La differenziazione in vitro di pluripotenti umane Cellule Staminali in cellule trofoblastiche

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di differenziare le cellule staminali pluripotenti umane in cellule trofoblastiche umane utilizzando il morfogenico osseo 4 e gli inibitori delle vie di segnalazione attiva e nodale per studiare gli eventi precoci della formazione e della funzione placentare umana. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nello studio delle funzioni delle cellule trofoblastiche e di come si formano queste cellule. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può produrre abbondanti cellule trofoblastiche per un'ampia varietà di applicazioni, tra cui la genetica, e consentire saggi di funzione cellulare.

Per iniziare l'esperimento, scongelare un'aliquota di matrice extracellulare sul ghiaccio per tre o quattro ore. Utilizzando punte ghiacciate, un tubo conico freddo da 50 millilitri e il terreno uguale modificato di Dulbecco, o terreno DMEM F12, trasferiscono due milligrammi di matrice extracellulare in 24 millilitri di DMEM F12 ghiacciato. Trasferire immediatamente il tubo conico da 50 millilitri nel ghiaccio e conservarlo a quattro gradi Celsius.

Per rivestire le piastre di coltura tissutale, aggiungere un millilitro di matrice extracellulare diluita per pozzetto di una piastra a sei pozzetti. Agitare la piastra per rivestire i pozzetti e incubare la piastra a temperatura ambiente per almeno un'ora. Aspirare la matrice extracellulare dalla nuova piastra e aggiungere un terreno di coltura condizionato con fibroblasti embrionali di topo o MEFCM contenente bFGF.

Utilizzare una pipetta per trasferire i morsetti cellulari raschiati dalla piastra MEF e aliquotarli nella piastra rivestita di matrice extracellulare. Quindi incubare la piastra. Raschiare le cellule differenziate con una pipetta Pasteur prima di sostituire il MEFCM con il terreno bFGF ogni giorno utilizzando due millilitri di terreno per un pozzetto.

Quando le colonie appaiono grandi e luminose al microscopio, passano le hESC ogni sei o sette giorni. Quando le cellule senza alimentatore sono pronte per il passaggio, rimuovere il terreno e lavare le cellule aggiungendo un millilitro di PBS utilizzando una pipetta. Aspirare il PBS e sostituirlo con 0,5 milligrammi per millilitro di dispasi preriscaldata con una pipetta.

Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Dopo l'incubazione, lavare le cellule con PBS aggiungendo due millilitri di PBS per pozzetto e aspirare il PBS. Aggiungere un millilitro di CM per pozzetto e raschiare manualmente le cellule in piccoli grumi usando la punta di una pipetta da cinque millilitri.

Successivamente, placcare i grumi di cellule sospese in nuove piastre rivestite di matrice extracellulare. Preparare il mezzo di differenziazione. Utilizzare CM senza bFGF e aggiungere nuovi inibitori prima dell'uso.

Utilizzare hESC prive di alimentatore che crescono su piastre rivestite di matrice extracellulare per un passaggio coltivate all'interno di un'incubatrice impostata al 5% di ossigeno. Dopo il primo passaggio sulle piastre rivestite di matrice extracellulare, lasciare che le cellule si attacchino per 24 ore. Il giorno successivo, iniziare la differenziazione rimuovendo il CM contenente bFGF e sostituendolo con CM contenente BMP4/A/P con due millilitri per pozzetto in una piastra a sei pozzetti.

Continua a coltivare le cellule utilizzando livelli di ossigeno al 4%. Sostituire il CM contenente BMP4/A/P ogni due giorni aspirando il vecchio terreno e aggiungendo un nuovo terreno contenente BMP4/A/P. Raccogliere le cellule nei punti temporali desiderati.

Coltura di hESC per due passaggi sulla matrice extracellulare dopo il trasferimento dai MEF con terreno hESC contenente bFGF. Un'elevata confluenza cellulare è importante, quindi dividi le hESC uno a uno su una nuova piastra che garantirà almeno il 50% di confluenza il giorno successivo. Incubare le cellule per una notte nell'incubatore a basso contenuto di ossigeno.

Il giorno successivo, sostituire il terreno con due millilitri per pozzetto di terreno di differenziazione. Mettere le cellule in un incubatore a basso contenuto di ossigeno per una notte. Prima della trasfezione, ricoprire di gelatina un piatto aggiungendo lo 0,1% di gelatina in un piatto.

Agitare il piatto per ricoprire il piatto, quindi lasciare il piatto a temperatura ambiente. Dopo 20 minuti, togliete la gelatina. Differenziare le celle fino al punto temporale desiderato.

Il giorno prima della trasfezione, tripsinizzare le cellule utilizzando lo 0,05% di tripsina per cinque minuti. Piastra le celle alla confluenza desiderata sulla piastra rivestita di gelatina. Aggiungere CM contenente BMP4/A/P privo di bFGF e incubare la coltura durante la notte.

Il giorno successivo, aggiungere un nuovo terreno di differenziazione alle cellule. Trasfettare i siRNA utilizzando un reagente di trasfezione siRNA. Per il DNA plasmatico, utilizzare un reagente lipofectamina appropriato.

Seguire il protocollo del prodotto come descritto per ciascun reagente di trasfezione. Trasferire i complessi di lipofectamina siRNA in ogni pozzetto o piastra di cellule e mescolare delicatamente. Quindi coltivare le cellule durante la notte in un incubatore a basso contenuto di ossigeno.

Il giorno successivo, sostituire il supporto con un nuovo supporto di differenziazione. Raccogliere le cellule nei punti temporali desiderati per verificare l'efficienza della disgregazione genica utilizzando la RT-PCR quantitativa. Infine, per raccogliere le cellule, aggiungere un millilitro di tripsina allo 0,05% per pozzetto e incubare le cellule.

Aggiungere cinque millilitri di terreno MEF per pozzetto per neutralizzare la tripsina. Centrifugare le cellule a 200 volte g per cinque minuti e utilizzare il pellet cellulare per l'isolamento dell'RNA. Utilizzando questa tecnica, i cambiamenti morfologici sono chiaramente visibili.

Le cellule del primo giorno di differenziazione sono più grandi delle cellule del giorno zero. Man mano che la differenziazione procede, le cellule si dividono e si espandono dal centro della colonia, crescendo verso l'esterno. Le singole colonie si fondono insieme al quinto giorno di differenziazione con le cellule che crescono l'una sull'altra.

L'analisi QRT-PCR rivela che i livelli relativi di espressione del marcatore C pluripotente NANOG sono ridotti del 75% dopo un giorno di differenziazione quando le cellule sono coltivate con BMP4 e ridotti del 90% in presenza di BMP4/A/P. Al secondo giorno di differenziazione, i livelli di NANOG sono molto bassi per le cellule coltivate in BMP4 da solo o in BMP4/A/P rispetto a quelle in terreno hESC CM contenente beta FGF. Le trasfezioni eseguite utilizzando un plasmide GFP e introdotte in cellule trattate con BMP4/A/P il primo e il terzo giorno di differenziazione hanno ottenuto un'efficienza di trasfezione dal 30 al 50% a 24 ore dopo la trasfezione.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come differenziare le cellule pluripotenti umane in cellule trofoblastiche in vitro e come introdurre costrutti di DNA per manipolare l'espressione genica.