Genome Editing e di differenziazione Regia di hPSCs per interrogare determinanti Lineage in Sviluppo Umano del pancreas

Questo protocollo dimostra come stabilire la piattaforma iCRISPR per l'editing rapido del genoma nelle hPSC e come incorporare linee modificate nel genoma con differenziazione pancreatica diretta da hPSC per studiare lo sviluppo e la malattia del pancreas umano. Questi metodi possono aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dello sviluppo del pancreas umano, come il controllo genetico del normale sviluppo del pancreas e le basi molecolari del diabete. Il vantaggio principale di queste tecniche è che ci permettono di modificare in modo efficiente i geni di interesse per le hPSC e di utilizzare queste linee cellulari modificate per studi sullo sviluppo e la malattia del pancreas umano in vitro.

Coltura di hPSC in condizioni chimicamente definite e prive di alimentatore su piastre rivestite di vitronectina umana tronca. Il giorno prima dell'elettroporazione, aggiungere 10 inibitori micromolari ROCK durante il cambio del terreno. Il giorno dell'elettroporazione, preparare in anticipo piatti da 10 centimetri rivestiti di vitronectina.

Quindi rimuovere il terreno di coltura dalle cellule, lavare una volta con PBS senza calcio e magnesio, quindi trattare le cellule con il reagente di dissociazione 1X a 37 gradi Celsius per circa tre minuti. Quindi, aspirare il reagente di dissociazione prima che le cellule si siano staccate e aggiungere 10,5 millilitri di terreno completo. Utilizzare un pipettaggio delicato per formare una sospensione a cellula singola prima di trasferirla nelle provette da centrifuga.

Eseguire una conta cellulare su 500 microlitri di sospensione cellulare utilizzando un contatore di cellule automatizzato. Quindi pellettare le hPSC a 200 volte G per cinque minuti. Risospendere le cellule in PBS freddo a 12,5 volte 10 al sesto di cellule per millilitro e aliquotare in volumi di 800 microlitri.

Aggiungere i plasmidi in ogni sospensione di hPSC da 800 microlitri e mescolare bene. Trasferire il composto in una cuvetta per elettroporazione da 0,4 centimetri e tenere in ghiaccio per circa cinque minuti. Elettroporare le celle utilizzando un sistema di elettroporazione a 250 volt e 500 microfarad.

È fondamentale utilizzare hPSC sane e proliferanti per l'editing del genoma. Dopo l'elettroporazione, trasferire le celle in una provetta conica da 15 millilitri con cinque millilitri di terreno completo preriscaldato, quindi pellettare le cellule. Risospendere le cellule in 10 millilitri di terreno completo con 10 inibitori micromolari di ROCK e piastrarle una volta 10 alla sesta, 2,5 volte 10 alla sesta e cinque volte 10 alla sesta cellule da ciascuna elettroporazione su piastre rivestite di vitronectina, in modo che almeno una delle piastre abbia colonie unicellulari sufficienti per il prelievo.

Coltivare le cellule a 37 gradi Celsius. Il secondo giorno, iniziare la selezione della neomicina aggiungendo un terreno contenente 500 microgrammi per millilitro di solfato G418. Il sesto giorno, iniziare la selezione della puromicina aggiungendo un terreno contenente un microgrammo per millilitro di puromicina dicloridrato.

Nei giorni da 10 a 12, le colonie di singole cellule hPSC raggiungeranno uno o due millimetri di diametro. A questo punto, raccogli da 12 a 24 colonie sotto uno stereomicroscopio. Disaggregare meccanicamente le colonie di hPSC in piccoli pezzi utilizzando un puntale per pipette da 200 microlitri e trasferire le cellule direttamente in piastre a 24 pozzetti rivestite di vitronectina.

24 ore prima della trasfezione dell'RNA guida, trattare le hPSC iCas9 con due microgrammi per millilitro di doxiciclina. Il giorno della trasfezione, preparare piastre a 24 pozzetti rivestite di vitronectina e dissociare le cellule iCas9 in singole cellule utilizzando il reagente di dissociazione 1X come in precedenza. Successivamente, pellettare le cellule a 200 volte G per cinque minuti e risospendere le cellule a 0,5 volte 10 fino alla sesta cellula per millilitro in terreno completo integrato con due microgrammi per millilitro di doxiciclina e 10 inibitori micromolari di ROCK.

Piastra 500 microlitri delle cellule risospese nei singoli pozzetti della piastra a 24 pozzetti. Per ogni RNA guida, creare le seguenti miscele di trasfezione. Miscela A, 50 microlitri di terreno sierico ridotto più un microlitro di RNA guida.

Miscela B, 50 microlitri di terreno sierico ridotto più tre microlitri di reagente di trasfezione. Unire le miscele A e B per ottenere una miscela da 100 microlitri e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente. Aggiungere 50 microlitri della miscela alle celle nei pozzetti duplicati della piastra a 24 pozzetti e mescolare bene.

Dopo quattro giorni, estrarre il DNA genomico, la PCR amplificare le regioni bersaglio che fiancheggiano le sequenze di targeting dell'RNA guida e stimare l'efficienza di editing utilizzando la digestione T7E1. Iniziare la differenziazione delle linee hPSC quando le cellule hanno raggiunto l'80% di confluenza due giorni dopo la semina. Aggiungi differenziazione giorno zero medio e quindi cambia il supporto ogni giorno utilizzando le formule mostrate qui.

Il giorno 10, esaminare i marcatori PP2 progenitori pancreatici successivi, PDX1 e NKX6.1 mediante colorazione immunofluorescente di un sottogruppo di cellule. Quindi procedere alla coltura dell'interfaccia aria-liquido trattando prima le cellule PP2 con 10 inibitori micromolari di ROCK per quattro ore. Una volta trascorso il tempo di incubazione, dissociare le cellule come prima.

Ridurre al minimo la durata del trattamento con reagenti di dissociazione per massimizzare la sopravvivenza cellulare per la semina nella fase di differenziazione dell'interfaccia aria-liquido. Aspirare il reagente di dissociazione prima che le cellule si siano staccate. Quindi aggiungere 10 millilitri di terreno boo-lah alla piastra e disperdere le cellule PP2 in singole cellule pipettando delicatamente su e giù.

Raccogli la sospensione a cella singola. Contare il numero di celle e pellettare le cellule. Dopo aver risospeso il pellet di cellule nel mezzo di differenziazione S5, individuare da cinque a 10 microlitri di cellule per punto su un filtro a pozzetto di inserimento.

Aggiungere il terreno S5 sul fondo di ciascun inserto transwell e incubare con i cambiamenti del terreno fino a quando i marcatori endocrini pancreatici non sono rilevabili mediante colorazione immunofluorescente. Questa figura mostra l'unione delle estremità non omologhe mediate da iCRISPR nelle hPSC. Il knockout genico è altamente efficiente, poiché non è coinvolto alcun processo di selezione e si possono facilmente ottenere mutanti biallelici dal 20% al 50%.

Per alterazioni genetiche efficienti e precise, gli RNA guida vengono cotrasfettati con un donatore di DNA a singolo filamento che trasporta l'alterazione della sequenza specifica, mostrata in rosso. Spesso, per prevenire il ritaglio negli alleli modificati, si raccomanda di includere una mutazione silente nella sequenza PAM, mostrata qui in verde. Con questo sistema, è possibile ottenere circa il 10% dei cloni portatori della modifica del genoma mediata dalla riparazione diretta dall'omologia desiderata, senza ulteriori alterazioni in entrambi gli alleli.

Una volta padroneggiata, ci vogliono meno di due mesi per stabilire una nuova linea iCas9 hPSC. Successivamente, una varietà di linee di colonie mutanti hPSC può essere generata entro uno o due mesi. A seguito della generazione di linee genetiche mutanti hPSC, la differenziazione graduale in vitro delle linee cellulari mutanti in cellule pancreatiche beta-simili ci consente di studiare le specifiche fasi di sviluppo influenzate da queste mutazioni, il che consentirà una migliore comprensione dei meccanismi sottostanti della malattia.