Le analisi delle cellule lignaggio e studi la funzione del gene Impiegando doppi loco MARCM
2 marzo 2017
Qui, presentiamo un protocollo per una tecnica di etichettatura mosaico che permette la visualizzazione dei neuroni derivati da una cellula progenitrice comune in due colori distinti. Questo facilita l'analisi lignaggio neurale con la capacità di singoli neuroni nascita aggiornamento e la funzione del gene studiando negli stessi neuroni di diversi individui.
L'obiettivo generale di questo protocollo MARCM a due punti è quello di condurre analisi del lignaggio cellulare ad alta risoluzione e migliori studi sulla funzione genica. Il tessuto cerebrale è composto da un vasto numero di neuroni diversi, è difficile studiare il meccanismo alla base del modo in cui i neuroni si assemblano durante lo sviluppo. Il vantaggio principale di questa tecnica è quello di etichettare i neuroni derivati da progenitori di neuroni comuni in due colori distinti.
Che permettono il recupero della nascita delle informazioni dei singoli neuroni. Pertanto, questa tecnica può aiutare i ricercatori a esplorare il meccanismo cellulare e molecolare alla base dello sviluppo neurale. A dimostrare la procedura oggi sarà Pei-Chi Chung.
Un tecnico del laboratorio del professor Yu. Inizia combinando maschi e femmine pronti per MARCM a due punti in una fiala di cibo per mosche con lievito fresco nella fiala. Mantieni le mosche MARCM ready a due punti gemelli incrociate a 25 gradi Celsius per due giorni per aumentare le possibilità di accoppiamento prima di raccogliere le uova fecondate.
Per evitare il sovraffollamento quando le larve si schiudono, picchiettare le mosche MARCM pronte a doppia macchia incrociate e trasferirle in fiale appena lievitate. Alleva la prole MARCM a doppia macchia, fino a quando non raggiunge lo stadio di sviluppo desiderato. Qui, le mosche allo stadio larvale saranno sottoposte a shock termico per indurre l'espressione della flippasi.
Trasferire le fiale di mosca in un bagnomaria a 37 gradi Celsius per 10, 20, 30, 40 e 50 minuti per determinare lo shock termico ottimale per l'espressione della flippasi. Generare i cloni MARCM a due punti di interesse. La tempistica dello shock termico determina la fase di generazione della rada, mentre il periodo dello shock termico definisce il numero di radure che verranno generate.
Alleva gli animali MARCM a due punti sottoposti a shock termico a 25 gradi Celsius, fino allo stadio di sviluppo desiderato. Quindi procedere alla colorazione e al montaggio. Aggiungi PBS alle piastre di protezione del forcipe.
E poi, trasferisci gli animali MARCM a doppia macchia nei piatti. Mentre guardi attraverso un microscopio da dissezione, usa una pinza per sezionare il cervello dagli animali MARCM a due punti. Per prima cosa, rimuovi la testa dal corpo della mosca.
Quindi rimuovere delicatamente la cuticola senza danneggiare il cervello. Quindi, rimuovere con cura le trachee che appaiono come fibre di colore bianco. Trasferire il cervello in una lastra di vetro, contenente il 4% di formaldeide e PBS.
E fissare a temperatura ambiente per 20 minuti. Inizia la procedura di colorazione sciacquando i cervelli del moscerino tre volte con l'1% di PBT. E poi lavaggio con l'1% di PBT tre volte.
Agitando per 30 minuti ogni volta. Incubare il cervello del moscerino con una miscela di anticorpi primari durante la notte a quattro gradi Celsius o per quattro ore a temperatura ambiente. Sciacquare e lavare i cervelli di mosca tre volte ciascuno con l'1% di PBT, agitando come prima.
Quindi incubare il cervello del moscerino con una miscela di anticorpi secondari per quattro ore a temperatura ambiente o durante la notte a quattro gradi Celsius. Dopo aver risciacquato e lavato il cervello come prima, montare il cervello su un microvetrino con un reagente anti-tempra. E poi posiziona un vetro di copertura per coprire e proteggere i cervelli delle mosche.
Sigillare i bordi del vetro di copertura micro e del microslide con smalto trasparente. Infine, acquisisci immagini fluorescenti di cloni MARCM a doppio punto dai campioni utilizzando il sistema di microscopia confocale preferito. Questa figura mostra i risultati del clone MARCM a doppia macchia, un neurone di proiezione olfattiva antero-dorsale VL2p derivato dall'induzione della flippasi.
Per mediare la ricombinazione mitotica nel neuroblasto adPN allo stadio embrionale. Questo primo diagramma mostra il modello di neurogenesi. In questa immagine al microscopio confocale del cervello, gli adPN VL2p sono mostrati in verde e sono associati agli adPN neuroblastici multicellulari in magenta.
Questa immagine mostra le cellule nel corno laterale. Qui si vede la morfologia neuronale del lobo antennale. Nell'immagine vengono mostrati i dati per gli adPN DL1.
Come illustrato di seguito, gli adPN DL1 vengono visualizzati più tardi nello sviluppo rispetto agli adPN VL2p. L'induzione di cloni MARCM a due punti di adPN DC3 dimostra che questo tipo neuronale appare più tardi nello sviluppo. Questa immagine mostra che l'evento MARCM a doppia macchia si verifica in un neurone GAL4 negativo all'interno della linea adPN.
Una volta padroneggiata, questa tecnica può aiutare i ricercatori ad analizzare il lignaggio neurale e fornire diversi marcatori per distinguere i neuroni dal clone dei neuroblasti. Inoltre, il MARCM a doppio punto può produrre cloni mutanti omozigoti per esplorare i meccanismi molecolari. In un background genetico eterozigote.
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Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo MARCM a doppia macchia progettato per analisi del lignaggio cellulare ad alta risoluzione e studi sulla funzione genica nei neuroni. Etichettando i neuroni da cellule progenitrici comuni in due colori distinti, i ricercatori possono tracciare efficacemente lo sviluppo e la data di nascita dei singoli neuroni.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Neuroscienza
- Biologia cellulare
- Biologia dello sviluppo
Sfondo
- Il tessuto cerebrale è costituito da una vasta gamma di neuroni.
- Comprendere l'assemblaggio dei neuroni durante lo sviluppo è complesso.
- Le tecniche attuali potrebbero non fornire una risoluzione sufficiente per il tracciamento del lignaggio.
- Questo protocollo mira ad affrontare queste sfide.
Obiettivo dello studio
- Condurre analisi dettagliate del lignaggio cellulare.
- Migliorare gli studi sulla funzione genica nei neuroni.
- Facilitare l'esplorazione dei meccanismi cellulari e molecolari nello sviluppo neurale.
Metodi utilizzati
- Protocollo MARCM a doppia macchia per l'etichettatura dei neuroni.
- Utilizzo di marcatori di colore distinti per il tracciamento del lignaggio.
- Tecniche di imaging ad alta risoluzione.
- Analisi dello sviluppo neuronale e della funzione genica.
Principali risultati
- Etichettatura riuscita di neuroni da progenitrici comuni.
- Capacità di recuperare informazioni sulla nascita di singoli neuroni.
- Comprensioni migliorate del lignaggio neurale e dello sviluppo.
- Potenziali applicazioni nello studio della funzione genica in individui diversi.
Conclusioni
- Il protocollo MARCM a doppia macchia è uno strumento prezioso per la ricerca in neuroscienza.
- Consente un'analisi dettagliata del lignaggio neuronale e della funzione genica.
- Questa tecnica può far progredire significativamente la nostra comprensione dello sviluppo neurale.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Understanding neural lineage and gene function in model organisms provides foundational insights for target validation in neurotherapeutic development. The twin-spot MARCM technique enables high-resolution mapping of neuronal birth order and phenotypic analysis of genetically identical neurons across individuals, supporting mechanistic de-risking in early discovery. This approach enhances predictive confidence by linking developmental mechanisms to functional outcomes in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by tracing neuronal lineage from common progenitors to assess gene function in defined cell populations.
- Operational Value: Facilitates biological de-risking through phenotypic analysis of homozygous mutant clones in heterozygous backgrounds, reducing mechanistic ambiguity.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by providing quantitative lineage data that correlates with neurodevelopmental disease mechanisms.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces validated, color-coded neuronal systems suitable for downstream compound screening in disease-relevant neural circuits.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility via inducible, stage-specific clonal generation controlled by heat shock duration.
- Scalability: Enables platform reuse across multiple neuronal subtypes (e.g., adPN lineages) for comparative phenotypic screening.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Supports disease-relevant system modeling by enabling birth-order analysis of neurons implicated in neurodevelopmental disorders.
- Mechanistic De-risking: Allows phenotypic analysis of identical neurons across animals to distinguish genetic from stochastic variability in gene function studies.
- Preclinical Continuity: Bridges discovery and validation by providing lineage-resolved data for target engagement and pathway modulation studies.
Pipeline & Workflow Integration
The twin-spot MARCM method integrates into the discovery continuum from early target validation through preclinical mechanistic studies, particularly for neurodevelopmental indications where neuronal origin and connectivity are critical.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by linking gene perturbation to lineage-specific neuronal phenotypes.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible neuronal preparations with quantitative outputs based on clonal birth timing and marker expression.
- Analytics: Enables comparative analysis of neuronal morphology and gene expression across developmental stages using dual-color readouts.
- Translational Research: Connects to preclinical validation by providing lineage-aligned models for biomarker-aligned target modulation.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for generating standardized neuronal cohorts across projects and model systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing lineage-related confounding in gene function studies.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through controlled clonal induction and standardized staining/mounting protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of lineage-specific phenotypic effects, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by providing mechanistic clarity on neuronal targets in heterogeneous tissues.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila genetics, clonal labeling techniques, and confocal microscopy for accurate lineage interpretation.
- Dependent on instrumentation including heat shock apparatus, dissection microscopes, and confocal imaging systems for clonal induction and visualization.
- Necessitates cross-team standardization of heat shock timing, staining protocols, and imaging parameters to ensure clonal consistency across users.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different neuronal lineages or developmental stages beyond the adPN model shown.
- Includes practical limitations such as clonal efficiency dependence on heat shock duration and the need for optimization per target lineage, as noted in the protocol.
