibile ottenere circa il 10% di cloni portatori della desiderata modifica genomica mediata da riparazione diretta dall'omologia, senza alterazioni aggiuntive in entrambi gli alleli.Una volta acquisita padronanza della tecnica, occorrono meno di due mesi per stabilire una nuova linea di iPSC con iCas9. Successivamente, è possibile generare diverse linee di colonie di iPSC mutanti nell'arco di uno o due mesi. Dopo aver ottenuto le linee cellulari mutanti, la differenziazione in vitro progressiva delle linee mutanti in cellule simili a beta pancreatiche permette di studiare i passaggi specifici dello sviluppo influenzati da queste mutazioni, consentendo una migliore comprensione dei meccanismi patologici sottostanti.

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JoVE Journal

Genetics

Genetica

Il presente studio descrive un approccio diretto differenziazione nell'indurre la differenziazione pancreatica di cellule staminali embrionali umane. Di grande importanza è la scoperta che cellule endoteliali co-coltura maturazione media di cellule staminali umane embrionali derivano in cellule progenitrici del pancreas di insulina che esprimono.

Delle cellule endoteliali Co-cultura Maturazione media di Cellule Staminali embrionali umane a cellule pancreas che producono insulina in un approccio di differenziazione Regia

L'editing del genoma delle cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) può essere fatto in modo rapido ed efficiente. Qui viene presentata una robusta procedura sperimentale per l'ingegneria genetica delle hPSC, come esemplificato dalla modifica del locus safe harbor AAVS1 per esprimere EGFP e introdurre resistenza agli antibiotici.

Istituzione di Genome-cura pluripotenti umane Linee di cellule staminali: Da Targeting per isolamento

Qui, presentiamo pluripotenti umane protocolli di coltura della cellula formativa (hPSC), utilizzata per differenziare hPSCs in CD34+ progenitori ematopoietici. Questo metodo utilizza la modifica di fase-specifici di Canonica WNT segnalazione per specificare le celle esclusivamente al programma ematopoietica sia definitiva o primitivo.

Regia di differenziazione dei progenitori ematopoietici primitivi e definitivo da cellule staminali pluripotenti umane

Qui si descrive un protocollo a 4 stadi per differenziare le cellule staminali embrionali umane per NKX6-1 + progenitori pancreatici in vitro. Questo protocollo può essere applicata ad una varietà di linee di cellule staminali pluripotenti umane.

Differenziazione efficiente delle pluripotenti cellule staminali per NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; progenitori pancreatici

Questo protocollo descrive in dettaglio la generazione di cellule staminali pluripotenti indotte privo di impronta (iPSCs) da cellule pancreatiche umane in condizioni prive di alimentatore, seguito da editing con CRISPR/Cas9 ribonucleoproteine e caratterizzazione del modificati cloni unicellulari.

Efficiente generazione e la modifica di IPSCs privo di alimentatore da cellule pancreatiche umane utilizzando il sistema di CRISPR-Cas9

Qui, presentiamo un protocollo per generare insulina esprimendo 3D pancreatoids murino da progenitori pancreatici e 10.5 digalleggiante dissociato e mesenchima associato.

Generazione di insulina senza impalcatura, tridimensionale esprimendo Pancreatoids dal Mouse progenitori pancreatico In Vitro

Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per differenziare cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs) in proteina di pancreas/duodeno homeobox 1+ (PDX1+) cellule per la generazione dei lignaggi del pancreas basano sulla crescita di monostrato di tipo non-Colonia di dissociato singole cellule. Questo metodo è adatto per la produzione di cellule derivate da hPSC omogenee, manipolazione genetica e di screening.

Efficiente generazione di Pancreas/duodeno Homeobox Protein 1+ posteriore del Foregut/pancreatico progenitori da hPSCs nelle culture di adesione

Il presente protocollo descrive un metodo potenziato per aumentare la co-espressione dei fattori di trascrizione PDX1 e NKX6.1 nei progenitori pancreatici derivati da cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) in monostrati planari. Ciò si ottiene reintegrando la matrice fresca, manipolando la densità cellulare e dissociando le cellule endodermiche.

Differenziazione di cellule staminali pluripotenti umane in precursori di cellule beta pancreatiche in un sistema di coltura 2D

La differenziazione delle cellule staminali in cellule insulari fornisce una soluzione alternativa al trattamento convenzionale del diabete e alla modellizzazione della malattia. Descriviamo un protocollo dettagliato di coltura di cellule staminali che combina un kit di differenziazione commerciale con un metodo precedentemente convalidato per aiutare a produrre isole derivate da cellule staminali secernenti insulina in un piatto.

Differenziazione di cellule staminali pluripotenti umane in gruppi di isole produttrici di insulina

Questo articolo presenta un protocollo per la differenziazione diretta e l'analisi funzionale di cellule simili a cellule β. Descriviamo le condizioni e i passaggi di coltura ottimali per le cellule staminali pluripotenti umane prima di generare cellule pancreatiche produttrici di insulina. La differenziazione a sei stadi progredisce dalla formazione definitiva dell'endoderma alle cellule funzionali simili a cellule β che secernono insulina in risposta al glucosio.

Protocollo ottimizzato per la generazione di cellule pancreatiche funzionali secernenti insulina da cellule staminali pluripotenti umane

Forniamo un protocollo minimamente invasivo per il trapianto intramuscolare di isolotti di cellule staminali pancreatiche derivate da cellule staminali umane in topi immunodeficienti per l'impianto in vivo e l'analisi a valle.

Trapianto intramuscolare di cellule endocrine pancreatiche derivate da cellule staminali pluripotenti umane nei topi

Scopri la piattaforma iCRISPR per l'editing genomico rapido nelle hPSC e la loro differenziazione in cellule pancreatiche. Questo metodo consente di studiare i determinanti del lineage nello sviluppo umano del pancreas e le basi molecolari del diabete.

Genome Editing e di differenziazione Regia di hPSCs per interrogare determinanti Lineage in Sviluppo Umano del pancreas

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