Name: Murino linfociti Etichettatura da 64 Cu-anticorpo recettore Targeting per In Vivo Cell Traffico da PET / CT (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 34 s
Description: Impara a marcare linfociti murini con anticorpi monoclonali radiomarcati al rame per tracciarne la distribuzione e l'omigrazione in vivo mediante PET/CT in modelli murini di infiammazione o cancro.

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Gli autori ringraziano il Dr. Julia Mannheim, Walter Ehrlichmann, Ramona Stumm, Funda Cay, Daniel Bukala, Maren Harant così come Natalie Altmeyer per il sostegno durante gli esperimenti e analisi dei dati. Questo lavoro è stato supportato dal Werner Siemens-Fondazione, la DFG attraverso lo SFB685 (progetto B6) e Fortune (2309-0-0).

<ol><li>Cerri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracarotid+Infusion+of+Mesenchymal+Stem+Cells+in+an+Animal+Model+of+Parkinson%27s+Disease%2C+Focusing+on+Cell+Distribution+and+Neuroprotective+and+Behavioral+Effects%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Trans+Med%22%5BJournal%5D)">Intracarotid Infusion of Mesenchymal Stem Cells in an Animal Model of Parkinson's Disease, Focusing on Cell Distribution and Neuroprotective and Behavioral Effects.</a> Stem Cells Trans Med. 4 (9), 1073-1085 (2015).</li>
<li>Hasenbach, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+the+glioma+tropism+of+bone+marrow-derived+progenitor+cells+by+2-photon+laser+scanning+microscopy+and+positron+emission+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncol%22%5BJournal%5D)">Monitoring the glioma tropism of bone marrow-derived progenitor cells by 2-photon laser scanning microscopy and positron emission tomography.</a> Neuro Oncol. 14 (4), 471-481 (2012).</li>
<li>Sood, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodistribution+of+18F-FDG-Labeled+Autologous+Bone+Marrow+%E2%80%93+Derived+Stem+Cells+in+Patients+With+Type+2+Diabetes+Mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Nucl+Med%22%5BJournal%5D)">Biodistribution of 18F-FDG-Labeled Autologous Bone Marrow – Derived Stem Cells in Patients With Type 2 Diabetes Mellitus.</a> Clin Nucl Med. 40 (9), 697-700 (2015).</li>
<li>Perez-Diez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4+cells+can+be+more+efficient+at+tumor+rejection+than+CD8+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD4 cells can be more efficient at tumor rejection than CD8 cells.</a> Blood. 109 (12), 5346-5354 (2007).</li>
<li>Muranski, P., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+immunotherapy+of+cancer+using+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Adoptive immunotherapy of cancer using CD4+ T cells.</a> Curr. Opin. Immunol. 21 (2), 200-208 (2009).</li>
<li>Braumuller, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-helper-1-cell+cytokines+drive+cancer+into+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">T-helper-1-cell cytokines drive cancer into senescence.</a> Nature. 494 (7437), 361-365 (2013).</li>
<li>Kochenderfer, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eradication+of+B-lineage+cells+and+regression+of+lymphoma+in+a+patient+treated+with+autologous+T+cells+genetically+engineered+to+recognize+CD19%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Eradication of B-lineage cells and regression of lymphoma in a patient treated with autologous T cells genetically engineered to recognize CD19.</a> Blood. 116 (20), 4099-4102 (2010).</li>
<li>Cherry, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamentals+of+Positron+Emission+Tomography+and+Applications+in+Preclinical+Drug+Development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Fundamentals of Positron Emission Tomography and Applications in Preclinical Drug Development.</a> J. Clin. Pharmacol. 41 (5), 482-491 (2001).</li>
<li>Tavaré, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Effective+Immuno-PET+Imaging+Method+to+Monitor+CD8-Dependent+Responses+to+Immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">An Effective Immuno-PET Imaging Method to Monitor CD8-Dependent Responses to Immunotherapy.</a> Cancer Res. 76 (1), 73-82 (2016).</li>
<li>Tavaré, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+antibody+fragments+for+immuno-PET+imaging+of+endogenous+CD8%2B+T+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Engineered antibody fragments for immuno-PET imaging of endogenous CD8+ T cells in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (3), 1108-1113 (2014).</li>
<li>Dobrenkov, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+the+Efficacy+of+Adoptively+Transferred+Prostate+Cancer-Targeted+Human+T+Lymphocytes+with+PET+and+Bioluminescence+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nucl+Med%22%5BJournal%5D)">Monitoring the Efficacy of Adoptively Transferred Prostate Cancer-Targeted Human T Lymphocytes with PET and Bioluminescence Imaging.</a> J Nucl Med. 49 (7), 1162-1170 (2008).</li>
<li>Rini, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PET+with+FDG-labeled+Leukocytes+versus+Scintigraphy+with+111In-Oxine-labeled+Leukocytes+for+Detection+of+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Radiology%22%5BJournal%5D)">PET with FDG-labeled Leukocytes versus Scintigraphy with 111In-Oxine-labeled Leukocytes for Detection of Infection.</a> Radiology. 238 (3), 978-987 (2006).</li>
<li>Ritchie, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+tracking+of+macrophage+activated+killer+cells+to+sites+of+metastatic+ovarian+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunol.+Immunother%22%5BJournal%5D)">In vivo tracking of macrophage activated killer cells to sites of metastatic ovarian carcinoma.</a> Cancer Immunol. Immunother. 56 (2), 155-163 (2006).</li>
<li>Adonai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+cell+labeling+with+64Cu-pyruvaldehyde-bis%28N4-methylthiosemicarbazone%29+for+imaging+cell+trafficking+in+mice+with+positron-emission+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Ex vivo cell labeling with 64Cu-pyruvaldehyde-bis(N4-methylthiosemicarbazone) for imaging cell trafficking in mice with positron-emission tomography.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (5), 3030-3035 (2002).</li>
<li>Huang, J., Lee, C. C. I., Sutcliffe, J. L., Cherry, S. R., Tarantal, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiolabeling+Rhesus+Monkey+CD34%2B+Hematopoietic+and+Mesenchymal+Stem+Cells+with+64Cu-Pyruvaldehyde-Bis%28N4-Methylthiosemicarbazone%29+for+MicroPET+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Imaging%22%5BJournal%5D)">Radiolabeling Rhesus Monkey CD34+ Hematopoietic and Mesenchymal Stem Cells with 64Cu-Pyruvaldehyde-Bis(N4-Methylthiosemicarbazone) for MicroPET Imaging.</a> Mol. Imaging. 7 (1), (2008).</li>
<li>Griessinger, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Tracking+of+Th1+Cells+by+PET+Reveals+Quantitative+and+Temporal+Distribution+and+Specific+Homing+in+Lymphatic+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nucl+Med%22%5BJournal%5D)">In Vivo Tracking of Th1 Cells by PET Reveals Quantitative and Temporal Distribution and Specific Homing in Lymphatic Tissue.</a> J Nucl Med. 55 (2), 301-307 (2014).</li>
<li>Griessinger, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((64Cu+antibody-targeting+of+the+T-cell+receptor+and+subsequent+internalization+enables+in+vivo+tracking+of+lymphocytes+by+PET%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">64Cu antibody-targeting of the T-cell receptor and subsequent internalization enables in vivo tracking of lymphocytes by PET.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112 (4), 1161-1166 (2015).</li>
<li>McCarthy, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+production+of+high+specific+activity+64Cu+using+a+biomedical+cyclotron%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient production of high specific activity 64Cu using a biomedical cyclotron.</a> Nucl. Med. Biol. 24 (1), 35-43 (1997).</li>
<li>Kalkhof, S., Sinz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chances+and+pitfalls+of+chemical+cross-linking+with+amine-reactive+N-hydroxysuccinimide+esters%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Chances and pitfalls of chemical cross-linking with amine-reactive N-hydroxysuccinimide esters.</a> Anal. Bioanal. Chem. 392 (1), 305-312 (2008).</li>
<li>Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin Iii,, J, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Th17+Differentiation+of+Naive+CD4+T+Lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Th17 Differentiation of Naive CD4 T Lymphocytes.</a> J Vis Exp. (79), e50765(2013).</li>
<li>Flaherty, S., Reynolds, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Naive+CD4%2B+T+Cell+Isolation+and+In+vitro+Differentiation+into+T+Cell+Subsets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Mouse Naive CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets.</a> J Vis Exp. (98), e52739(2015).</li>
<li>Judenhofer, M., Wiehr, S., Kukuk, D., Fischer, K., Pichler, B. Chapter 363. <a target="_blank" href="http://www.springer.com/us/book/9783642129445">Small Animal Imaging. Basics and Practical Guide</a>. , Springer. 363-370 (2011).</li>
<li>Phelps, M. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPhelps%2C+ME+%22PET.+Molecular+Imaging+and+Its+Biological+Applications%22">PET. Molecular Imaging and Its Biological Applications</a>. , Springer-Verlag. 93-101 (2004).</li>
<li>Wu, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+and+Antimatter%3A+The+Resurgence+of+Immuno-PET%5BTitle%5D)+AND+%22JNM%22%5BJournal%5D)">Antibodies and Antimatter: The Resurgence of Immuno-PET.</a> JNM. 50 (1), 2-5 (2009).</li>
<li>Lewis, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+evaluation+of+pretargeted+64Cu+for+tumor+imaging+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nucl+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo evaluation of pretargeted 64Cu for tumor imaging and therapy.</a> J Nucl Med. 44 (8), 1284-1292 (2003).</li>
<li>Boswell, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+in+vivo+stability+of+copper-64-labeled+cross-bridged+and+conventional+tetraazamacrocyclic+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Comparative in vivo stability of copper-64-labeled cross-bridged and conventional tetraazamacrocyclic complexes.</a> J Med Chem. 47 (6), 1465-1474 (2004).</li>
<li>Ghosh, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+DOTA+and+NODAGA+as+chelators+for+%2864%29Cu-labeled+immunoconjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Comparison of DOTA and NODAGA as chelators for (64)Cu-labeled immunoconjugates.</a> Nucl Med Biol. 42 (2), 177-183 (2015).</li>
<li>Johnson, T. E., Birky, B. K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJohnson%2C+TE+%22Health+Physics+and+Radiological+Health%22">Health Physics and Radiological Health</a>. , 4th ed, Lippincott Williams & Wilkins. (2011).</li>
<li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+tissue+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nat Meth. 2 (12), 932-940 (2005).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo protocollo presenta un metodo affidabile e facile da radiomarcato stabilmente cellule per il monitoraggio in vivo mediante PET. Utilizzando questo metodo, le cellule cova-TH1, isolate ed espanse in vitro da donatore topi, potrebbe essere radiomarcato con 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb e il loro homing è stato rintracciato alle LNs polmonari e perithymic come siti di presentazione Cova in un cova indotta DTHR vie respiratorie acute. La modifica del mAb con il chelan...

Inseguimento cella non invasiva è uno strumento versatile per monitorare la funzione cellulare, la migrazione e homing in vivo. Recenti studi di monitoraggio delle cellule mesenchimali si sono concentrati su 1, 2 o del midollo osseo di cellule staminali derivate 3 nel contesto della medicina rigenerativa, periferiche autologhe globuli bianchi a infiammazione o linfociti T in terapie cellulari adottivi contro il cancro 3, 4. La spiegazione dei siti di azione ei principi biologici sottostanti di terapie a base di cellule è di enorme importanza. I linfociti T citotossici CD8 +, geneticamente antigene recettore chimerico cellule T (CAR) o linfociti infiltranti il tumore (TIL) sono stati ampiamente considerato come il gold standard. Tuttavia, le cellule TH1 antigene-specifiche associati al tumore hanno dimostrato di essere un efficace opzione di trattamento alternativa 4, &lt;/ sup&gt; 5, 6, 7. Come attori chiave infiammazione, malattie autoimmuni organo-specifiche (ad esempio, l&#39;artrite reumatoide o asma bronchiale), e le cellule di elevato interesse in immunoterapia del cancro, è importante caratterizzare la distribuzione e homing modelli temporali di cellule TH1. Invasiva imaging in vivo da PET presenta un metodo altamente sensibile quantitativa 8 per esaminare i modelli di migrazione cellulare, in vivo homing, ed i siti di azione delle cellule T e risposte durante l&#39;infiammazione, allergie, infezioni o tumore rifiuto 9, 10, 11. Clinicamente, 111 In ossina viene utilizzato per leucociti scintigrafia per la discriminazione di infiammazione e infezione 12, mentre 2-deossi-2- (18F) fluoro-D-glucosio (18 F-FDG) viene comunemente utilizzato per studi di localizzazione cellulare mediante PET 3, 13. Uno svantaggio principale di questo tracciante PET, tuttavia, è la breve emivita del radionuclide 18 F a 109,7 min e la bassa stabilità intracellulare che ostacola l&#39;imaging in momenti successivi caricare trasferimento adottivo di cellule. A lungo termine studi in vivo inseguimento cellulare mediante PET, anche se instabile nelle cellule, 64 Cu-PTSM viene frequentemente usato per marcare le cellule non specifico 14, 15 con effetti dannosi minimizzati sulla vitalità delle cellule T e funzionamento 16. Questo protocollo descrive un metodo per ridurre ulteriormente gli effetti svantaggiosi sulla vitalità delle cellule e la funzione utilizzando un recettore di cellule T (TCR) -specifica radiomarcato mAb. In primo luogo, la produzione del radioisotopo 64 Cu, la coniugazione del mAb KJ1-26 con the chelante DOTA, ed il successivo 64 Cu-radiomarcatura sono mostrati. In una seconda fase, l&#39;isolamento e l&#39;espansione delle cellule cova-TH1 di topi donatori DO11.10 e la radiomarcatura con 64 Cu-caricata DOTA-coniugato mAb KJ1-26 (64 Cu-DOTA-KJ1-26) sono descritte in dettaglio. La valutazione dei valori di assunzione e efflusso di radioattività con un calibratore di dosi e y-conteggio, rispettivamente, nonché la valutazione degli effetti di 64 Cu-radiomarcatura sulla vitalità cellulare mediante trypan blu e funzionalità con IFN-y ELISA sono rappresentati . Per non invasiva nel monitoraggio delle cellule in vivo, l&#39;elicitazione di un modello murino di cova indotta acuta delle vie aeree e DTHR immagine acquisizione da PET / TC dopo trasferimento adottivo di cellule sono descritti. Inoltre, questo approccio etichettatura può essere trasferito a diversi modelli di malattia, cellule T murine con differenti TCR o cellule generali di interesse con recettori di membrana o espressione markers sottostante membrana continua spola 17.

<table><tbody><tr><td>HCl, Suprapur</td><td>Merck, Darmstadt, Germania</td><td>1.00318</td><td>64Cu produzione</td></tr><tr><td>Metanolo, Suprapur</td><td>Merck, Darmstadt, Germania</td><td>1.06007</td><td>64Cu produzione</td></tr><tr><td>Isopropanolo, Suprapur</td><td>Merck, Darmstadt, Germania</td><td>1.0104<</td><td>sup>64Cu produzione</td></tr><tr><td>Pt/Ir (90/10) piastra</td><td>&Ouml; gussa</td><td>Custom made</td><td>64Cu</td></tr><tr><td>produzione Camera in PEEK</td><td>WKL</td><td>Custom made</td><td>64Cu produzione</td></tr><tr><td>64Ni</td><td>Chemotrade</td><td></td><td>64Cu</td></tr><tr><td>produzione Polygram SIL G/UV 254 piastra</td><td>Macherey-Nagel</td><td>805021</td><td>64Cu</td></tr><tr><td>produzione Scambio ionico colonna</td><td>BioRad</td><td>AG1-X8<</td><td>sup>64Cu</td></tr><tr><td>produzione Sistema target a stato solido per PETtrace</td><td>WKL</td><td>costum made</td><td>64Cu production</td></tr><tr><td>64Cu work-up modulo</td><td>WKL</td><td>costum made</td><td>64Cu</td></tr><tr><td>produzione Calibratore di dose</td><td>Capintec</td><td>CRC-25R</td><td></td></tr><tr><td>PETtrace ciclotrone</td><td>General Electric Medical Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DOTA-NHS</td><td>Macrocyclics</td><td>B-280</td><td>Coniugazione DOGA</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-cOVA-TCR (KJ1-26)</td><td></td><td>Isolato da coltura cellulare di ibridoma</td><td>Coniugazione DOTA</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71633</td><td>Coniugazione DOTA</td></tr><tr><td>H+ Chelex 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7901</td><td>Coniugazione DOGA</td></tr><tr><td>Unità filtrante Amicon Ultra-15</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC910008</td><td>Coniugazione DOTA</td></tr><tr><td>Acqua ultrapura Rotipuran</td><td>Carl Roth</td><td>HN68.3</td><td>Coniugazione DOGA</td></tr><tr><td>Acetato di ammonio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32301</td><td>Coniugazione DOTA</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Università di Tubinga</td><td></td><td>Coniugazione DOTA</td></tr><tr><td>Micro Bio-spin Colonna P-6</td><td>Laboratori Bio-Rad 7326221</td><td></td><td>Coniugazione DOTA</td></tr><tr><td>Citrato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71497</td><td>Ciclone di coniugazione DOGA</td></tr><tr><td>Plus PhosphorImager&nbsp;</td><td>Perkin-Elmer</td><td>L2250116</td><td>coniugazione DOTA</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Merck Millipore</td><td>102568</td><td>ingrediente per il terreno delle cellule T.</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Merck Millipore</td><td>S0115/1004B</td><td>ingrediente per terreno a cellule T&nbsp;</td></tr><tr><td>Piruvato di sodio</td><td>Merck Millipore</td><td>L0473</td><td>ingrediente per terreno di cellule T</td></tr><tr><td>Aminoacidi MEM</td><td>Merck Millipore</td><td>K0293</td><td>ingrediente per il terreno delle cellule T</td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>Merck Millipore</td><td>L 1613</td><td>ingrediente per terreno a cellule T</td></tr><tr><td>&nbsp; Penicillina/Streptomicina</td><td>Merck Millipore</td><td>A2212</td><td>ingrediente per il terreno delle cellule T&nbsp;</td></tr><tr><td>0,05 mM 2-&beta;-mercaptoetanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td>ingrediente per terreno di coltura a cellule T&nbsp;</td></tr><tr><td>DO11.10 topi</td><td></td><td>allevamento interno</td><td>Coltura cellulare TH1</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td>Coltura cellulare TH1</td></tr><tr><td>Filtro cellulare 40 &; m&nbsp;</td><td>Corning</td><td>352340</td><td>Coltura cellulare TH1</td></tr><tr><td>ACK Lysing Buffer</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td>Coltura cellulare TH1</td></tr><tr><td>CD4 MicroBeads, topo</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-097-145</td><td>Coltura cellulare TH1</td></tr><tr><td>Separatore QuadroMACS</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-090-976</td><td>Coltura cellulare TH1</td></tr><tr><td>Colonna LS</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-401</td><td>Coltura</td></tr> <tr>cellulare TH1<td>anticorpo anti-CD4 (Gk1.5)</td><td></td><td>Isolato da coltura cellulare di ibridoma</td><td>Coltura cellulare TH1</td></tr><tr><td>anticorpo anti-CD8 (5367.2)</td><td></td><td>Isolato da coltura cellulare di ibridoma</td><td>Coltura cellulare TH1</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-ratto (MAR18.5)</td><td></td><td>Isolato da coltura cellulare di ibridoma</td><td>Coltura cellulare TH1</td></tr><tr><td>Complemento di coniglio MA</td><td>tebu-Bio</td><td>CL3221</td><td>Coltura cellulare TH1</td></tr><tr><td>Anti-IL-4 anticorpo (11B11)</td><td></td><td>Isolato da coltura cellulare di ibridoma</td><td>Coltura cellulare TH1</td></tr><tr><td>cOVA 323-339-peptide&nbsp;</td><td>EMC-micro-collezioni</td><td>Ordine personalizzato</td><td>Coltura cellulare TH1</td></tr><tr><td>CPG1668-oligonucleotidi</td><td>Eurofins MWG Operone Ordine</td><td>personalizzato</td><td>Coltura cellulare TH1</td></tr><tr><td>IL-2</td><td>Novartis</td><td>65483-116-07</td><td>Coltura cellulare TH1</td></tr><tr><td>Piastre a 96 pozzetti</td><td>Greiner&nbsp;</td><td>655180</td><td>Piastre per colture cellulari TH1</td></tr><tr>a<td>24 pozzetti</td><td>Greiner&nbsp;</td><td>662160</td><td>Pallone per colture cellulari TH1</td></tr><tr><td></td><td>Greiner&nbsp;</td><td>660175</td> Piastre a 48 pozzetti <td>per colture cellulari TH1</td></tr><tr><td></td><td>Greiner&nbsp;</td><td>677 180</td><td>etichettatura cellulare</td></tr><tr><td>Gammacell 1000</td><td>Best Theratronics</td><td>via inchiesta&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Gulmay RT225</td><td>Gulmay</td><td>via inchiesta&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blu</td><td>Merck Millipore</td><td>L6323</td><td>in vitro valutazione</td></tr><tr><td>Mouse IFN-&gamma; ELISA</td><td>BD Biosciences</td><td>558258</td><td>in vitro</td></tr><tr><td>valutazione PE Annexin V Kit di rilevamento dell'apoptosi</td><td>BD Biosciences</td><td>Valutazione 559763</td><td>in vitro</td></tr><tr><td>Provetta 5 mL</td><td>Sarstedt</td><td>55.476<</td><td>em>in vitro Valutazione</td></tr><tr><td>Provette a fondo tondo&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>352008</td><td>in vitro valutazione</td></tr><tr><td>Wizard &gamma;-counter</td><td>Perkin-Elmer</td><td>2480-0010</td><td>in vitro valutazione</td></tr><tr><td>ELISA Reader MultiscanEX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51118177</td><td>in vitro</td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Leica</td><td>via inchiesta&nbsp;</td><td>Valutazione in vitro</td></tr><tr><td>BD LSRII&nbsp;</td><td>Inchiesta BD Biosciences</td><td>via</td><td>in vitrovalutazione</td></tr><tr><td>BALB/c topi</td><td>Charles River</td><td>028</td><td>in vivo traffico cellulare</td></tr><tr><td>Gel di alluminio</td><td>Serva Elettroforesi</td><td>12261.01</td><td>in vivo traffico cellulare</td></tr><tr><td>Xilazina</td><td>Bayer HealthCare</td><td>Ordinato via Ospedale universitario</td><td>in vivo traffico cellulare</td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Ratiopharm</td><td>Ordinato via Ospedale universitario</td><td>in vivo traffico cellulare</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>CP-Pharma</td><td>Ordinato via Ospedale universitario</td><td>in vivo traffico cellulare</td></tr><tr><td>Ago da 30 G</td><td>BD Biosciences</td><td>304000</td><td>in vivo traffico cellulare</td></tr><tr><td>Siringa</td><td>BD Biosciences</td><td>11612491</td><td>in vivo traffico cellulare</td></tr><tr><td>Capillari 10 &; L</td><td>VWR</td><td>612-2439</td><td></td></tr><tr><td>Scanner PET Inveon</td><td>Siemens Healthineers</td><td>non più disponibile</td><td>in vivo traffico cellulare, aziende alternative: Bruker, Mediso&nbsp;</td></tr><tr><td>Scanner Inveon SPECT/CT</td><td>Siemens Healthineers</td><td>non più disponibile</td><td>in vivo traffico cellulare</td></tr><tr><td>Inveon Research Workplace</td> Analisi delle immagini <td>Siemens Healthineers</td><td></td><td>, software alternativo: Pmod</td></tr></tbody></table>

murino linfociti etichettatura da<sup&gt; 64</sup&gt; cu-anticorpo recettore targeting per<em&gt; in vivo</em&gt; cell traffico da pet / ct

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT

Questo protocollo illustra la produzione di 64 Cu e il chelante coniugazione / radiomarcatura di un anticorpo monoclonale (mAb) seguita da coltura cellulare linfociti murino e recettori 64 Cu-anticorpo di targeting delle cellule. Valutazione in vitro del prodotto radiomarcato e non invasivo nel monitoraggio delle cellule in vivo in un modello animale di una via aerea di tipo ritardato reazione di ipersensibilità (DTHR) PET / TC sono descritti. In particolare, viene mostrata la coniugazione di un mAb con il chelante acido 1,4,7,10-tetraazaciclododecan-1,4,7,10-tetraacetico (DOTA). Seguendo la produzione di radioattivo 64 Cu, radiomarcatura del DOTA-coniugato mAb è descritto. Successivamente, l&#39;espansione di ovalbumina di pollo (Cova) CD4 + -specific interferone (IFN) -γ-producendo cellule T helper (cova-TH1) e la successiva radiomarcatura delle cellule cova-TH1 sono raffigurati. Varie tecniche in vitro sono presentati per valutare l&#39;effetti di 64 Cu-radiomarcatura sulle cellule, quali la determinazione della vitalità cellulare mediante trypan blu, la colorazione per apoptosi con annessina V per citometria a flusso, e la valutazione della funzionalità da IFN-γ saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) . Inoltre, la determinazione della captazione radioattivo nelle cellule e la stabilità etichettatura sono descritte in dettaglio. Questo protocollo descrive inoltre come eseguire studi di tracciamento delle cellule in un modello animale di una DTHR delle vie aeree e, di conseguenza, l&#39;induzione di cova indotta DHTR acuta delle vie aeree a / c topi BALB è incluso. Infine, un robusto workflow / CT PET inclusa l&#39;acquisizione delle immagini, ricostruzione, e l&#39;analisi è presentato. L&#39;approccio di targeting recettore 64Cu-anticorpo con successiva internalizzazione recettoriale fornisce alta specificità e stabilità, ridotta tossicità cellulare, e tassi di efflusso bassi rispetto ai comuni PET traccianti per l&#39;etichettatura di cellule, ad esempio 64 Cubis -pyruvaldehyde (N4-methylthiosemicarbazone) (64 Cu-PTSM). Infine, il nostro approccio consente non invasivo in cellule inseguimento vivo mediante PET / TC con un ottimo rapporto segnale-sfondo per 48 h. Questo approccio sperimentale può essere trasferito a diversi modelli animali e tipi di cellule con recettori di membrana che sono internalizzati.

Figura 1 riassume l&#39;etichettatura di cellule cova-TH1 con il 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb e il disegno sperimentale per l&#39;in vitro ed in vivo contemplati in questo protocollo. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55270/55270fig1.jpg" /> Figura 1: 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb etichettatura Process &amp; Experimental Design. (A) Rappr...

Seguendo la preparazione di un anticorpo monoclonale 64 Cu-modificata legandosi ad un recettore delle cellule T transgenico murino, cellule T sono radiomarcato in vivo, analizzati per la vitalità, funzionalità, stabilità etichettatura e apoptosi e adoptively trasferite in topi con una cannula ipersensibilità di tipo ritardato reazione per l&#39;imaging non invasiva mediante tomografia a emissione di positroni / tomografia computerizzata (PET / CT).

Murino linfociti Etichettatura da<sup&gt; 64</sup&gt; Cu-anticorpo recettore Targeting per<em&gt; In Vivo</em&gt; Cell Traffico da PET / CT

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte ...

L'obiettivo generale di questa procedura è etichettare stabilmente linfociti murini con un anticorpo monoclonale radioattivo modificato con rame, al fine di tracciare in vivo la distribuzione temporale e i modelli di localizzazione dei linfociti mediante PET/TC in modelli murini di infiammazione o cancro. Questo metodo può contribuire a chiarire i siti d'azione e i principi biologici fondamentali alla base delle terapie cellulari, come le terapie con cellule staminali nella medicina rigenerativa o le immunoterapie antitumorali. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente l'immagine della migrazione cellulare per un periodo di 48 ore con un elevato contrasto e minimi effetti dannosi sulle cellule.Questo metodo può essere facilmente trasferito a qualsiasi tipo cellulare di interesse dotato di recettori specifici legati alla membrana e di corrispondenti anticorpi monoclonali. In generale, chi si approccia per la prima volta a questo metodo potrebbe incontrare difficoltà nei processi di coniugazione con il chelante e di marcatura radioattiva, con conseguente riduzione della frazione immunoreattiva e dell'attività specifica per la cellula. Iniziare disinfettando un topo DO1

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

In questo video, dimostriamo la radiomarcatura intracellulare delle cellule T helper utilizzando anticorpi monoclonali coniugati con isotopi radioattivi per l'imaging non invasivo della tomografia a emissione di positroni.

Marcatura dei linfociti T helper murini utilizzando anticorpi monoclonali radiomarcati

Questo video dimostra una tecnica che coinvolge un radioimmunoconiugato per l'imaging in vivo di un tumore in un modello murino. Dopo l'iniezione del radioimmunoconiugato, gli anticorpi del coniugato si legano a uno specifico antigene di membrana sulle cellule tumorali. Il radiotracciante del coniugato emette positroni che interagiscono con gli elettroni vicini per produrre energia, che viene rilevata da uno scanner per tomografia a emissione di positroni (PET) per creare un'immagine del tumore.

Una tecnica di imaging PET in vivo per rilevare tumori in un modello murino utilizzando anticorpi radiomarcati

Descriviamo un protocollo generale per il monitoraggio in vivo cella utilizzando la risonanza magnetica in un modello di topo con cellule ex vivo etichettati. Un tipico protocollo di marcatura delle cellule, elaborazione acquisizione delle immagini e la quantificazione è inclusa.

In vivo 19 F MRI per il tracciamento cellulare

La cicloaddizione di Diels-Alder per la domanda di elettroni inversi bioortogonali è stata sfruttata per creare una strategia di imaging PET premirata efficace e modulare per il cancro. In questo protocollo, le fasi di questa metodologia sono descritte nel contesto di un sistema modello che impiega l'anticorpo mirato al cancro del colon-retto huA33 e un radioligando marcato con 64Cu.

Sfruttando la domanda Bioorthogonal Inverse Electron Diels-Alder cicloaddizione per Pretargeted PET Imaging

Peptidi virali-derivati accoppiati a anticorpo-coniugati (ACs) è un approccio guadagnando slancio a causa del potenziale di trasporto molecolare payload con accumulo di cellule aumentata del tumore. Utilizzando metodi comuni per valutare la coniugazione di peptide, AC e accumulo intracellulare di payload e targeting tumorale, questo protocollo consente ai ricercatori durante le fasi iniziali di sviluppo chiave.

Valutazione iniziale di anticorpo-coniugati modificate con peptidi virali-derivati per accumulo cellulare di aumentare e migliorare il Targeting tumorale

Questo protocollo descrive un metodo per immagine residente tumore-infiltrazione CD8 T cellule identificate con gli anticorpi fluorescente accoppiati all'interno di fette di tumore del polmone umano. Questa tecnica permette in tempo reale analisi di migrazione delle cellule T CD8 usando la microscopia confocal.

Ex Vivo Imaging dei linfociti T CD8 residente nel tumore del polmone umano mediante microscopia confocale a fette

Protocolli per la valutazione quantitativa della chemiotassi dei linfociti e la migrazione sono strumenti importanti per la ricerca in immunologia. Qui, un protocollo in vitro è descritto che permette in tempo reale, multiplexed valutazione della migrazione cellulare, così come un complementare in vivo tecnica abilitazione rilevamento di cellule native alla milza.

Quantificazione del linfocita murino traffico In Vivo e chemiotassi del monocito umano In Vitro

Qui, noi dimostrare i metodi per la quantificazione in vivo d'uscita del leucocita da ingenuo, infiammato e maligni della pelle murino. Eseguiamo un confronto testa a testa tra due modelli: transdermico FITC applicazione ed in situ fotoconversione. Inoltre, dimostriamo l'utilità di fotoconversione per servizi esterni del leucocita di rilevamento da tumori cutanei.

Quantificazione del leucocita Egress tramite vasi linfatici dalla pelle murina e tumori

Questo protocollo descrive una tecnica per l'immagine di diverse popolazioni cellulari nel drenaggio dei linfonodi senza alterazioni nella struttura dell'organo.

Visualizzazione della struttura dei linfonodi e della localizzazione cellulare mediante la microscopia confocale Ex-Vivo

Questo protocollo descrive la metodologia per il tracciamento non invasivo delle cellule T geneticamente modificate per esprimere i recettori dell'antigene chimerico in vivo con una piattaforma clinicamente disponibile.

Imaging dinamico di cellule T del recettore dell'antigene chimerico con [18F] tomografia ad emissione di positroni tetrafluoroborato/tomografia computerizzata

Questo documento descrive in dettaglio la metodologia per la radiomarcatura di un anticorpo monoclonale anti-CD19 specifico per l'uomo e come utilizzarlo per quantificare le cellule B nel sistema nervoso centrale e nei tessuti periferici di un modello murino di sclerosi multipla utilizzando l'imaging PET in vivo, il conteggio gamma ex vivo e gli approcci di autoradiografia.

Imaging delle cellule B CD19+ in un modello murino sperimentale di encefalomielite autoimmune utilizzando la tomografia a emissione di positroni

Impara a marcare linfociti murini con anticorpi monoclonali radiomarcati al rame per tracciarne la distribuzione e l'omigrazione in vivo mediante PET/CT in modelli murini di infiammazione o cancro.

Murino linfociti Etichettatura da

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