Name: Sviluppo di Metarhizium anisopliae Come micosintetizzatore: dallisolamento al campo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 15 s
Description: Scopri lo sviluppo di un micoinsetticida con Metarhizium anisopliae per il controllo biologico dei parassiti agricoli. Questo metodo include isolamento, screening e formulazione di ceppi fungini indigeni efficaci.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gli autori riconoscono il contributo dei collaboratori della Cooperazione indo-svizzera nel settore delle biotecnologie (ISCB) del Dipartimento di Biotecnologie di Nuova Delhi e dell&#39;Agenzia svizzera per lo sviluppo e la cooperazione, Berna, Svizzera. Sono stati riconosciuti i contributi degli studenti del progetto e del personale coinvolto nello sviluppo del miocoinsettico, tra cui Vandana Ghormade, Pallavi Nahar, Priya Yadav, Shuklangi Kulkarni, Manisha Kapoor, Santosh Chavan, Ravindra Vidhate, Shamala Mane e Abhijeet Lande. L&#39;ECP e l&#39;SGT ringraziano rispettivamente per la borsa di studio della Commissione di Grants Commission dell&#39;India e del Consiglio di ricerca scientifica e industriale (CSIR), India. MVD riconosce il sostegno del Consiglio di ricerca industriale e scientifica, New Delhi, per il programma Emeritus Scientist. Gli autori sono grati al Dipartimento di Biotecnologie, Nuova Delhi, India per il sostegno finanziario nell&#39;ambito dei programmi ISCB e SBIRI. Siamo gratiRecensori per i loro input.

1. Isolamento di funghi entomopatogeni <ol><li> Metodo di diluizione del suolo <ol><li> Raccogliere i campioni di terreno e insetti micotizzati da diversi campi di coltura ( Tabella 1 ). Isolare i funghi entomopatogeni da campioni di terreno utilizzando il metodo di placcatura di diluizione del terreno 8 . Nota: In questo studio sono stati prelevati campioni dal Pune (18 ° 31&#39;13&#39;&#39;N; 73 ° 51&#39;24&#39;&#39;E) e Buldhana (19 ° 58&#39;36&#39;&#39;N 76 ° 30&#39;30&#39;&#39;E ) Distretti, Maharashtra, India. </li><li> Pesare 10 g di ogni campione di terreno e aggiungerli separatamente a 90 ml di sterile 0,1% (w / v) Tween-80. </li><li> Miscelare accuratamente i campioni usando un agitatore magnetico per 60 min per liberare le spore aderenti alle particelle del terreno. </li><li> Dopo la miscelazione, distribuire aliquote da 100 a 200 μl da ciascun campione su un supporto selettivo contenente (g / L): peptone, 10; Glucosio, 20; Agar, 18; Streptomicina, 0,6; Tetraciclina, 0,05; cycLohexamide, 0,05; E dodina, 0,1 mi; PH 7,0 9 . Incubare le piastre a 28 ° C per 3-7 giorni. </li><li> Selezionare e subcultare le singole colonie sporulose sul medesimo mezzo per ottenere culture pura. </li></ol></li><li> Da insetti micotizzati <ol><li> Raccogli gli insetti micotizzati dal campo. Nota: un corpo larvale duro è probabilmente infetto da fungo entomopatogeno. Con infezione batterica o virale, il corpo insetto morto è morbido. </li><li> Raccogliere insetti vivi con un comportamento anomalo, un cattivo coordinamento e movimenti sconnessi. </li><li> Tenere gli insetti fino alla morte e poi trasferirli in camere umide per ulteriori micosi e sporulazioni, se del caso, a 28 ° C e 70-80% di umidità. </li><li> Striate le spore dai cadaveri sporulanti sul medesimo mezzo selettivo sopra descritto e ottenere colture pura ulteriormente subculturando 2-3 volte sul medesimo mezzo. </li></ol></li><li> Metodo di esca <ol><li> In unFlaconcino (3,85 x 6,0 cm) contenente 60 g di campione di terreno, aggiungere 4 larve di falciole di riso ( Corcyra cephalonica ) e mantenere le fiale a 25 ± 2 ° C per un periodo di 14 giorni. </li><li> Girare i flaconcini a testa in giù ogni giorno. Dopo 14 giorni, esaminare i campioni di terreno per la presenza di larve di moth di riso micotizzato. Isolare il fungo entomopatogeno striando spore dai cadaveri sporulanti su un mezzo selettivo. </li><li> Dopo aver ottenuto le colture pura, trasferire gli isolati in agglomerati di patate dextrose agar (PDA) e incubare a 28 ° C e 70-80% RH per 7 giorni per permettere la sporulazione. Dopo la sporulazione, mantenere le culture madre a 8 ° C fino all&#39;uso. </li></ol></li></ol> 2. Identificazione dei funghi entomopatogeni <ol><li> Identificare i funghi entomopatogeni osservando le caratteristiche morfologiche ( cioè la dimensione e la forma spore asessuali e la disposizione delle spore sui conidiofori); Isolati di 3 generi principali, Metarhizium , Beauv<html> Eria , e Nomuraea , possono essere identificati. </li><li> Per l&#39;identificazione molecolare dei ceppi Metarhizium , estrarre il DNA genomico dalla biomassa micelica utilizzando un kit di isolamento del DNA; Seguire le istruzioni del produttore (vedere la tabella dei materiali ). Controllare la qualità del DNA genomico eseguendo elettroforesi su un agarosio 0,8%. <ol><li> PCR amplifica la regione rDNA ITS1-5.8S-ITS2 e 26S. Utilizzare il DNA genomico come template, con ITS1 avanti (TCCGTAGGTGAACCTGCGG) e ITS4 reverse (TCCTCCGCTTATTGATATGC) 10 . </li><li> Gel eluire e purificare gli ampliconi previsti con un kit di estrazione del gel; Seguire le istruzioni del produttore (vedere la tabella dei materiali ). Quantificare l&#39;amplicone purificato e la sequenza. </li><li> Leggere e modificare le sequenze usando il software e eseguire una ricerca BLAST delle sequenze di nucleotidi nella libreria dati NCB GenBank per analizzare la vicinanza omologica= &quot;Xref&quot;&gt; 11. </li><li> Depositare le sequenze di isolati entamopatogeni identificati nel database NCB GenBank per recuperare i numeri di accesso. </li></ol></li></ol> 3. Proiezione di isolati di metarizio contro H. armigera <ol><li> Allevamento insetti <ol><li> Stabilire la cultura iniziale di H. armigera raccogliendo le larve sane e il pupa dell&#39;insetto dal campo. </li><li> Per l&#39;allevamento, far crescere le larve singolarmente in flaconi di polipropilene sterile (3.85 x 6.0 cm, capacità 50 mL) contenenti pezzi di okra disinfettati con ipoclorito di sodio 0,5% (v / v) per 10 min 12 . </li><li> Raccogli le uova da insetto poste durante l&#39;allattamento e sterilizzarle in superficie con 0,5% (v / v) ipoclorito di sodio. </li><li> Mantenere le larve a 25 ± 2 ° C e 65 ± 5% RH. </li></ol></li><li> Bioassay insetti Nota: per la biopsia dell&#39;insetto, la produzione di spore,E gli studi sullo stato del campo, sono state utilizzate le prime sottoculture di ceppi Metarhizium dalle larve munite di H. armigera , salvo diversa indicazione. <ol><li> Per i bioassays degli insetti, utilizzare le larve III-instar di H. armigera . </li><li> Immergere un gruppo di 30 larve in triplice copia singolarmente in una sospensione di spore da 10 ml di isolati di Metarhizium (1 x 10 7 spore / ml, salvo altrimenti menzionato, con&gt; 90% di vitalità) per 5 s. </li><li> Dopo il trattamento, trasferire ogni larva singolarmente in un flacone sterile separato per evitare il cannibalismo. Ad ogni flaconcina, aggiungere la carta filtrante umida Whatmann n. 1 e un pezzo di okra disinfettata come alimentazione. Cambiare la carta e il feed in giorni alternativi. </li><li> Tenere le larve a 25 ± 2 ° C, 65 ± 5% RH e 16: 8 luce: scura per 14 giorni o fino a morire. </li><li> Trasferire le larve morte alle piastre di Petri sterili contenenti tamponi di cotone umido e mantenerli a 28 ° C e 70-80% RH per 3-7 giorni per consentire la miceli e la sporaFormazione sui cadaveri. </li><li> Per un controllo, trattare un insieme di 30 larve in triplice copia con 0,1% (w / v) Tween-80 in acqua distillata sterile. </li><li> Eseguire tutto l&#39;esperimento in triplice copia utilizzando sospensioni di spore appena preparate. Raccogliere e raggruppare i dati sulla mortalità percentuale da tre esperimenti per ottenere valori medi. Calcolare la mortalità percentuale corretta utilizzando la formula di Abbott 13 . </li><li> Eseguire gli esperimenti utilizzando un layout randomizzato completo di blocco (RCBD), con ogni trattamento contenente un insieme di 30 larve in triplice copia. Sulla base della mortalità percentuale contro H. armigera , selezionare gli isolati di Metarhizium per ulteriori screening del miglior isolamento per la produzione commerciale. </li><li> Selezionare gli isolati che dimostrano una mortalità&gt; 90% contro le larve H. armigera III-instar. Nota: Qui sono stati selezionati 12 isolati. </li><li> Determinare il LT 50 di questi isolati e selezionare gli isolati dimostranoRating l&#39;uccisione più veloce (in meno tempo). Nota: Qui sono stati selezionati 5 isolati dai 12 isolati più potenti. </li><li> Determinare i valori LC 50 del selezionato gli isolati utilizzando quattro concentrazioni differenti (cioè, 1 × 10 3, 1 x 10 5, 1 × 10 7, e 1 × 10 9 spore / mL) di sospensione di spore. </li><li> Determinare la LC 50 del Metarhizium isolati contro-III instar larve di H. armigera per aumentare la possibilità di identificare la differenza di virulenza di isolati con alti valori di mortalità che potrebbero passare inosservato se viene utilizzata solo una singola dose. </li></ol></li></ol> 4. Produzione di spore di un metarosio isolante per gli studi di performance sul campo <ol><li> Produzione di spore di Metarhizium da SSF <ol><li> Per SSF, preparare l&#39;inoculo aggiungendo 2 x 10 7 spore degli isolati di Metarhizium a200 ml di YPG (0,3% di estratto di lievito, 0,5% di peptone e 1,0% di glucosio). Incubare le fiasche a 28 ° C con agitazione (180 rpm) per 48 h. </li><li> Per la produzione in serie di spore da SSF, utilizzare il riso come substrato, salvo diversa indicazione. </li><li> Per SSF, riempire i sacchetti di autoclave (tipo / 14 con un solo filtro microventato di 0,5 μm, capacità 2 kg, 64 × 36 cm) con 2 kg di riso. Aggiungere 1000 ml di acqua distillata al riso nei sacchetti e immergere la notte 14 . Autoclave i sacchetti con il riso bagnato a 121 ° C per 45 minuti 15 . </li><li> Inoculare i sacchi con inoculo micelio di 48 ore (inoculo del 10%, 200 mL per 2 kg di riso) e incubare a 28 ° C e al 70-80% di umidità per 14 giorni. </li><li> Raccogliere le spore mediante estrazione liquida usando lo 0,1% di Tween-80. A questo scopo aggiungere il contenuto della borsa a 0,1% Tween-80 (3 L per 1 kg di riso), mescolare accuratamente, separare le spore dal liquido per centrifugazione e asciugare a 37 ° C per 2 giorni.<html> / Li&gt; <li> In alternativa, asciugare i sacchetti contenenti riso con spore e qualche micelio a 37 ° C per 2 giorni per ridurre il tenore di umidità (&lt;20%). Raccogli le spore usando un mietitrebbiatrice o un vibratore. </li></ol></li><li> Studi di vitalità <ol><li> Determinare la vitalità percentuale delle spore raccolte utilizzando metodi diversi 15 . Per questo, preparare le sospensioni dello spore nello 0,1% (w / v) Tween-80 e regolare il conteggio a 1 × 10 3 spore / ml. </li><li> Spalmare le sospensioni di spore (0,1 mi) sulle piastrine PDA in triplice copia e incubare a 28 ° C e il 70-80% RH per 72 h. </li><li> Contare manualmente le colonie isolate e determinare il conteggio totale vitale per il rispettivo campione. </li></ol></li><li> Tasso di sedimentazione di spore <ol><li> Per un dosaggio uniforme, è richiesta la sospensione omogenea di spore; Determinare i tassi di sedimentazione di spore per gli isolati di Metarhizium come descritto&quot;Xref&quot;&gt; 16. Controllare i tassi di sedimentazione di spore in 0,2 M di solfato di ammonio e 0,1% di Tween-80. </li><li> Regolare il conteggio della sospensione di spore a ~ 7 × 10 7 spore / ml per ottenere un&#39;assorbanza iniziale di 0,6 a 540 nm. Lasciare che le cuvette rimangano indisturbate per 6 ore affinchè le spore si stabiliscano. </li><li> Registrare l&#39;assorbanza fino a 6 h. Esprimere il tasso di sedimentazione in percentuale e calcolare il tempo necessario per la sedimentazione del 50% (ST 50 ). Ripetere l&#39;esperimento tre volte utilizzando sospensioni spore appena preparate. </li></ol></li></ol> 5. Studi sul rendimento del campo della capacità del M. anisopliae selezionati isolati per il controllo di H. armigera in piselli <ol><li> Formulazione polvere bagnabile di M. anisopliae M 34412 spore <ol><li> Preparare la formulazione di polvere bagnabile da 2,5-5% mescolando le spore con talco. </li><li> Regolare il conteggio finale utile (TVC) a 1 x 10 12 spoRes per kg di formulazione. </li></ol></li><li> Studi di performance del campo delle spore M. anisopliae M 34412 <ol><li> Per studi sulle prestazioni del campo della capacità dell&#39;isolato M. anisopliae selezionato di controllare l&#39;infestazione di H. armigera nei piselli di piccione, utilizzare un RCBD con quattro repliche. Nota: Qui, eseguito a Mahatma Phule Krushi Vidyapeeth (MPKV), Rahuri (19,3927 ° N, 74,6488 ° E). </li><li> Utilizzare due diverse formulazioni spray, una formulazione olio di spore (5 x 10 12 spore / 3 l di gasolio: olio di girasole, 7: 3) e una formulazione acquosa in Tween-80 (0,1%). Spruzzare la formulazione dell&#39;olio con uno spruzzatore ultra-basso (ULV) (70 min, 3 l / ha) la formulazione acquosa con un irroratore a sacco (5 x 10 12 spore, 500 l / ha). Nota: qui le popolazioni di larve sono state registrate un giorno prima dello spray e 3 e 7 giorni dopo l&#39;applicazione di ciascun spray a 5 piante selezionate a caso. La popolazione totale è stata tRansformato alla radice quadrata di n + 1 per l&#39;analisi statistica. <ol><li> Secondo le pratiche agricole per la coltura di piselli piccoli, eseguire la prima spruzzatura tra 10 e 15 d dopo la posa dell&#39;uovo e altre 2 volte con un intervallo di 14 giorni. Eseguire la spruzzatura tra le 16:00 e le 18:00 h IST. Monitorare la direzione del vento e, se necessario, usare le tende di tela per evitare la deriva di spore alle appezzamenti vicini. </li></ol></li><li> Per il confronto, spruzzare gli insetticidi chimici con uno spruzzatore a compressione a mano. </li><li> Determinare la persistenza dell&#39;inoculo nel campo raccogliendo H. largae armigera 0, 3, 5, 7 e 14 giorni dopo la spruzzatura. </li><li> Tenere queste larve sotto osservazione per un periodo di 14 giorni e dopo la morte, trasferirle in un flaconcino di plastica contenente carta filtrante umida. Incubare a 25 ± 2 ° C e 70 ± 10% RH per osservare la micosi. </li><li> Determinare la persistenza dell&#39;inoculo sulla popolazione larvale basata sul p<html> Dati sulla mortalità eruttiva delle larve raccolte dal campo dopo la spruzzatura. </li><li> Valutare gli studi sul campo sulla base dell&#39;efficacia percentuale 17 , il danno del pod di percentuale e il rendimento percentuale 18 . Nota: Qui sono stati registrati i dati relativi ai parametri, quali temperatura, umidità, velocità del vento (km / h), sole (h), precipitazioni (mm), giorni di pioggia e evaporazione (mm) durante una prova Università agricola (Mahatma Phule Krushi Vidyapeeth, Rahuri, 19.3927 ° N, 74.6488 ° E). </li></ol></li><li> Programma partecipativo degli agricoltori <ol><li> Seleziona il numero degli agricoltori per le prove dimostrative. Fornire i semi di pisello di piccioni (BSMR - 736) insieme al concime agli agricoltori. Nota: In questo studio sono stati coinvolti 20 agricoltori. Villaggio: Deolali Pravara, (19.473 ° N 74.6 ° E). </li><li> Utilizzare le stesse formulazioni spray e il numero di spruzzi come nel punto 5.2. </li></ol></li></ol>6.&gt; Effetti sugli organismi non bersaglio <ol><li> Osservare l&#39;effetto di spruzzo di miosinside, se presente, sulle foglie di pisello di piccioni. </li><li> Raccogliere gli artropodi di dimora del terreno e gli insetti che coltivano foglie 1 giorno dopo ogni trattamento nelle trame non trattate e nelle parcelle trattate con M. anisopliae . </li><li> Raccogliere gli artropodi del terreno con le trappole entro 24 ore dopo il trattamento e raccogliere gli insetti che sopravvivono in foglia con una rete di spazzata la mattina dopo il trattamento ( cioè circa 15-18 h dopo il trattamento). </li><li> Tenerli individualmente in scatole di plastica cilindrica con diametri di 3,5 cm e altezze di 4,0 cm. Controllare ogni giorno gli insetti per infezione e nutrirli con cibo appropriato. </li><li> Registrare la presenza di M. anisopliae , se del tutto, e isolare il fungo. </li></ol> 7. Identificazione dei parametri di controllo della qualità <ol><li> Controllare la vitalità dello spore misurando la germinazione dello spore sul PDA a 28 °; C. </li><li> Misurare le attività enzimatiche che degradano la cuticola, come la chitina, la chitina deacetilasi, la chitosanasi, la proteasi e la lipasi, prodotte nel mezzo YPG e nei chitin, come descritto in precedenza 15 . </li><li> Determinare la mortalità percentuale di H. armigera in un laboratorio di biopsaggio 15 . </li><li> Utilizzare marcatori molecolari, come un modello PCR-RFLP di geni di Chitinasi ( Chit 1 , 2 e 4 ) e proteasi ( Pr1A ), come attributi di virulenza per M. anisopliae . <ol><li> Estrarre il DNA genomico dalla biomassa di micelio utilizzando un kit di isolamento del DNA 15 . PCR amplifica i frammenti di gene Chit1 e Chit2 usando il DNA genomico come un template, con coppie di primari Chit1F / Chit1R (CTCTGCAGGCCACTCTCGGT / AGCCATCTGCTTCCTCATAT) e Chit2F / Chit2R (GACAAGCACCCGGAGCGC / GCCTTGCTTGACACATTGGTAA). Per Chit4 , utilizzare la coppia di primari Chit4F / Chit4R (ATCCGGCAGCACGGCTAC / CTTGGATC CGTCCCAGTTG). </li><li> Per l&#39;amplificazione del gene Pr1A, utilizzare la coppia di primer METPR2 e METPR5 (AGGTAGGCAGCCAGACCGGC / TGCCACTATTGGCCGGCGCG). </li><li> Eseguire la digestione di restrizione 19 del gene Chit1 con BsaJI, BstUI e ScrFI; del gene Chit2 con AluI, HpyCH4IV e HpyCH4V, e del gene Chit4 con BstUI, HaeIII e MboI. Per la digestione del gene Pr1A , utilizzare RsaI , DdeI e MspI 20 . </li><li> Osservare il polimorfismo della lunghezza del frammento di restrizione (RFLP) sul gel agarosio dell&#39;1,5% mediante elettroforesi per ciascun gene per i ceppi più virulenti (&gt; 90% mortalità); Questo può essere usato come marker di virulenza per la selezione di M. anisopliae . </li></ol></li></ol>

<ol><li>Aktar, M. W., Sengupta, D., Chowdhury, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+pesticides+use+in+agriculture%3A+their+benefits+and+hazards%5BTitle%5D)+AND+%22Interdisciplinary+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Impact of pesticides use in agriculture: their benefits and hazards.</a> Interdisciplinary Toxicology. 2 (1), 1-12 (2009).</li>
<li>Dhaliwal, G. S., Jindal, V., Mohindru, B. <a target="_blank" href="http://www.indianjournals.com/ijor.aspx?target=ijor:ije&volume=77&issue=2&article=012">Crop losses due to insect pests: Global and Indian scenario.</a> Indian J Entomol. 77 (2), 165-168 (2015).</li>
<li>Popp, J., Peto, K., Nagy, J. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s13593-012-0105-x">Pesticide productivity and food security. A review.</a> Agronomy for Sustainable Development. 33 (1), 243-255 (2015).</li>
<li>van Lenteren, J. C., Manzaroli, G. Evaluation and use of predators and parasitoids for biological control of pests in greenhouses. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3avan+Lenteren%2C+JC+%22Integrated+pest+and+disease+management+in+greenhouse+crops%22">Integrated pest and disease management in greenhouse crops</a>. Albajes, R., Gullino, M. L., van Lenteren, J. C., Elad, Y. , Kluwer. Dordrecht, The Netherlands. 183-201 (1999).</li>
<li>Charnley, A. K., Collins, S. A. Entomopathogenic fungi and their role in pest control. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCharnley%2C+AK+%22The+Mycota+IV%3A+Environmental+and+Microbial+Relationships%22">The Mycota IV: Environmental and Microbial Relationships</a>. Kubicek, C. P., Druzhinina, I. S. , 2nd, Springer-Verlag. Berlin. 159-187 (2007).</li>
<li>Deshpande, M. V., et al. Comparative evaluation of indigenous fungal isolates, Metarhizium anisopliae M34412, Beauveria bassiana B3301 and Nomuraea rileyi N812 for the control of Helicoverpa armigera (Hüb.) on pulses. <a target="_blank" href="null">Proceeding of the international workshop on entomopathogenic fungi - a valuable alternative to fight against insect pests</a>. MV, D. eshpande , National Chemical Laboratory. Pune, India. 51-59 (2004).</li>
<li>Roberts, D. W., Hajek, A. E. Entomopathogenic fungi as bioinsecticides. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoberts%2C+DW+%22Frontiers+in+industrial+mycology%22">Frontiers in industrial mycology</a>. Leathan, G. F. , Chapman & Hall. New York, NY. 144-159 (1992).</li>
<li>Goettel, M., Inglis, G. D. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/book/9780124325555">Fungi: Hyphomycetes. Manual of techniques in insect pathology</a>. Lacey, L. A. , Academic Press. USA. 213-245 (1996).</li>
<li>Keller, S., Kessler, P., Schweizer, C. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1023/A:1023646207455">Distribution of insect pathogenic soil fungi in Switzerland with special reference to Beauveria brongniartii and Metharhizium anisopliae.</a> BioControl. 48 (3), 307-319 (2003).</li>
<li>White, T. J., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J., et al. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWhite%2C+TJ+%22PCR-Protocols%3A+A+guide+to+methods+and+applications%22">PCR-Protocols: A guide to methods and applications</a>. Innis, M. A., et al. , Academic Press, Inc. San Diego. USA. 315-322 (1990).</li>
<li>Basic Local Alignment Search Tool. , 
 <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST ">http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST </a> (2017).</li>
<li>Ignoffo, C. M., Futtler, B., Marston, N. L., Hostetter, D. L., Dickerson, W. A. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0022201175902943">Seasonal incidence of the entomopathogenic fungus Spicaria rileyi associated with noctuid pests of soybeans.</a> J Invertebr Pathol. 25 (1), 135-137 (1975).</li>
<li>Abbott, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+computing+the+effectiveness+of+an+insecticide%5BTitle%5D)+AND+%22J+Econ+Entomol%22%5BJournal%5D)">A method for computing the effectiveness of an insecticide.</a> J Econ Entomol. 18 (2), 265-267 (1925).</li>
<li>Nahar, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Development+of+biocontrol+agents+for+the+control+of+pests+in+agriculture+using+chitin+metabolism+as+target%22">Development of biocontrol agents for the control of pests in agriculture using chitin metabolism as target</a>. , PhD thesis submitted to Department of Microbiology, University of Pune 137(2004).</li>
<li>Kulkarni, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/09583150802366475?journalCode=cbst20">Comparison of Metarhizium isolates for biocontrol of Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae) in chickpea.</a> Biocontrol Sci Tech. 18 (8), 809-828 (2008).</li>
<li>Jeffs, L. B., Khachatourians, G. G. <a target="_blank" href="http://www.nrcresearchpress.com/doi/abs/10.1139/m97-004#.WNVDdDvyuUk">Estimation of spore hydrophobicity for members of the genera Beauveria, Metarhizium, and Tolypocladium by salt-mediated aggregation and sedimentation.</a> Can J Microbiol. 43 (1), 23-28 (1997).</li>
<li>Henderson, C. F., Tilton, E. W. <a target="_blank" href="https://academic.oup.com/jee/article-abstract/48/2/157/2205826/Tests-with-Acaricides-against-the-Brown-Wheat-Mite?redirectedFrom=fulltext">Tests with acaricides against the brow wheat mite.</a> J Econ Entomol. 48 (2), 157-161 (1955).</li>
<li>Hassani, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Development+and+proving+of+biocontrol+methods+based+on+Bacillus+thuringiensis+and+entamopathogenic+fungi+against+the+cotton+pests+Spodoptera+littoralis%2C+Helicoverpa+armigera+%28Lepidoptera%3A+Noctuidae%29+and+Aphis+gossypii+%28Homoptera%3A+Aphididae%29%22">Development and proving of biocontrol methods based on Bacillus thuringiensis and entamopathogenic fungi against the cotton pests Spodoptera littoralis, Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae) and Aphis gossypii (Homoptera: Aphididae)</a>. , PhD thesis submitted to Justus-Liebig-University Giessen, Germany (2000).</li>
<li>Enkerli, J., Ghormade, V., Oulevey, C., Widmer, F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19682457">PCR-RFLP analysis of chitinase genes enable efficient genotyping of Metarhizium anisopliae var. anisopliae.</a> J Invert Pathol. 102 (2), 185-188 (2009).</li>
<li>Bidochka, M. J., Melzer, M. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11142404">Genetic polymorphism in three subtilisin-like protease isoforms (Pr1A, Pr1B and Pr1C) from Metarhizium strains.</a> Can. J. Microbiol. 46 (12), 1138-1144 (2000).</li>
<li>McCoy, C. W., Samson, R. A., Boucias, D. G. Entomogenous fungi. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMcCoy%2C+CW+%22Handbook+of+natural+pesticides%2C+Microbial+insecticides%2C+Part+A.+Entomogenous+protozoa+and+fungi%22">Handbook of natural pesticides, Microbial insecticides, Part A. Entomogenous protozoa and fungi</a>. Ignoffo, C. M., Mandava, N. B. , CRC Press. Boca Raton, FL. 151-236 (1988).</li>
<li>Nahar, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/09583150801935650">Effect of repeated in vitro sub-culturing on the virulence of Metarhizium anisopliae against Helicoverpa armigera (Lepidoptera Noctuidae).</a> Biocontrol Sci Tech. 18 (4), 337-355 (2008).</li>
<li>Kapoor, M., Deshpande, M. V. Development of mycoinsecticide for the control of insect pests: Issues and challenges in transfer of technology from laboratory to field. Kavaka. 40, 45-56 (2013).</li>
<li>Deshpande, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycopesticide+Production+by+Fermentation%3A+Potential+and+Challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mycopesticide Production by Fermentation: Potential and Challenges.</a> Crit Rev Microbiol. 25 (3), 229-243 (1999).</li>
</ol>

Gli autori non hanno niente da rivelare.

<html> Durante gli anni &#39;80 il primo tentativo è stato quello di utilizzare Metarhizium per controllare il coleottero scarabeo Anisoplia austriaca e la barbabietola da zucchero curculio Cleonis punctiventris 21 . In questo protocollo, uno dei prerequisiti era quello di isolare un ceppo virulente, sia dal suolo che da insetti infetti. Infatti, altri parametri, come LC 50 , LT 50 e ST 50 , hanno contribuito significativamente all&#39;ef...

<html> Dall&#39;introduzione di pesticidi organoclorurati negli anni &#39;40 in India, l&#39;uso di pesticidi è aumentato in molte pieghe 1 , con i coltivatori che costano ancora miliardi di rupie 2 ogni anno in termini di perdita di rendimento nella produzione agricola. L&#39;uso diffuso e non razionale di pesticidi sintetici è una minaccia continua per l&#39;ambiente e la salute umana 1 . L&#39;uso indiscriminato di pesticidi porta a residui nel suolo e l&#39;esaurimento di predatori di peste naturali. Serve anche come una potente pressione di selezione per alterare il trucco genetico di una popolazione di parassiti, portando allo sviluppo della resistenza 1 . Nonostante gli enormi vantaggi della rivoluzione verde, che richiedono ingenti input, come fertilizzanti e pesticidi, i parassiti continuano ad essere un importante vincolo biotico. Una stima generale delle perdite annue delle colture registrate in India e in tutto il mondo è di 12 miliardi di dollariEf &quot;&gt; 2 e 2 000 miliardi di dollari 3 rispettivamente. Quando i pesticidi chimici hanno effetti dannosi quando vengono usati per controllare i parassiti degli insetti, è indispensabile cercare metodi alternativi ecologicamente sani, affidabili, economici e sostenibili. Il controllo biologico offre un&#39;alternativa appropriata e comprende l&#39;uso di parassiti, predatori e patogeni microbici 4 . I funghi, per esempio, sono conosciuti per infettare un&#39;ampia gamma di insetti di insetti, tra cui i lepidotteri, gli imenotteri, i coleopterani e i dipftani, spesso causando epizootica naturale. Inoltre, a differenza di altri agenti di controllo degli insetti batterici e virali, il modo di azione dei funghi patogeni insetti è dal contatto 5 . Questi funghi comprendono un gruppo eterogeneo di oltre 100 generi, con circa 750 specie riportate tra diversi insetti. I principali patogeni fungini sono: Metarhizium sp., Beauveria sP., Nomuraea rileyi , Lecanicillium lecanii e Hirsutella sp., Per citarne alcuni 6 . M. anisopliae (Metchnikoff) Sorokin è il secondo fungo entomopatogeno più diffuso nel biocontrollo. È noto per attaccare oltre 200 specie di insetti 7 . In questo studio vengono presentati diversi stadi coinvolti nello sviluppo della conoscenza di un micopesticide usando M. anisopliae . Ciò include: 1) l&#39;identificazione di una sorgente ( cioè insetti di terreno o di micosi) per entomopatogeni virulenti, 2) identificazione e selezione degli entomopatogenici, 3) strategie per mantenere la loro natura virulenta e l&#39;efficacia nel laboratorio di biopsaggio e nel campo 4 ) La formulazione economica dei propagulatori infettivi, 5) lo sviluppo di parametri unici di controllo della qualità per la preparazione virulenta e 6) la bioprogettazione e l&#39;aggiunta di valore.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Hi-Media</td><td>RM666</td><td>Reagente</td></tr><tr><td>Solfato di ammonio&nbsp;</td><td>Thomas Baker</td><td>11645</td><td>Analizzatore</td></tr><tr><td>di DNA reagente&nbsp;</td><td>Biosistema applicato</td><td>ABI prisma 3730&nbsp; &nbsp;</td><td>strumento</td></tr><tr><td>Kit di isolamento del DNA</td><td>Qiagen</td><td>69104</td><td>Reagente</td></tr><tr><td>Dodine</td><td>Sigma</td><td>45466</td><td>Reagente</td></tr><tr><td>Kit di estrazione del gel</td><td>Qiagen</td><td>28604</td><td>Reagente</td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Hi-Media</td><td>GRM077</td><td>Reagente</td></tr><tr><td>Knapsac sparyer</td><td>Kaypee</td><td>HY-16L (1004)</td><td>Strumento</td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Hi-Media</td><td>RM006-500G</td><td>Reagente</td></tr><tr><td>Fiale in polipropilene&nbsp;</td><td>Laxbro</td><td>SV-50</td><td>Plasticware</td></tr><tr><td>Destrosio di patate agar (PDA)&nbsp;</td><td>Hi-Media</td><td>M096-500G</td><td>Reagente</td></tr><tr><td>Tween-80</td><td>SRL</td><td>28940</td><td>Reagente</td></tr><tr><td>Sparyer a bassissimo volume</td><td>Matabi</td><td>INSECDISK</td><td>Strumento</td></tr><tr><td>Unicorn-bags&nbsp;</td><td>Unicorn</td><td>UP-140024-SMB</td><td>Sacca autoclavale per SSF</td></tr><tr><td>Estratto di lievito</td><td>Hi-Media</td><td>RM027-500G</td><td>Reagente</td></tr><tr><td>Chromas 2.1</td><td></td><td></td><td>software</td></tr></tbody></table>

sviluppo di<em&gt; metarhizium anisopliae</em&gt; come micosintetizzatore: dall&#39;isolamento al campo

Development of Metarhizium anisopliae as a Mycoinsecticide: From Isolation to Field Performance

Una preoccupazione importante per lo sviluppo di micosensitici commerciali è la velocità di uccisione rispetto a quella degli insetticidi chimici. Di conseguenza, l&#39;isolamento e lo screening per la selezione di un fungo entomopatogeno ad azione rapida e altamente virulente sono passi importanti. I funghi entomopatogeni, come Metarhizium, Beauveria e Nomurea , che agiscono per contatto, sono più adatti a quelli del Bacillus thuringiensis o del virus nucleopolyhedrosis (NPV), che devono essere ingeriti dall&#39;infezione insettica. Nel presente lavoro, abbiamo isolato 68 ceppi Metarhizium da insetti infetti usando una metodologia di diluizione del suolo e di esca. Gli isolati sono stati identificati mediante l&#39;amplificazione e il sequenziamento della regione rDNA ITS1-5.8S-ITS2 e 26S. Il ceppo più virulento di Metarhizium anisopliae è stato selezionato sulla base della concentrazione letale media (LC 50 ) e del tempo (LT 50 ) ottenuta in bioassay insetti contro le larve III-instar di Helicoverpa armigera.La produzione di massa di spore dal ceppo selezionato è stata effettuata con fermentazione allo stato solido (SSF) utilizzando riso come substrato per 14 giorni. Spore vennero estratte dalla biomassa sporulata usando lo 0,1% di tween-80 e sono state preparate diverse formulazioni delle spore. Le prove in campo delle formulazioni per il controllo di un&#39;infestazione H. armigera nei piselli di piccione sono state eseguite mediante un blocco randomizzato. I livelli di controllo dell&#39;infestazione ottenuti con olio e formulazioni acquose (rispettivamente 78,0% e 70,9%) erano migliori rispetto al 63,4% ottenuto con pesticidi chimici.

Durante le indagini sono stati isolati diversi tipi di Metarhizium, Beauveria e Nomuraea con vari metodi di isolamento (dati non mostrati) 6 , 14 Come i ceppi di Metarhizium sono stati trovati più efficaci nel controllare H. armigera , un terribile parassita negli impulsi 6 , 14 , Ulteriori isolamenti sono stati mirati ad isolare i ceppi di Metarhizium da dive...

Qui riportiamo le varie fasi che interessano lo sviluppo della conoscenza di un miinoinsinidico efficace, incluso l&#39;isolamento, l&#39;identificazione, la selezione e la selezione del fungo entomopatogeno &quot;best-fit&quot;, Metarhizium anisopliae , per il controllo dei parassiti insetti nell&#39;agricoltura .

Sviluppo di<em&gt; Metarhizium anisopliae</em&gt; Come micosintetizzatore: dall&#39;isolamento al campo

A major concern when developing commercial mycoinsecticides is the kill speed compared to that of chemical insecticides. Therefore, isolation and ...

L'uso indiscriminato di pesticidi sintetici rappresenta una minaccia costante per l'ambiente e la salute umana. Il controllo biologico mediante batteri, virus e funghi è un'alternativa adeguata per contrastare diversi parassiti insettici in agricoltura. A differenza di batteri e virus, i funghi patogeni per insetti sono efficaci per contatto.Le specie di Metarhizium sono tra i funghi patogeni per insetti più efficaci. È noto che attaccano più di 200 specie di insetti dannosi. Abbiamo sviluppato un micoInsetticida utilizzando spore di isolati indigeni di Metarhizium.In questo video verranno illustrati i protocolli per l'isolamento e l'identificazione di isolati fungini locali, il bioassaggio su insetti per selezionare e schermare ceppi più potenti, la produzione di spore di ceppi selezionati di Metarhizium e il protocollo per creare una formulazione economicamente vantaggiosa del micoinsetticida per applicazioni in campo. Verranno inoltre evidenziate le misure di controllo qualità da adottare durante la produzione commerciale. L'isolamento dei funghi entomopatogeni può essere effettuato mediante tre metodi.Prima di tutto, dai suoli. Metarhizium è un fungo presente naturalmente nella maggior parte dei suoli. Per ottenere una vasta varietà di isolati, vengono raccolti suoli da campi coltivati con diverse tipologie di colture e da regioni geograficamente distanti.Il campione di suolo viene prelevato da quattro a sei pollici sotto la superficie. I campioni provenienti dal campo vengono raccolti in sacchetti etichettati e successivamente, in laboratorio, 10 grammi di ciascun campione vengono trasferiti in provette. Metarhizium viene isolato mediante il metodo della piastra per diluizione del suolo.10 grammi del campione di suolo vengono trasferiti in 90 ml di Tween 80 sterile allo 0,1%. La sospensione viene mescolata con un agitatore magnetico per 60 minuti. Nel frattempo, vengono preparati aliquote da 900 microlitri di Tween 80 per la diluizione seriale.Il soprannatante della sospensione viene ora diluito in modo seriale negli aliquote di Tween 80. Un'aliquote di cento microlitri di ciascun campione viene distribuita sul mezzo descritto da Keller e altri. Le piastre vengono incubate a 28 gradi per tre-sette giorni.Le singole colonie sporulanti vengono successivamente sottocoltivate sullo stesso mezzo per ottenere colture pure. Per isolare il fungo patogeno per insetti, si raccolgono insetti morti dai campi. Le spore provenienti da cadaveri micosi vengono separate trasferendole in Tween 80 e quindi sottoponendole a vortex. La sospensione di spore viene quindi seminata su una piastra in agar. Colture pure si ottengono mediante ulteriori subcolture sullo stesso mezzo. Per isolare funghi entomopatogeni dal suolo, si utilizzano larve di malto di riso.A un vial contenente 60 grammi di campione di suolo vengono aggiunte quattro larve di maltodestrina di riso. I vial sono incubati a 28 gradi. Poiché queste larve normalmente si muovono in profondità nel suolo, i vial vengono capovolti ogni giorno per un massimo di 14 giorni per favorire il contatto tra le larve e le spore fungine presenti nel suolo.I larve morte vengono rimosse di tanto in tanto e conservate per la sporulazione in un incubatore umidificato. Il processo di isolamento del fungo è lo stesso utilizzato per i cadaveri di insetti. Dopo aver ottenuto colture pure, gli isolati vengono mantenuti su provette con agar PDA, e le colture madri vengono conservate a otto gradi centigradi fino all'uso.Per l'identificazione dei funghi, il DNA genomico viene estratto dalla biomassa miceliare. Per l'identificazione degli isolati di Metarhizium, i primer utilizzati sono quelli a cinque estremità, a tre estremità, ITS1 e ITS4. Gli ampliconi di dimensione prevista vengono eluiti da gel, quantificati e sottoposti a sequenziamento.Le sequenze sono state quindi verificate mediante il database NCBI GenBank per l'identificazione a livello di specie degli isolati. Campioni di suolo e insetti morti raccolti nei distretti di Pune e Buldana, Maharashtra, India, hanno fornito 68 isolati distinti di Metarhizium. Di questi, 58 sono stati isolati da suoli e 10 da insetti.55 erano Metarhizium anisopliae, otto erano Metarhizium flavoviride e cinque, Metarhizium robertsii. Le spore provenienti dai pendii inclinati vengono aggiunte a 10 ml di Tween 80 e vengono vortexate. Per il bioassay sugli insetti, il conteggio delle spore viene effettuato utilizzando un emocitometro.E il conteggio viene aggiustato a 10 elevato a sette spore per ml. Un insieme di 30 larve, in triplice replicato, viene immerso singolarmente in una sospensione di spore da 10 ml di ciascun isolato di Metarhizium per cinque secondi. Per i saggi biologici sugli insetti si utilizzano larve di Helicoverpa armigera in stadio finale del secondo o iniziale del terzo instar.Dopo il trattamento, ciascun larva viene trasferito in una provetta sterile contenente carta filtrante Whatman numero uno umida e un pezzo di okra disinfettato come alimento. Un gruppo di 30 larve, in triplicato, trattato con Tween 80 allo 0,1% in acqua distillata sterile, funge da controllo. Le larve vengono mantenute fino alla morte e monitorate per un periodo massimo di 14 giorni.Questi passaggi sono stati ripetuti per tutti i 68 isolati. La percentuale di mortalità viene calcolata contando le larve morte e quelle vive. Le larve morte vengono trasferite in piastre di Petri sterili, contenenti soprattutto tamponi di cotone, e mantenute a 28 gradi centigradi e un'umidità relativa del 70-80% per tre-sette giorni per favorire la micosi e la sporulazione.I dati sulla percentuale di mortalità di tre esperimenti vengono combinati per ottenere valori medi, che vengono quindi corretti utilizzando la formula di Abbott. Sono stati selezionati 12 isolati di Metarhizium che hanno mostrato una mortalità superiore al 90% per determinare il tempo letale mediano nei confronti delle larve di terzo stadio di Helicoverpa armigera. Sulla base dei valori di LT50, sono stati identificati cinque isolati più rapidi nell'uccidere gli insetti.Le concentrazioni letali medie per i cinque ceppi identificati sono state determinate utilizzando quattro diverse concentrazioni di sospensione di spore. Sulla base dei valori di LC 50, sono stati selezionati tre ceppi di Metarhizium per la produzione di spore mediante fermentazione in stato solido. Il mezzo YPD viene preparato e sterilizzato mediante autoclave a 121 gradi centigradi per 20 minuti.Le spore provenienti dai terreni inclinati vengono trasferite in Tween 80 allo 0,1%. Le sospensioni di spore dei tre isolati di Metarhizium selezionati vengono aggiunte al mezzo YPD. I flaconi vengono quindi incubati su agitatore.Borse autoclavabili Unicorn riempite con due chilogrammi di riso vengono immerse per tutta la notte in un litro di acqua distillata e successivamente autoclavate a 121 gradi centigradi per 45 minuti. La fermentazione allo stato solido è stata testata su substrati come riso, sorgo, mais e grano. Tra i substrati testati, il riso ha consentito la massima sporulazione degli isolati di Metarhizium.I sacchetti vengono inoculati con una biomassa miceliale al 10% di 48 ore. Questa viene ben mescolata e incubata per 14 giorni. Le spore possono essere raccolte utilizzando diversi metodi.Per l'isolamento utilizzando Mycoharvester e Vibrosifter, i sacchetti contenenti micelio sporulato vengono essiccati a 37 gradi centigradi per due giorni al fine di ridurre il contenuto di umidità a meno del 20%. L'estrazione liquida è un metodo più efficiente. Il riso con le spore viene posto in contenitori grandi. Viene aggiunto Tween 80 allo 0,1% nei contenitori e la miscela viene mescolata accuratamente.Il soprannatante viene filtrato per rimuovere eventuali particelle di riso. Le spore vengono concentrate e separate mediante centrifugazione. Successivamente, le spore vengono essiccate a 37 gradi Celsius per due giorni.Queste spore possono essere conservate a meno 80 gradi centigradi fino all'uso. Per aumentare la durata durante la conservazione, viene aggiunto talco e mescolato con le spore. Per essere efficaci, le spore devono essere vitali; pertanto, è necessario identificare l'isolato che fornisce il numero massimo di spore vitali.Le sospensioni di spore vengono preparate in Tween 80 allo 0,1% e il numero viene aggiustato a 10 elevato a sette spore per ml. Vengono depositati 10 microlitri di sospensione di spore su vetrini PDA in triplice replicazione e quindi incubati. Entro 12 ore, le spore vitali iniziano a germinare.Dopo 12 ore, le spore formanti tubi germinativi vengono contate al microscopio. L'idrofilicità delle spore è importante perché il fungo aderisca al cuticolo degli insetti. Una sospensione di spore in solfato di ammonio e Tween 80 viene prelevata in una cuvetta.L'altra, senza le spore, viene utilizzata come controllo. Il conteggio della sospensione di spore viene regolato a circa sette-dieci elevato a sette spore per ml, in modo da ottenere un'assorbanza iniziale di 0,6 a 540 nanometri. Le cuvette vengono lasciate a riposo, indisturbate, per circa sei ore per consentire il sedimentamento delle spore.Viene registrata l'assorbanza e viene calcolato il tempo necessario per il 50% di alimentazione. Sulla base dei risultati, un ceppo è stato selezionato per applicazioni in campo. Gli altri due hanno funto da ceppi di riserva.La valutazione in campo dell'efficacia delle spore dell'isolato selezionato di Metarhizium M34412 nel controllo dell'infestazione di Helicoverpa armigera sulla coltura del pisello d'India è stata condotta secondo un disegno sperimentale a blocchi randomizzati con quattro ripetizioni. Sono state utilizzate due formulazioni diverse per l'applicazione tramite irrorazione. La formulazione in Tween 80 allo 0,1% è stata irrorata mediante un atomizzatore a spalla.Una formulazione oleosa di spore viene nebulizzata con un atomizzatore a volume ultra ridotto. La nebulizzazione viene effettuata al mattino o alla sera. La prima nebulizzazione avviene durante la fase di fioritura e viene ripetuta altre due volte a intervalli di 14 giorni.Helicoverpa armigera viene raccolta a zero, tre, cinque, sette e quattordici giorni dopo la nebulizzazione e mantenuta in una camera umidificata per la micosi. Durante le prove in campo per il controllo di Helicoverpa armigera nel pisello-tuono, è stata ottenuta un'efficacia superiore al 70% con Metarhizium anisopliae M34412. I danni ai baccelli nelle parcelle trattate con Metarhizium anisopliae si sono rivelati inferiori rispetto alle parcelle trattate con pesticidi chimici e alle parcelle di controllo non trattate.Le foglie di pisello d'angelo vengono esaminate per verificare eventuali effetti derivanti dalla formulazione del micoInsetticida a base di olio di girasole e gasolio. Gli artropodi del suolo e gli insetti che vivono sulle foglie sono stati raccolti dalle parcelle trattate con Metarhizium anisopliae. Non è stato osservato alcun effetto dannoso sugli artropodi non bersaglio.Le prove dimostrative sono state condotte in un villaggio, doo-lally-pra-va-da, con la partecipazione di 20 agricoltori. La formulazione è efficace contro altri insetti parassiti come la Peridroma saucia, la Etiella zinckenella, gli aleurodidi, gli afidi lanosi e le zanzare. Gli esperimenti hanno permesso di identificare i parametri essenziali di controllo della qualità nella produzione di micoinsetticidi.La vitalità delle spore, misurata come germinazione delle spore, dovrebbe essere superiore al 90% su PDA dopo 16 ore a 28 gradi centigradi e un'umidità relativa compresa tra il 70 e l'80%. La mortalità di Helicoverpa armigera dovrebbe essere superiore al 90% con 10 elevato a sette spore in saggio biologico di laboratorio. Ripetendo il passaggio su un mezzo artificiale di laboratorio, l'organismo perde la sua virulenza.Dopo aver coltivato il fungo in un mezzo contenente chitina per 72 ore, vengono misurate le attività di enzimi degradanti la cuticola come chitinasi, chitina deacetilasi, chitosanasi, proteasi e lipasi. Questi enzimi fungono da marcatori biochimici di virulenza. Per la digestione dei geni della chitinasi sono stati utilizzati quattro diversi gruppi composti ciascuno da tre enzimi di restrizione.Gli isolati con una mortalità superiore al 90% hanno mostrato il profilo specifico per tutti e tre i geni. Questi profili mostrano una correlazione significativa con i profili degli enzimi degradanti la cuticola prodotti extracellularmente dagli isolati di Metarhizium. Per la prima volta, proponiamo l'attività dell'enzima chitinasi e il profilo PCR del gene della chitinasi come marcatori di virulenza.Questo può fungere da indicatore di qualità per la produzione su scala commerciale. Per rendere il prodotto più conveniente, possiamo utilizzare il biomassa del micelio per la promozione delle radici delle piante. Può inoltre essere utilizzato per l'isolamento della chitosanasi a fini sanitari.Questi prodotti a valore aggiunto renderanno questo micoInsetticida a base di Metarhizium più redditizio.

development-metarhizium-anisopliae-as-mycoinsecticide-from-isolation

Research

Ricerca

JoVE Journal

Environment

Ambiente

Questo protocollo vengono illustrati due metodi di inoculazione per introdurre il entomopathogen...

Stabilire funghi entomopatogeni come endofiti: Verso endofiti Controllo Biologico

Qui presentiamo un protocollo basato sul sistema di esca del verme della farina (Tenebrio molitor) che è stato utilizzato per isolare e selezionare funghi entomopatogeni (EPF) da campioni di suolo. Una formula efficace del numero di conidi (ECN) viene utilizzata per selezionare EPF ad alta tolleranza allo stress in base alle caratteristiche fisiologiche per il controllo microbico dei parassiti sul campo.

Isolamento e selezione di funghi entomopatogeni da campioni di suolo e valutazione della virulenza fungina contro gli insetti nocivi

I funghi entomopatogeni hanno acquisito importanza come agenti di controllo biologico degli insetti nocivi agricoli. In questo studio, la produzione di massa di un numero sufficiente di propaguli infettivi resilienti di isolati sudafricani di Metarhizium robertsii e M. pinghaense per l'applicazione commerciale contro gli insetti nocivi è stata condotta con successo utilizzando prodotti a base di cereali agricoli.

Produzione di massa di funghi entomopatogeni, Metarhizium robertsii e Metarhizium pinghaense, per applicazioni commerciali contro gli insetti nocivi

Le colonie fungine entomopatogene sono isolate da campioni di terreno tropicale utilizzando l'esca Tenebrio , l'esca Galleria e il mezzo artificiale selettivo, cioè l'agar destrosio di patate arricchito con estratto di lievito integrato con cloramfenicolo, tiabendazolo e cicloeximide (mezzo CTC).

Confronto dei metodi per isolare i funghi entomopatogeni da campioni di suolo

Questo protocollo presenta un sistema ottimizzato di biodosaggio a foglia staccata per valutare l'efficacia dei funghi entomopatogeni (EPF) contro l'afide della senape (Lipaphis erysimi (Kalt.)), un insetto partenogenetico. Il metodo delinea il processo di raccolta dei dati durante gli esperimenti con piastre di Petri, consentendo ai ricercatori di misurare costantemente la virulenza dell'EPF contro gli afidi della senape e altri insetti partenogenetici.

Valutazione dell'effetto afididida di funghi entomopatogeni contro insetti partenogenetici, afide della senape, Lipaphis erysimi (Kalt.)

Qui presentiamo un protocollo per ottenere funghi entomopatogeni da una piralide forestale e un modo sostitutivo per valutare le loro attività entomopatogene utilizzando un insetto modello di Coleotteri. Questo metodo è efficiente e conveniente per esplorare le risorse fungine entomopatogene da insetti nocivi che perforano il legno nelle foreste naturali.

Isolamento, identificazione comportamentale e valutazione della patogenicità di funghi entomopatogeni da una piralide forestale

Lago di eutrofizzazione è un problema di qualità delle acque in tutto il mondo, rendendo la necessità di identificare e controllare le fonti di nutrienti critici. Determinazione Laboratorio di fosforo tassi di rilascio di carote di sedimento è un valido approccio per determinare il ruolo del fosforo carico interno e guidare le decisioni di gestione.

Laboratorio-determinato Fosforo Flux dal lago di sedimenti come misura di fosforo interno Loading

Qui, presentiamo un protocollo completo per valutare la disponibilità di nutrienti organici e inorganici e l'abbondanza e la struttura delle comunità microbiche e virali in ambienti marini remoti.

Svelare i giocatori invisibili del Mare - Una guida del campo di Acqua Chimica e microbiologia marina

Metodi dettagliati sono presentati per la produzione di biodiesel con il co-isolamento alkenones come coprodotti preziosi microalghe commerciale Isochrysis.

Protocollo sperimentale per produzione di biodiesel con isolamento di Alkenones come coprodotti da Commercial<em&gt; Isochrysis</em&gt; Biomassa algale

La valutazione di artropodi abbondanza in colture è fondamentale per studiare la dinamica delle popolazioni e le interazioni delle specie. Qui si descrive la modifica e l'applicazione di una foglia soffiatore-Vac per il campionamento di aspirazione degli artropodi in riso.

Modifica e applicazione di una Leaf Blower-Vac per Campo di campionamento di Artropodi

Scopri lo sviluppo di un micoinsetticida con Metarhizium anisopliae per il controllo biologico dei parassiti agricoli. Questo metodo include isolamento, screening e formulazione di ceppi fungini indigeni efficaci.

Sviluppo di

Esplora altri video