Name: La differenziazione in vitro di pluripotenti umane Cellule Staminali in cellule trofoblastiche (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Impara a differenziare cellule staminali pluripotenti umane in cellule trofoblastiche usando BMP4 e inibitori delle vie di segnalazione. Questo metodo efficiente permette di studiare la formazione placentare umana.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato supportato da un Pennsylvania Health Research Formula Fund.

NOTA: Per la differenziazione delle hESC sia o hiPSCs in progenitori trofoblasto, hPSCs coltivati ​​su fibroblasti embrionali di topo (MEF) sono la transizione a alimentatore-Free condizioni per due passaggi prima di iniziare la differenziazione con BMP4 / A / P. Questo processo elimina la contaminazione MEF di cellule differenziate. Qui, vi presentiamo un protocollo per la differenziazione hESC, e lo stesso protocollo può essere applicato a hiPSCs. 1. Cultura e recupero di hESC su irradiati fibroblasti embrionali di topo (MEF) (preparati) <ol><li> Gamma-irradiazione di MEF <ol><li> Rendere 500 ml di terreno per la coltura i MEF: DMEM con 10% FBS, 2 mM L-glutammina, 1x penicillina / streptomicina (Pen / Strep), e 0,1 mM aminoacidi non essenziali (NEAA). </li><li> Scongelare una fiala di MEF primarie e usare medio MEF per la coltura delle cellule. Espandere le MEF primari a 30 lastre con terreno di coltura MEF. NOTA: Le concentrazioni di ossigeno non sono critici per questo passo, in modo dao condizioni fisiologiche (4%) o ambiente (20%) all&#39;interno dell&#39;incubatore possono essere utilizzati. </li><li> Raccogliere il MEF. Utilizzare 0,25% tripsina per rimuovere i MEF dalle piastre e trasferire le cellule in una provetta conica. Posizionare i MEF in uno strumento di irradiazione ed esporre le cellule a 3.500 grigi. NOTA: La quantità di tempo dipenderà dall&#39;attività della sorgente all&#39;interno dell&#39;unità irradiatore. </li><li> Risospendere le MEF irradiati con terreno di coltura MEF e contare il numero di cellule utilizzando un emocitometro. </li><li> Agglomerare le MEF utilizzando una centrifuga e aggiungere il 50% terreno di coltura di cellule MEF e il 50% di media (80% FBS e il 20% terreno di coltura MEF) di congelamento. Aliquota 1 x 10 6 cellule per fiala. </li><li> Posizionare le fiale MEF irradiati in un congelatore -80 ° C durante la notte, e poi trasferirli ad azoto liquido per la conservazione a lungo termine. </li></ol></li><li> Scongelare MEF surgelati e hESC per la cultura <ol><li> Fare 500 ml di terreno hESC: DMEM / F-12 con il 20% di siero Replacement, 0.1 mM NEAA, 2 mM L-glutammina, 10 ng / ml bFGF, 0,1 mM ß-mercaptoetanolo, e 1x Pen / Strep. </li><li> Scongelare una fiala di MEF un giorno prima lo scongelamento delle hESC. Coat un 6-bene con 0,1% di gelatina, utilizzando 1 ml per ogni bene. Incubare per almeno 20 minuti a temperatura ambiente, e quindi rimuovere la gelatina. </li><li> Rimuovere una fiala di MEF di conservazione in azoto liquido e immergere la provetta in un bagno di acqua C 37 °. Guarda il flacone a intermittenza fino a quando solo piccoli cristalli di ghiaccio rimangono. trasferire rapidamente il contenuto della fiala per 9 ml di terreno MEF all&#39;interno di un tubo da 15 ml. </li><li> Agglomerare le cellule per centrifugazione a 200 xg per 5 min. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in media MEF. Aliquota del MEF in modo uniforme su una piastra da 6 pozzetti. Mettere la piastra in un 37 ° C a basso ossigeno (4%) incubatore durante la notte. </li></ol></li><li> La cultura di routine di hESC sul MEF <ol><li> Rimuovere una fiala hESC da azoto liquido e scongelare rapidamente la fiala con un 37 ° C bagnomaria. pipettare delicatamente le hESC in un tubo da 15 ml contenente 9 ml di terreno hESC e spin down a 200 xg per 5 min. Rimuovere il mezzo e risospendere le cellule con 1 ml di terreno hESC. </li><li> Aspirare il medium MEF dalla piastra preparato al punto 1.2.4 e aggiungere 1 ml di terreno hESC. Aggiungere inibitore della roccia Y-27632 (10 micron) al mezzo hESC. Trasferire le hESC sul MEF. </li><li> Mettere le cellule in un incubatore a 37 ° C a basso ossigeno (4%) durante la notte. Sostituire la media hESC quotidiano. Raschiare le cellule differenziate con una pipetta Pasteur, visualizzati sotto un microscopio verticale a 4X. </li><li> Il passaggio hESCs ogni 4-6 giorni, a seconda della confluenza cellulare e la dimensione delle colonie hESC. Preparare un piatto di MEF il giorno prima passaging. Quando le cellule sono pronte per passaggio, rimuovere il terreno hESC e lavare il pozzo di 1 ml di PBS. </li><li> Aggiungere 1 mg / ml di collagenasi (preriscaldata a 37 ° C), incubare a 37 ° C per 5 min, e rimuovere la collagenasi. Wcenere le cellule con PBS, aggiungere 1 ml di terreno hESC per bene, e raschiare manualmente le cellule in piccoli ciuffi utilizzando la punta di una pipetta da 5 ml. Trasferire i grumi di cellule sospese in un pozzo (s) nuovo MEF rivestite. </li></ol></li></ol> 2. Transizione di hESC dal MEF per alimentatore-Free Condizioni su piastre di matrice extracellulare rivestite <ol><li> Preparare MEF condizionata media (CM) <ol><li> Piastra le MEF irradiati in un pallone T75 al 90-100% confluenza; è importante che i MEF sono densamente placcati. Osservare le cellule utilizzando un microscopio per determinare se essi hanno attaccato al fondo del pallone (MEF attribuiscono circa 6 ore dopo la placcatura o il giorno successivo). NOTA: le cellule manuali liberi galleggiano nel mezzo quando osservate al microscopio. Il giorno successivo, rimuovere medio MEF e aggiungere 25 ml di terreno hESC privi B-FGF. </li><li> Raccogliere il mezzo condizionato dopo 24 ore di incubazione. Sostituire con mezzo fresco al giorno per un massimo di 12 giorni. </li&gt; <li> Filtrare il CM raccolto usando un filtro di 0,22 micron. Prima dell&#39;uso, aggiungere fresca B-FGF al CM. NOTA: CM può essere congelato a -80 ° C e conservato fino a 1 anno. In alternativa, memorizzare il CM a 4 ° C per 2 settimane. </li></ol></li><li> Transizione le hESC della cultura sulle MEF per alimentatore-Free piastre rivestite matrice extracellulare. <ol><li> Preparazione della matrice extracellulare per piastre di coltura dei tessuti di rivestimento <ol><li> Scongelare una aliquota di matrice extracellulare su ghiaccio (circa 3-4 ore). Usando le punte ghiacciate, un tubo da 50 ml a freddo, e medio / F12 DMEM, trasferimento 2 mg di matrice extracellulare in 24 ml di DMEM ghiacciata / F-12 (la diluizione dipende dalla concentrazione della matrice extracellulare dal fornitore ). </li><li> trasferire immediatamente il tubo da 50 ml di ghiaccio e conservarlo a 4 ° C. Per piastre di coltura di tessuto di rivestimento, aggiungere la giusta quantità di matrice extracellulare diluito al pozzo (ad esempio, 1 ml per pozzetto in una piastra da 6 pozzetti). Agitare per rivestire la piastra ed incubare a temperatura ambiente per almeno 1 ora. </li></ol></li><li> hESC passaggio dal MEF (come al punto 1.3) utilizzando CM contenente B-FGF (10 ng / ml). <ol><li> Aspirare per rimuovere la matrice extracellulare dalla nuova piastra e aggiungere CM contenente B-FGF. Trasferire i ciuffi cellulari raschiate dalla piastra MEF con una pipetta e un&#39;aliquota nella piastra di matrice rivestita extracellulare. Incubare al 37 ° C a basso ossigeno incubatore durante la notte. </li><li> Sostituire il CM con il mezzo B-FGF quotidiana; la quantità di mezzo dipenderà dalla dimensione del pallone di coltura. Utilizzare 2 ml di terreno per un 6-bene bene. Raschiare le cellule differenziate con una pipetta Pasteur. </li><li> hESC Passage ogni 6-7 giorni, quando le colonie sono luminose se visto sotto il microscopio. NOTA: colonie hESC coltivate su piastre matrice extracellulare rivestite sviluppano più grandi rispetto alle cellule MEF-coltura. </li><li> Quando le cellule libera-feeder sono pronti per il passaggio, rimuovere il supporto, lavare dall&#39;inserzionistading 1 ml di PBS utilizzando una pipetta, aspirare per rimuovere il PBS, aggiungere 0,5 mg / ml dispasi (preriscaldata a 37 ° C) con una pipetta e incubare a 37 ° C per 5 min. </li><li> Lavare le cellule con PBS aggiungendo 2 ml di PBS per pozzetto ed aspirando dopo. Aggiungere 1 ml di CM per pozzetto e raschiare manualmente le cellule in piccoli ciuffi utilizzando la punta di una pipetta da 5 ml. </li><li> Piastra i grumi di cellule sospese in nuove piastre di matrice extracellulare rivestite; le cellule devono aderire dopo 24 ore. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. La differenziazione delle hESC Utilizzo BMP4 / A / P <ol><li> Preparare il mezzo di differenziazione. Utilizzare CM (privo B-FGF) e aggiungere (fresca) BMP4 (50 ng / ml), A83-01 (1 mM), e PD173074 (0,1 pM). Aggiungere questi inibitori alla CM prima dell&#39;uso. </li><li> Utilizzare hESC senza alimentatore crescono sulle piastre di matrice extracellulare rivestite per 1 passaggio, coltivate all&#39;interno di un incubatore a 4% di ossigeno. Dopo il primo passaggio su piastre matrice extracellulare rivestite,lasciare che le cellule si attaccano per 24 ore. Il giorno successivo, avviare la differenziazione. Rimuovere il CM (che contiene B-FGF) e sostituirlo con CM contenente BMP4 / A / P (2 ml per bene in un 6-pozzetti). Continuare a coltura le cellule utilizzando livelli di ossigeno 4%. </li><li> Sostituire il CM contenente BMP4 / A / P (2 ml / pozzetto per un 6-pozzetti) ogni 2 giorni. Aspirare per rimuovere il vecchio medio e aggiungere nuove CM con una pipetta. Il secondo giorno dopo l&#39;aggiunta e rimozione BMP4 B-FGF (considerato differenziazione giorno 2), la morfologia cellulare cambierà, apparendo più grande quando osservata con un microscopio. NOTA: Indifferenziato cellule, che presentano bordi arrotondati luminosi, non saranno presenti. </li><li> Raccogliere le cellule al time-punti desiderati. Le cellule differenziate si fermeranno dividendo dopo circa 2 settimane. cellule trasfezione durante questo periodo di tempo (vedere la sezione successiva). </li></ol> 4. Trasfezione di cellule trofoblastiche con siRNA o il DNA plasmidi <ol><li> Preparare cellule trofoblastiche per trasfezione </strong&gt; <ol><li> hESC cultura per due passaggi sulla matrice extracellulare dopo il loro trasferimento dalle MEF (vedi punto 2.2). Utilizzare media hESC contenente B-FGF. </li><li> Dividere le hESC su una nuova piastra matrice extracellulare un giorno prima differenziazione. Alta confluenza cellulare è importante, così dividere le celle 1: 1 su una nuova piastra / pozzetto, che garantirà almeno il 50% di confluenza il giorno successivo. Incubare le cellule durante la notte in incubatore a basso ossigeno. NOTA: hESC non devono essere contati durante questa fase. </li><li> Il giorno successivo, sostituire il supporto con il mezzo di differenziazione (CM contenente BMP4 / A / P e privo di B-FGF, con 2 ml / pozzetto per un 6-pozzetti). Rimuovere il vecchio mezzo tramite aspirazione e trasferire il nuovo mezzo (2 ml) con una pipetta. Mettere le cellule in un incubatore a basso ossigeno (4% di ossigeno) durante la notte. </li></ol></li><li> Trasfezioni con siRNA per geni interruzione o utilizzando DNA plasmide <ol><li> Differenziare le cellule fino a quando il tempo-desideratopunto (tra i giorni 1 e 14). Il giorno prima della transfezione, trypsinize le cellule utilizzando 0,05% tripsina per 5 min. li piastra alla confluenza desiderata (a seconda del protocollo di reagente di trasfezione) su una piastra di gelatina rivestita (aggiungere 0,1% di gelatina ad una piastra di coltura tissutale per 20 minuti e aspirare per rimuovere). Aggiungere CM contenente BMP4 / A / P (manca B-FGF) e incubare una notte. </li><li> Il giorno successivo, aggiungere terreno di differenziamento fresco alle cellule. Trasfezione siRNA utilizzazione di un reagente di trasfezione di siRNA. Per DNA plasmide, usare un reagente lipofectamina appropriata. </li><li> Seguire il protocollo prodotto come descritto per ciascun reagente di trasfezione. Trasferire i complessi siRNA-Lipofectamine per ciascun / pozzetti delle cellule, mescolare delicatamente, e la cultura nelle cellule durante la notte in un incubatore a basso ossigeno. NOTA: Alcuni reagenti di trasfezione sono inibite dagli antibiotici, le quali richiedono CM manca Pen / Strep. </li><li> Il giorno successivo, sostituire con i media differenziazione fresco. </li><li> Raccogliere le cellule al desideriod time-punti (ad esempio, 24 ore, 48 ore e 72 ore) per verificare l&#39;efficienza gene interruzione usando RT-PCR quantitativa. Per le cellule di raccolta, utilizzare 0,05% tripsina, aggiungendo 1 ml per pozzetto ed incubare per 5 min a 37 ° C. Aggiungere 5 ml di terreno MEF per pozzetto per neutralizzare la tripsina. Centrifugare le cellule a 200 xg per 5 min e utilizzare il pellet cellulare per l&#39;isolamento dell&#39;RNA. </li></ol></li></ol> 5. patogeni infezione di cellule trofoblastiche: Sendai Infezione virale <ol><li> Preparare hESC per la differenziazione <ol><li> hESC cultura per due passaggi sulla matrice extracellulare dopo il trasferimento dai MEF (vedi punto 2.2). Utilizzare media hESC contenente B-FGF. </li><li> Dividere le hESC su una nuova piastra matrice extracellulare un giorno prima differenziazione. Alta confluenza cellulare è importante, le cellule così dividere 1: 1 su una nuova piastra / pozzetto, che garantirà almeno il 50% di confluenza il giorno successivo. Incubare le cellule durante la notte in un incubatore a basso ossigeno (4% di ossigeno). &lt;br /&gt; Nota: hESC non devono essere contati durante questa fase. </li><li> Il giorno successivo, sostituire il supporto con il mezzo di differenziazione (CM contenente BMP4 / A / P e privo di B-FGF) e cultura durante la notte in un incubatore a basso ossigeno (4% di ossigeno). </li></ol></li><li> Sendai infezione virale delle cellule trofoblastiche <ol><li> Un giorno prima del giorno di differenziazione desiderata, trypsinize le cellule di differenziazione (a singole cellule) con 0,05% tripsina per 5 minuti e trasferirli su un piatto di gelatina rivestita. Aggiungere mezzo differenziazione e incubare una notte in un incubatore a basso ossigeno. </li><li> Il giorno successivo, aggiungere mezzo di infezione (questo varierà a seconda del virus). Usa CM manca Pen / Strep contenente BMP4 / A / P, utilizzando 0,5 ml per un pozzetto di un 6-pozzetti. Aggiungere virus Sendai per MOI = 1. Incubare per 8 ore in un incubatore a basso ossigeno. </li><li> Se sono necessari ulteriori punti temporali, rimuovere il supporto di virus contenente dopo 4 ore e sostituirlo con BMP4 / A / P CM. raccogliere le celluleper l&#39;isolamento di RNA con un raschietto cellulare. </li><li> Determinare l&#39;efficienza di infezione virale effettuando qRT-PCR per i geni coinvolti nella risposta virale 18. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Rugg-Gunn, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+features+of+the+mouse+trophoblast%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+biomedicine+online%22%5BJournal%5D)">Epigenetic features of the mouse trophoblast.</a> Reproductive biomedicine online. 25 (1), 21-30 (2012).</li>
<li>Rossant, J., Cross, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placental+development%3A+lessons+from+mouse+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Placental development: lessons from mouse mutants.</a> Nature reviews. Genetics. 2 (7), 538-548 (2001).</li>
<li>Hertig, A. T., Rock, J., Adams, E. C., Menkin, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thirty-four+fertilized+human+ova%2C+good%2C+bad+and+indifferent%2C+recovered+from+210+women+of+known+fertility%3B+a+study+of+biologic+wastage+in+early+human+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Thirty-four fertilized human ova, good, bad and indifferent, recovered from 210 women of known fertility; a study of biologic wastage in early human pregnancy.</a> Pediatrics. 23 (1 Part 2), 202-211 (1959).</li>
<li>Steptoe, P. C., Edwards, R. G., Purdy, J. M. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/nature/journal/v229/n5280/abs/229132a0.html">Human blastocysts grown in culture.</a> Nature. 229 (5280), 132-133 (1971).</li>
<li>Delorme-Axford, E., Sadovsky, Y., Coyne, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+placenta+as+a+barrier+to+viral+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Virology%22%5BJournal%5D)">The placenta as a barrier to viral infections.</a> Annual Review of Virology. 1, 133-146 (2014).</li>
<li>Ji, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placental+trophoblast+cell+differentiation%3A+physiological+regulation+and+pathological+relevance+to+preeclampsia%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+aspects+of+medicine%22%5BJournal%5D)">Placental trophoblast cell differentiation: physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia.</a> Molecular aspects of medicine. 34 (5), 981-1023 (2013).</li>
<li>Bilban, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+trophoblast+invasion-related+genes%3A+heme+oxygenase-1+controls+motility+via+peroxisome+proliferator-activated+receptor+gamma%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Identification of novel trophoblast invasion-related genes: heme oxygenase-1 controls motility via peroxisome proliferator-activated receptor gamma.</a> Endocrinology. 150 (2), 1000-1013 (2009).</li>
<li>Xu, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP4+initiates+human+embryonic+stem+cell+differentiation+to+trophoblast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">BMP4 initiates human embryonic stem cell differentiation to trophoblast.</a> Nature biotechnology. 20 (12), 1261-1264 (2002).</li>
<li>Amita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+and+unidirectional+conversion+of+human+embryonic+stem+cells+to+trophoblast+by+BMP4%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Complete and unidirectional conversion of human embryonic stem cells to trophoblast by BMP4.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (13), E1212-E1221 (2013).</li>
<li>Genbacev, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+human+trophoblast+progenitor+cell+lines+from+the+chorion%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Establishment of human trophoblast progenitor cell lines from the chorion.</a> Stem Cells. 29 (9), 1427-1436 (2011).</li>
<li>Marchand, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+signature+of+trophoblast+differentiation+in+a+human+embryonic+stem+cell+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+reproduction%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic signature of trophoblast differentiation in a human embryonic stem cell model.</a> Biology of reproduction. 84 (6), 1258-1271 (2011).</li>
<li>Hyslop, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downregulation+of+NANOG+induces+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+extraembryonic+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells%22%5BJournal%5D)">Downregulation of NANOG induces differentiation of human embryonic stem cells to extraembryonic lineages.</a> Stem cells. 23 (8), 1035-1043 (2005).</li>
<li>Harun, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotrophoblast+stem+cell+lines+derived+from+human+embryonic+stem+cells+and+their+capacity+to+mimic+invasive+implantation+events%5BTitle%5D)+AND+%22Human+reproduction%22%5BJournal%5D)">Cytotrophoblast stem cell lines derived from human embryonic stem cells and their capacity to mimic invasive implantation events.</a> Human reproduction. 21 (6), 1349-1358 (2006).</li>
<li>Lichtner, B., Knaus, P., Lehrach, H., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP10+as+a+potent+inducer+of+trophoblast+differentiation+in+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">BMP10 as a potent inducer of trophoblast differentiation in human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> Biomaterials. 34 (38), 9789-9802 (2013).</li>
<li>Chen, Y., Wang, K., Chandramouli, G. V., Knott, J. G., Leach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trophoblast+lineage+cells+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+biophysical+research+communications%22%5BJournal%5D)">Trophoblast lineage cells derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Biochemical and biophysical research communications. , (2013).</li>
<li>Roberts, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+trophoblast+cells+from+human+embryonic+stem+cells%3A+to+be+or+not+to+be%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Differentiation of trophoblast cells from human embryonic stem cells: to be or not to be?</a> Reproduction. 147 (5), D1-D12 (2014).</li>
<li>Sarkar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activin%2Fnodal+signaling+switches+the+terminal+fate+of+human+embryonic+stem+cell-derived+trophoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Activin/nodal signaling switches the terminal fate of human embryonic stem cell-derived trophoblasts.</a> The Journal of biological chemistry. 290 (14), 8834-8848 (2015).</li>
<li>Penkala, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((lncRHOXF1%2C+a+Long+Noncoding+RNA+from+the+X+Chromosome+That+Suppresses+Viral+Response+Genes+during+Development+of+the+Early+Human+Placenta%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">lncRHOXF1, a Long Noncoding RNA from the X Chromosome That Suppresses Viral Response Genes during Development of the Early Human Placenta.</a> Mol Cell Biol. 36 (12), 1764-1775 (2016).</li>
<li>Penkala, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((lncRHOXF1%2C+a+Long+Noncoding+RNA+from+the+X+Chromosome+That+Suppresses+Viral+Response+Genes+during+Development+of+the+Early+Human+Placenta%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">lncRHOXF1, a Long Noncoding RNA from the X Chromosome That Suppresses Viral Response Genes during Development of the Early Human Placenta.</a> Molecular and cellular biology. 36 (12), 1764-1775 (2016).</li>
<li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+human+pluripotent+cells+using+TALE+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases.</a> Nature biotechnology. 29 (8), 731-734 (2011).</li>
<li>Bernardo, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRACHYURY+and+CDX2+mediate+BMP-induced+differentiation+of+human+and+mouse+pluripotent+stem+cells+into+embryonic+and+extraembryonic+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">BRACHYURY and CDX2 mediate BMP-induced differentiation of human and mouse pluripotent stem cells into embryonic and extraembryonic lineages.</a> Cell stem cell. 9 (2), 144-155 (2011).</li>
<li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-term+BMP-4+treatment+initiates+mesoderm+induction+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Short-term BMP-4 treatment initiates mesoderm induction in human embryonic stem cells.</a> Blood. 111 (4), 1933-1941 (2008).</li>
<li>Vallier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+cell+fate+decisions+of+human+embryonic+stem+cells+and+mouse+epiblast+stem+cells+are+controlled+by+the+same+signalling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Early cell fate decisions of human embryonic stem cells and mouse epiblast stem cells are controlled by the same signalling pathways.</a> PloS one. 4 (6), e6082(2009).</li>
<li>Arman, E., Haffner-Krausz, R., Chen, Y., Heath, J. K., Lonai, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+disruption+of+fibroblast+growth+factor+%28FGF%29+receptor+2+suggests+a+role+for+FGF+signaling+in+pregastrulation+mammalian+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Targeted disruption of fibroblast growth factor (FGF) receptor 2 suggests a role for FGF signaling in pregastrulation mammalian development.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (9), 5082-5087 (1998).</li>
<li>Yu, P., Pan, G., Yu, J., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF2+sustains+NANOG+and+switches+the+outcome+of+BMP4-induced+human+embryonic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">FGF2 sustains NANOG and switches the outcome of BMP4-induced human embryonic stem cell differentiation.</a> Cell stem cell. 8 (3), 326-334 (2011).</li>
<li>Sudheer, S., Bhushan, R., Fauler, B., Lehrach, H., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF+inhibition+directs+BMP4-mediated+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+syncytiotrophoblast%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells+and+development%22%5BJournal%5D)">FGF inhibition directs BMP4-mediated differentiation of human embryonic stem cells to syncytiotrophoblast.</a> Stem cells and development. 21 (16), 2987-3000 (2012).</li>
<li>Bischof, P., Irminger-Finger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+cytotrophoblastic+cell%2C+a+mononuclear+chameleon%5BTitle%5D)+AND+%22The+international+journal+of+biochemistry+%26+cell+biology%22%5BJournal%5D)">The human cytotrophoblastic cell, a mononuclear chameleon.</a> The international journal of biochemistry & cell biology. 37 (1), 1-16 (2005).</li>
<li>Cole, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperglycosylated+hCG%2C+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Hyperglycosylated hCG, a review.</a> Placenta. 31 (8), 653-664 (2010).</li>
<li>Apps, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+leucocyte+antigen+%28HLA%29+expression+of+primary+trophoblast+cells+and+placental+cell+lines%2C+determined+using+single+antigen+beads+to+characterize+allotype+specificities+of+anti-HLA+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Human leucocyte antigen (HLA) expression of primary trophoblast cells and placental cell lines, determined using single antigen beads to characterize allotype specificities of anti-HLA antibodies.</a> Immunology. 127 (1), 26-39 (2009).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Abbiamo presentato i passaggi fondamentali per differenziare hESC in progenitori trofoblasto. Questo protocollo è stato recentemente ottimizzato per differenziare rapidamente hESCs con l&#39;aggiunta di inibitori Activin / segnalazione nodale, aumentando la differenziazione di cellule trofoblastiche ed evitando la generazione di progenitori mesoderma, tipicamente osservati con il solo trattamento BMP4. Il sistema modello BMP4 consente per l&#39;esame delle prime fasi della specifica trofoblasto stirpe umana e di espansi...

La placenta è necessario per la crescita e la sopravvivenza del feto durante la gravidanza e facilita lo scambio di gas, sostanze nutritive, prodotti di scarto, e gli ormoni tra la circolazione materna e fetale. Il primo organo formato durante l&#39;embriogenesi dei mammiferi è la placenta, che inizia lo sviluppo 6-7 giorni dopo il concepimento nell&#39;uomo e 3,5-4,5 giorni nel topo 1, 2, 3, 4. cellule trofoblastiche sono le cellule più importanti della placenta, e queste cellule rappresentano uno dei primi eventi di differenziazione lignaggio dell&#39;embrione di mammifero. Essi derivano dalle cellule trophectoderm extra-embrionali esterni della blastocisti preimpianto. La nostra conoscenza delle prime fasi di sviluppo placentare è limitata da restrizioni etiche e logistiche sulla modellazione precoce sviluppo umano. Durante embrionali impianto, trofoblastoinvadono l&#39;epitelio materna e differenziarsi in cellule progenitrici specializzate 5. Citotrofoblasti (CTBS) sono mononucleate, progenitori indifferenziati che si fondono e si differenziano in sinciziotrofoblasti (SYN) e trofoblasto invasive extravilloso (EVTS), che ancorano la placenta all&#39;utero. SYN sono multinucleate, cellule terminalmente differenziate che sintetizzano gli ormoni necessari per sostenere la gravidanza. Gli eventi di differenziazione primi che generano EVTS e SYN sono essenziali per la formazione della placenta, come menomazioni in cellule trofoblastiche risultato in aborto spontaneo, pre-eclampsia e restrizione della crescita intrauterina 1. I tipi di linee cellulari umane trofoblasto che sono stati sviluppati includono immortalati CTBS e coriocarcinoma, che producono ormoni della placenta e di visualizzazione proprietà invasive 6. cellule trofoblastiche primari da placenta primo trimestre umani possono essere isolati, ma le cellule rapidamente differentiate e smettere di proliferare in vitro. È importante sottolineare che, trasformato e linee cellulari primarie avere diversi profili di espressione genica, indicando che le linee cellulari tumorali trofoblasto e immortalate potrebbero non rappresentare accuratamente trophoblasts primarie 7. Inoltre, queste linee sono improbabili per assomigliare placentare trofoblasto progenitori di cellule staminali, perché sono derivati ​​da dopo-prima fase attraverso trimestre terzi. Vi è la necessità di un robusto nel sistema di coltura in vitro di trofoblasto umano nella fase iniziale, al fine di studiare gli eventi precoci della formazione e della funzione placentare. le cellule staminali embrionali umane (hESC), che condividono gli oggetti con massa cellulare interna dell&#39;embrione preimpianto, sono spesso utilizzati per modellare precoce sviluppo umano, compresa la formazione dei primi placenta. Entrambe le cellule indotte umane pluripotenti staminali (hiPSCs) e hESC possono essere differenziati in trofoblasto in vitro su Bone MorProtein phogenic 4 (BMP4) 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15. Questa conversione di cellule pluripotenti cellule trofoblastiche utilizzando BMP4 è specifico per le cellule umane ed è ampiamente usato per studiare lo sviluppo dei primi placenta umana in quanto non richiede l&#39;accesso a embrioni umani 9, 16. Recentemente, si è scoperto che l&#39;aggiunta di inibitori A83-01 (A) e PD173074 (P), che bloccano le vie di segnalazione SMAD2 / 3 e MEK1 / 2, aumenta l&#39;efficienza della differenziazione HPSC in progenitori trophectoderm simili, soprattutto SYNs e EVTS, senza la vasta generazione di mesoderma, endoderma, o cellule ectoderma 9, 17 </sup&gt;. Utilizzando queste condizioni medie, hESC differenziato per 12 giorni hanno simili profili di espressione genica le cellule trophectoderm isolate da embrioni blastocisti-stadio umano e secernono vari ormoni della crescita specifici placentare, sostenere la validità di questo sistema modello in vitro 9, 11. Qui, vi presentiamo un protocollo dettagliato per la differenziazione in vitro di hPSCs in progenitori trofoblasto umani utilizzando BMP4 / A / P terreno di coltura. Queste condizioni producono numero abbondante di cellule per un&#39;ampia varietà di applicazioni, tra RNA sequenziamento, gene perturbazione utilizzando siRNAs, infezioni patogeni e modificazione genetica utilizzando trasfezione lipofezione-mediata.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>11330-057</td><td></td></tr><tr><td>Sostituzione del siero knock out</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td>In questo protocollo si parla di "sostituzione del siero".</td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Invitrogen</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutammina</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15140-155</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanolo</td><td>Sigma</td><td>M-7522</td><td></td></tr><tr><td>B-FGF</td><td>Millipore</td><td>GF-003</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11965-118</td><td></td></tr><tr><td>Dispasi</td><td>Invitrogen</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi di tipo IV</td><td>Invitrogen</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore della roccia Y27632</td><td>Calbiochem</td><td>688000</td><td></td></tr><tr><td>MEF CF1 irradiato I MEF</td><td>GlobalStem</td><td>6001G</td><td>possono essere generati dal giorno embrionale 13,5 e irradiati.</td></tr><tr><td>0,22 &micro; m filtro per siringhe</td><td>Millipore</td><td>SLGS033SS</td><td></td></tr><tr><td>Heracell 150i incubatore a basso contenuto di ossigeno</td><td>Heracell/VWR</td><td>89187-192</td><td>È sufficiente un incubatore per colture tissutali in grado di regolare le concentrazioni di ossigeno.</td></tr><tr><td>BMP4</td><td>R& D Systems</td><td>314-BP-01M</td><td></td></tr><tr><td>A 83-01</td><td>R& D Systems</td><td>2939/10</td><td></td></tr><tr><td>PD173074</td><td>R& D Systems</td><td>3044/10</td><td></td></tr><tr><td>RNAiMax</td><td>Invitrogen</td><td>13778150</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>ThermoFisher</td><td>15596026</td><td>Trizol viene utilizzato per isolare l'RNA totale.</td></tr><tr><td>X-tremeGENE 9</td><td>Roche</td><td>6365779001</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>Questo è indicato come "matrice extracellulare" in questo protocollo.</td></tr></tbody></table>

la differenziazione in vitro di pluripotenti umane cellule staminali in cellule trofoblastiche

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

La placenta è il primo organo di sviluppare durante l&#39;embriogenesi ed è necessario per la sopravvivenza dell&#39;embrione in via di sviluppo. La placenta comprende numerose cellule trofoblastiche che differenziano dalle cellule trophectoderm extra-embrionali di blastocisti preimpianto. Come tale, la nostra comprensione dei primi eventi di differenziazione della placenta umana è limitata a causa delle restrizioni etiche e legali su l&#39;isolamento e la manipolazione di Embriologia Umana. Le cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs) sono un sistema robusto modello per lo studio dello sviluppo umano e possono anche essere differenziate in vitro in cellule trofoblastiche che esprimono i marcatori dei vari tipi di cellule trofoblasto. Qui, vi presentiamo un protocollo dettagliato per differenziare hPSCs in cellule trofoblastiche utilizzando morphogenic proteina ossea 4 e gli inibitori delle vie di segnalazione / nodali activin. Questo protocollo genera vari tipi di cellule trofoblastiche che possono essere transfettate con siRNAper indagare la perdita di funzione fenotipi o possono essere infettati da agenti patogeni. Inoltre, hPSCs possono essere modificati geneticamente e poi differenziate in progenitori trofoblasto per guadagno-di-funzione analizza. Questo vitro metodo di differenziazione per la generazione di trofoblasto umano a partire dalle hPSCs supera le limitazioni etiche e legali di lavorare con i primi embrioni umani, e questo sistema può essere utilizzato per una varietà di applicazioni, tra cui la scoperta di farmaci e ricerca sulle cellule staminali.

Panoramica di differenziazione in vitro di hPSCs Questo protocollo di differenziazione in vitro inizia con hESC indifferenziato coltivati in MEF che la transizione al alimentatore-Free condizioni per un passaggio (Figura 1A). Mentre abbiamo descritto la differenziazione di hESC in questo protocollo, abbiamo usato questo protocollo di differenziarsi con successo hiPSCs in cellule trofoblastiche. ...

Qui, presentiamo un protocollo per generare in modo efficiente cellule trofoblastiche umane da cellule staminali pluripotenti umane utilizzando la proteina morfogenica ossea 4 e inibitori delle vie Activina/Nodale. Questo metodo è adatto per la differenziazione efficiente delle cellule staminali pluripotenti umane e può generare grandi quantità di cellule per la manipolazione genetica.

La differenziazione in vitro di pluripotenti umane Cellule Staminali in cellule trofoblastiche

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è differenziare cellule staminali pluripotenti umane in cellule trofoblastiche umane utilizzando il fattore morfogenetico osseo 4 e inibitori delle vie di segnalazione attiva e nodale, al fine di studiare i primi eventi della formazione e della funzione placentaria umana. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nello studio delle funzioni delle cellule trofoblastiche e del loro processo di formazione. Il principale vantaggio di questa tecnica è la capacità di produrre un'abbondante quantità di cellule trofoblastiche per una vasta gamma di applicazioni, incluse quelle genetiche, e di consentire saggi funzionali delle cellule.Per iniziare l'esperimento, scongelare un'aliquote di matrice extracellulare su ghiaccio per tre o quattro ore. Utilizzando punte fredde di ghiaccio, un tubo conico da 50 millilitri freddo e mezzo equilibrato modificato di Dulbecco, o mezzo DMEM F12, trasferire due milligrammi di matrice extracellulare in 24 millilitri di DMEM F12 freddo di ghiaccio. Trasferire immediatamente il tubo conico da 50 millilitri sul ghiaccio e conservarlo a quattro gradi Celsius.Per rivestire le piastre per colture cellulari, aggiungere un millilitro di matrice extracellulare diluita per pozzetto di una piastra a sei pozzetti. Ruotare delicatamente la piastra per garantire un rivestimento uniforme e incubare la piastra a temperatura ambiente per almeno un'ora. Aspirare la matrice extracellulare dalla nuova piastra e aggiungere mezzo condizionato da fibroblasti embrionali di topo o MEFCM contenente bFGF.Utilizzare una pipetta per trasferire le placchette cellulari prelevate dalla piastra MEF e suddividerle in aliquote nella piastra rivestita con matrice extracellulare. Quindi incubare la piastra. Raschiare le cellule differenziate con una pipetta di Pasteur prima di sostituire quotidianamente il MEFCM con mezzo bFGF, utilizzando due millilitri di mezzo per un pozzetto.Quando le colonie appaiono grandi e brillanti al microscopio, passare le hESC ogni sei o sette giorni. Quando le cellule in coltura senza feeder sono pronte per il passaggio, rimuovere il mezzo e lavare le cellule aggiungendo un millilitro di PBS mediante pipetta. Aspirare il PBS e sostituirlo con 0,5 milligrammi per millilitro di dispasi preriscaldata utilizzando una pipetta.Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Dopo l'incubazione, lavare le cellule con PBS aggiungendo due millilitri di PBS per pozzetto ed aspirare il PBS. Aggiungere un millilitro di CM per pozzetto e staccare manualmente le cellule in piccoli aggregati utilizzando la punta di una pipetta da cinque millilitri.Successivamente, piastrare gli aggregati cellulari sospesi in nuove piastre rivestite con matrice extracellulare. Preparare il mezzo di differenziamento. Utilizzare il CM senza bFGF e aggiungere inibitori freschi prima dell'uso.Utilizzare hESC senza feeder coltivate su piastre rivestite con matrice extracellulare per un passaggio, mantenute in un incubatore a 5% di ossigeno. Dopo il primo passaggio su piastre rivestite con matrice extracellulare, lasciare attaccare le cellule per 24 ore. Il giorno successivo, iniziare la differenziazione rimuovendo il mezzo di coltura contenente bFGF e sostituendolo con mezzo di coltura contenente BMP4/A/P, aggiungendo due millilitri per pozzetto in una piastra a sei pozzetti.Continuare la coltura delle cellule utilizzando livelli di ossigeno al 4%. Sostituire ogni due giorni il mezzo di coltura contenente BMP4/A/P aspirando il vecchio mezzo e aggiungendo del nuovo mezzo contenente BMP4/A/P. Raccogliere le cellule nei punti temporali desiderati.Coltivare le cellule staminali embrionali umane per due passaggi su matrice extracellulare dopo il trasferimento dai MEF utilizzando mezzo per cellule staminali embrionali umane contenente bFGF. È importante mantenere un'elevata confluenza cellulare, quindi suddividere le cellule staminali embrionali umane in rapporto uno a uno su una nuova piastra, in modo da garantire almeno una confluenza del 50% già dal giorno successivo. Incubare le cellule durante la notte nell'incubatore a bassa concentrazione di ossigeno.Il giorno successivo, sostituire il mezzo con due millilitri per pozzetto di mezzo di differenziamento. Incubare le cellule in un incubatore a bassa concentrazione di ossigeno per tutta la notte. Prima della trasfezione, ricoprire una piastra con gelatina aggiungendo lo 0,1% di gelatina a una piastra.Ruotare la piastra per ricoprire uniformemente la superficie e lasciare la piastra a temperatura ambiente. Dopo 20 minuti, rimuovere la gelatina. Differenziare le cellule fino al tempo desiderato.Il giorno prima della trasfezione, trattare le cellule con tripsina 0,05% per cinque minuti. Seminare le cellule alla confluenza desiderata su piastre rivestite con gelatina. Aggiungere il mezzo condizionato contenente BMP4/A/P privo di bFGF e coltivare le cellule durante la notte.Il giorno successivo, aggiungere mezzo di differenziamento fresco alle cellule. Trasfettare gli siRNA utilizzando un reagente per la trasfezione di siRNA. Per il DNA plasmatico, utilizzare un reagente lipofettamina appropriato.Seguire il protocollo del prodotto come descritto per ogni reagente di trasfezione. Trasferire i complessi di siRNA lipofectamina in ogni pozzetto o piastra di cellule e mescolare delicatamente. Successivamente coltivare le cellule tutta la notte in un incubatore a bassa concentrazione di ossigeno.Il giorno successivo, sostituire il mezzo con mezzo di differenziazione fresco. Raccogliere le cellule nei tempi desiderati per verificare l'efficienza di interruzione genica mediante RT-PCR quantitativa. Infine, per raccogliere le cellule, aggiungere un millilitro di tripsina 0,05% per pozzetto e incubare le cellule.Aggiungere cinque millilitri di mezzo MEF per pozzetto per neutralizzare la tripsina. Centrifugare le cellule a 200 × g per cinque minuti e utilizzare il pellet cellulare per l'isolamento dell'RNA. Utilizzando questa tecnica, i cambiamenti morfologici sono chiaramente visibili.Le cellule al primo giorno di differenziamento sono più grandi rispetto a quelle del giorno zero. Procedendo il differenziamento, le cellule si dividono ed espandono a partire dal centro della colonia, crescendo in direzione periferica. Le singole colonie si fondono tra loro entro il quinto giorno di differenziamento, con le cellule che crescono una sopra l'altra.L'analisi di qRT-PCR rivela che i livelli relativi di espressione del marcatore di pluripotenza NANOG si riducono del 75% dopo un giorno di differenziazione quando le cellule sono coltivate con BMP4 e del 90% in presenza di BMP4/A/P. Al secondo giorno di differenziazione, i livelli di NANOG sono molto bassi nelle cellule coltivate in BMP4 da solo o in BMP4/A/P rispetto a quelli coltivati nel mezzo hESC CM contenente beta FGF. Le trasfezioni eseguite utilizzando un plasmide GFP e introdotte in cellule trattate con BMP4/A/P al primo e al terzo giorno di differenziazione hanno ottenuto un'efficienza di trasfezione del 30-50% a 24 ore dalla trasfezione.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come differenziare le cellule pluripotenti umane in cellule trofoblastiche in vitro e di come introdurre costrutti di DNA per manipolare l'espressione genica.

in-vitro-differentiation-human-pluripotent-stem-cells-into

Research

Ricerca

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

In questo video, dimostriamo l'isolamento di blastocisti mouse e la derivazione di cellule staminali trofoblasto da blastocisti. Abbiamo anche descrivere le condizioni per il mantenimento della proprietà delle cellule staminali e l'induzione della differenziazione nella cultura.

Derivazione di cellule staminali trofoblasto mouse da blastocisti

In questo protocollo, si descrive la dissezione placentae dal mouse sulla gravidanza D10.5, seguito da isolamento di cellule trofoblastiche mediante gradiente di Percoll. Abbiamo poi dimostrare l'utilizzo delle cellule isolate in un saggio di invasione Matrigel.

Isolamento di cellule primarie trofoblasto mouse e Invasion Assay trofoblasto

Tradizionale, bidimensionale tecniche di coltura cellulare spesso sfociano in caratteristiche alterate rispetto ai marcatori di differenziazione, citochine e fattori di crescita. Tridimensionale di coltura cellulare nel sistema delle cellule di rotazione cultura (CCR) ristabilisce l'espressione di molti di questi fattori, come illustrato qui con una linea di cellule extravilloso trofoblasto.

Rotazione Cultura sistemi cellulari per colture cellulari umane: cellule del trofoblasto umano come modello

Questo manoscritto presenta un modello unico in vitro di cellule di citotrofoblasto villoso umano immunopurificate coltivate in ipossia/riossigenazione. Questo modello è adatto per studiare gli effetti protettivi di trattamenti promettenti, come la melatonina, sulle complicanze della gravidanza associate all'aumento dello stress ossidativo e all'alterazione della funzione placentare.

Umana Trophoblast primaria coltura cellulare modello per studiare gli effetti protettivi della melatonina contro ipossia / riossigenazione Disruption-indotta

Qui presentiamo un protocollo per la conversione diretta di fibroblasti embrionali murini in cellule staminali del trofoblasto completamente funzionali e stabili mediante sovraespressione di dieci giorni di Tfap2c, Gata3, Eomes ed Ets2.

Protocollo per la conversione diretta dei fibroblasti murini embrionali in trofoblasto cellule staminali

Le cellule giganti del trofoblasto (TGC) svolgono un ruolo chiave nella placenta per garantire una gravidanza sana. Presentiamo un protocollo per valutare lo stato trascrizionale dei geni nei TGC mediante ibridazione fluorescente nascente in situ su sezioni criostatiche di embrioni post-impianto o colture a breve termine di coni ectoplacentari embrionali al 7° giorno.

Analisi trascrizionale dal nascente RNA FISH di<em&gt; In Vivo</em&gt; Cellule del trofoblasto giganti o<em&gt; In Vitro</em&gt; Culture a breve termine di Ectoplacental Cono espianti

Qui, presentiamo un protocollo altamente accessibile per valutare il movimento delle cellule in cellule del trofoblasto umano utilizzando tre saggi in vitro: l'analisi di gratta e Vinci, l'analisi di invasione di transwell e l'analisi di proliferazione delle cellule.

Test in Vitro per valutare la migrazione, invasione e la proliferazione di linee cellulari immortalizzate umano primo-acetonide Trophoblast

Qui, descriviamo un metodo per riscaldare le blastocisti umani vetrificati, maficandoli attraverso il periodo di impianto in vitro, digerindoli in singole cellule e raccogliendo cellule trofoblaste precoci per ulteriori indagini.

Raccolta a cella singola di cellule di trofoblasto in peri-impianto Stadio Embrioni Umani

Un protocollo che delinea la formazione di blastoidi umani che generano in modo efficiente, tempestivo e sequenziale cellule simili a blastocisti.

Protocollo per lo sviluppo e l'impianto di blastocisti umani per la modellazione di blastocisti

Il presente protocollo consente il recupero di strutture tubolari formate nel classico saggio di angiogenesi in vitro di formazione di tubi in cui le cellule, come le cellule del trofoblasto, si organizzano in strutture capillari su uno strato di matrice di membrana basale extracellulare. Le strutture recuperate vengono utilizzate per l'isolamento di RNA e proteine per varie analisi biochimiche.

Recupero delle cellule del trofoblasto dall'angiogenesi - Saggio di formazione di provette per l'analisi dell'espressione del marcatore di differenziazione

Impara a differenziare cellule staminali pluripotenti umane in cellule trofoblastiche usando BMP4 e inibitori delle vie di segnalazione. Questo metodo efficiente permette di studiare la formazione placentare umana.

La differenziazione in vitro di pluripotenti umane Cellule Staminali in cellule trofoblastiche

Esplora altri video