Name: Lisolamento e arricchimento di fegato progenitrici sottoinsiemi identificati da un marcatore combinazione romanzo di superficie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Scopri come isolare e arricchire sottopopolazioni di progenitori epatici da fegato di topo mediante citometria a flusso e un cocktail di marcatori di superficie innovativo. Questo protocollo garantisce elevata purezza e vitalità cellulare per analisi in vitro.

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione Alexander von Humboldt Sofja Kovalevskaja premio per VLK.

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<li>Sidney, L. E., McIntosh, O. D., Hopkinson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+Change+and+Induction+of+Cytokeratin+Expression+During+In+Vitro+Culture+of+Corneal+Stromal+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Phenotypic Change and Induction of Cytokeratin Expression During In Vitro Culture of Corneal Stromal Cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (12), 7225-7235 (2015).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.

Infiammazione del fegato e lesioni di diversa origine innescano processi rigenerativi del fegato che sono accompagnati da espansione di cellule progenitrici e l&#39;attivazione 2, 3. Queste cellule progenitrici epatiche possiedono staminali caratteristiche cellulari e probabilmente svolgono un ruolo significativo nel meccanismo patogenetico di varie malattie del fegato. L&#39;eterogeneità delle cellule progenitrici epatiche è stato a...

la rigenerazione del fegato è principalmente associato con la capacità di auto-rinnovamento degli epatociti. Tuttavia, le lesioni croniche del fegato si verificano con l&#39;attivazione delle cellule progenitrici e di espansione, che sono stati associati con la loro capacità di differenziarsi in epatociti e colangiociti 1, 2, 3, 4. Questo è particolarmente rilevante in quanto, durante lesioni croniche, epatociti proliferazione non è efficace. Nonostante diversi studi di tracciabilità genetica di targeting cellule progenitrici, il loro ruolo nella rigenerazione del fegato rimane controverso 5, 6, 7, 8. Inoltre, l&#39;attivazione delle cellule progenitrici è stato collegato ad un aumento della risposta fibrotica nel fegato, che solleva domande sul loro ruolo esatto durante lesioni 9, 10. La natura eterogenea del compartimento di cellule progenitrici è stato a lungo suggerito da studi di espressione genica che isolate cellule progenitrici che esprimono un unico marcatore di superficie utilizzando microdissezione o cella metodi basati su di smistamento 1, 11. Infatti, di recente, una nuova combinazione marcatore superficie con gp38 (podoplanin) inequivocabilmente legata precedenti marcatori singoli di cellule progenitrici di vari sottoinsiemi 12. È importante sottolineare che questi sottoinsiemi non solo differivano nella loro espressione marcatore di superficie, ma anche esposte le alterazioni funzionali durante ferite 12. Molteplici modelli animali sono stati utilizzati per studiare l&#39;attivazione delle cellule progenitrici e la rigenerazione del fegato. Sembra che i vari tipi di lesioni promuovere l&#39;attivazione di diversi sottoinsiemi di cellule progenitrici 12. Questo potrebbe spiegare il phdivergenza enotypic della reazione duttulare osservato negli esseri umani 4. Così, i complessi fenotipiche e funzionali analisi di cellule progenitrici sono fondamentali per comprendere il loro ruolo nella infortuni e il vero significato della reazione duttulare in malattie del fegato. Oltre combinazioni marcatore di superficie, le differenze cruciali nei protocolli isolamento delle cellule complicano ulteriormente le conclusioni sulla base di studi precedenti 2. Una notevole quantità di studi affrontato il ruolo delle cellule progenitrici che notevolmente differiscono per il protocollo di isolamento (ad esempio, dissociazione fegato (combinazione enzima e durata del processo), media densità, e la velocità di centrifugazione) 2. Una tecnica di isolamento ottimizzato, fornendo una migliore sopravvivenza per le popolazioni di cellule rare e riflessivo della composizione sottoinsieme, è stato sviluppato e pubblicato di recente 12. Lo scopo di questo articolo è di fornire una più detprotocollo soffriva esattamente di questa procedura di isolamento delle cellule del fegato e il sottoinsieme di analisi per consentire la corretta riproduzione della tecnica. Inoltre, il protocollo include un confronto con il metodo di isolamento precedente per dimostrare le differenze rispetto al nuovo protocollo.

<table><tbody><tr><td>RPMI</td><td>Life Technologies</td><td>21875-034</td><td></td></tr><tr><td>senza rosso fenolo DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>31053-028</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi P</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11249002001</td><td></td></tr><tr><td>DNAse-I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td>17105041</tr><tr><td>ACK Lysing Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>A10492-01</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14025-050</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Sodio azide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td>Preparare una soluzione madre all'1</td></tr><tr><td>% 10% BSA</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-376</td><td></td></tr><tr><td>autoMACS Soluzione di risciacquo</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td>aggiungere lo 0,5% (v/v) BSA e conservare in ghiaccio</td></tr><tr><td>DMEM privo di rosso fenolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1145</td><td></td></tr><tr><td>conteggio delle perle Bright</td><td>Life Technologies</td><td>C36950</td><td></td></tr><tr><td>PI</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-233</td><td></td></tr><tr><td>Reagente bloccante FcR</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-575</td><td></td></tr><tr><td>Microsfere anti-CD31</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-418</td><td></td></tr><tr><td>Microsfere anti-CD45</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-052-301</td><td></td></tr><tr><td>Kit di rimozione delle cellule morte</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-101</td><td></td></tr><tr><td>Microsfere anti-biotina</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-485</td><td></td></tr><tr><td>CD64 BioLegend purificato</td><td></td><td>139302</td><td>Diluizione: 1:100</td></tr><tr><td>CD16/32 </td><td>BioLegend</td><td>purificato 101302</td><td>Diluizione: 1:100</td></tr><tr><td>CD45 APC/Cy7</td><td>BioLegend</td><td>103116</td><td>Diluizione: 1:200, marcatura delle cellule ematopoietiche</td></tr><tr><td>CD31 Biotina</td><td></td><td>BioLegend 102504</td><td>Diluizione: 1:200, marcatura delle cellule endoteliali</td></tr><tr><td>ASGPR1 Bio-Techne purificato</td><td></td><td>AF2755-SP</td><td>Diluizione: 1:100, marcatura degli epatociti</td></tr><tr><td>Podoplanina APC BioLegend</td><td></td><td>127410</td><td>Diluizione: 1:1.400, marchia le cellule progenie</td></tr><tr><td>Podoplanina Biotina BioLegend</td><td></td><td>127404</td><td>Diluizione: 1:1.400</td></tr><tr><td>CD133 PE</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-102-210</td><td>uso 3 &; L, marchia le cellule progenitrici</td></tr><tr><td>CD133</td><td>Biotina</td><td>BioLegend 141206</td><td>Diluizione: 1:100</td></tr><tr><td>CD34 Biotina</td><td>eBioScience</td><td>13-0341-81</td><td>Diluizione: 1:100</td></tr><tr><td>CD90.2 Pacific Blue</td><td>BioLegend</td><td>140306</td><td>Diluizione: 1:800</td></tr><tr><td>CD157 PE</td><td>BioLegend</td><td>140203</td><td>Diluizione: 1:600</td></tr><tr><td>EpCAM Brilliant Violet 421</td><td>BioLegend</td><td>118225</td><td>Diluizione: 1:100</td></tr><tr><td>Sca-1 Biotina</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-101-885</td><td>uso 10 &micro; L</td></tr><tr><td>IgG2b del topo, &kappa; PE</td><td>BioLegend</td><td>400311</td><td></td></tr><tr><td>IgG1 di ratto PE</td><td>BioLegend</td><td>400407</td><td></td></tr><tr><td>IgG2b di ratto, &kappa; APC/Cy7</td><td>BioLegend</td><td>400624</td><td></td></tr><tr><td>IgG2a di ratto, &kappa; Biotina</td><td>BioLegend</td><td>400504</td><td></td></tr><tr><td>IgG2a di ratto, &kappa; Brilliant Violet 421</td><td>BioLegend</td><td>400535</td><td></td></tr><tr><td>Criceto Siriano IgG APC</td><td>BioLegend</td><td>402012</td><td></td></tr><tr><td>Criceto Siriano IgG Biotina</td><td>BioLegend</td><td>402004</td><td></td></tr><tr><td>Normale Controllo IgG di Capra Purificato</td><td>Bio-Techne</td><td>AB-108-C</td><td></td></tr><tr><td>Asino anti-Capra IgG Alexa Fluor 488</td><td>Life Technologies</td><td>A11055</td><td>Diluizione: 1:800</td></tr><tr><td>Streptavidina Alexa Fluor 405</td><td>Life Technologies</td><td>S32351</td><td>Diluizione: 1:400</td></tr><tr><td>100 &; m Rete filtrante</td><td>A. Hartenstein</td><td>PAS3</td><td></td></tr><tr><td>LS Colonna</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Separatore QuadroMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>Analizzatore MACSQuant 10</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-343</td><td></td></tr><tr><td>Separatore AutoMACS Pro</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-545</td><td></td></tr><tr><td>FACS AriaTMIII</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACSDiva sofware</td><td>BD Biosciences</td> Polipropilene Tubo a fondo tondo Falcon 352063 Rneasy plus mini kit Qiagen 74134 RLT tampone <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>di lisi è incluso</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

l&#39;isolamento e arricchimento di fegato progenitrici sottoinsiemi identificati da un marcatore combinazione romanzo di superficie

Isolation and Enrichment of Liver Progenitor Subsets Identified by a Novel Surface Marker Combination

Durante lesioni croniche del fegato, cellule progenitrici espandono in un processo chiamato reazione duttulare, che comporta anche la comparsa di infiltrato cellulare infiammatorio e l&#39;attivazione delle cellule epiteliali. La popolazione di cellule progenitrici durante tali reazioni infiammatorie è stato per lo più studiata utilizzando marcatori di superficie singoli, sia per l&#39;analisi istologica o con tecniche di citometria a base di flusso. Tuttavia, nuovi marcatori di superficie identificati vari sottoinsiemi funzionalmente distinte all&#39;interno del progenitore di fegato / stelo vano cella. Il metodo presentato qui descrive l&#39;isolamento e il flusso dettagliata analisi di citometria di sottoinsiemi progenitrici utilizzando combinazioni marcatori romanzo di superficie. Inoltre, dimostra come i vari sottogruppi di cellule progenitrici possono essere isolati con metodi di elevata purezza con modalità automatizzate magnetico e FACS ordinamento-based. Importante, novel ed enzimatica semplificato dissociazione del fegato consente l&#39;isolamento di queste popolazioni cellulari rare con un&#39;alta redditivitàche è superiore rispetto ad altri metodi esistenti. Questo è particolarmente rilevante per studiare ulteriormente cellule progenitrici in vitro o per isolare l&#39;RNA di alta qualità per analizzare il profilo di espressione genica.

La procedura qui presentata per la digestione del fegato utilizzando una nuova miscela di enzimi risultati in una cella singola sospensione contenente parenchimali e le cellule epatiche non parenchimali (Figure 1 e 2a). Dopo l&#39;ACK-lisi dei globuli rossi, il flusso diretto analisi di citometria di cella singola sospensione è possibile (figure 1 e 2). La strategia di gating comporta l&#39;esclusione di doppietti e cell...

lesioni al fegato sono accompagnate da espansione di cellule progenitrici che rappresenta una popolazione cellulare eterogenea. Classificazione Novel di questo compartimento cellulare consente di distintivo più sottoinsiemi. Il metodo qui descritto illustra l&#39;analisi citofluorimetrica ed elevato isolamento purezza vari sottogruppi che possono essere utilizzati per ulteriori analisi.

L&#39;isolamento e arricchimento di fegato progenitrici sottoinsiemi identificati da un marcatore combinazione romanzo di superficie

During chronic liver injuries, progenitor cells expand in a process called ductular reaction, which also entails the appearance of inflammatory cellular ...

Gli obiettivi generali di questo protocollo di digestione epatica sono valutare i diversi sottoinsiemi di progenitori epatici mediante citometria a flusso e isolare queste cellule con elevata purezza utilizzando un nuovo cocktail di marcatori di superficie per ulteriori analisi successive. Questo metodo può aiutare a rispondere a diverse domande sulla biologia delle cellule progenitrici epatiche, ad esempio quali sono le caratteristiche specifiche dei sottoinsiemi e quali sono le loro funzioni durante il danno epatico. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente l'isolamento di cellule progenitrici con elevata purezza e vitalità, aspetto fondamentale per l'analisi in vitro.Sebbene questa tecnica di digestione fornisca informazioni sulla biologia delle cellule progenitrici, può effettivamente essere utilizzata per l'isolamento di popolazioni di cellule ematopoietiche e endoteliali. Per preparare una sospensione di singole cellule da un fegato di topo, trasferire i lobi su una piastra di Petri asciutta e utilizzare un bisturi per tagliare i tessuti in cubi omogenei di circa due millimetri cubi. Trasferire i pezzi in due tubi conici da 15 millilitri per fegato, contenenti

isolation-enrichment-liver-progenitor-subsets-identified-novel

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Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Qui si descrive l'isolamento delle cellule epatiche che esprimono CD133 staminali e le cellule staminali del cancro al fegato da tutto murini, un processo che richiede la digestione dei tessuti, delle cellule di arricchimento, l'isolamento e la citometria a flusso. Ci sono metodi avanzati per l'isolamento singola cellula e l'espansione clonale.

Isolamento di cellule CD133 + staminali del fegato per l&#39;espansione clonale

Un metodo per analizzare la distribuzione di progenitori midollari ematopoietiche citometria di flusso e per isolare in modo efficiente altamente purificate cellule staminali ematopoietiche (CSE) è descritto. La procedura di isolamento è essenzialmente basata su un arricchimento magnetico di c-kit + e le cellule di separazione delle cellule per purificare CSE per studi cellulari e molecolari.

L&#39;analisi fenotipica e l&#39;isolamento di murini cellule staminali ematopoietiche e Lineage-committed progenitori

Viene descritta una tecnica per isolare epatociti umani e cellule epatiche non parenchimali dallo stesso donatore. I diversi tipi di cellule epatiche costituiscono la base per i modelli funzionali di fegato e l'ingegneria tissutale. Questo nuovo metodo mira a isolare le cellule epatiche in un'elevata resa e vitalità.

Protocollo per l&#39;isolamento di epatociti umani primari e corrispondenti principali popolazioni di cellule del fegato non-parenchimali

Dimostriamo come identificare e isolare 6 sottoinsiemi dei progenitori mieloidi dal midollo osseo murino utilizzando una combinazione di magnetico e fluorescenza ordinamento (MACS e FACS). Questo protocollo può essere usato per analisi di RNA/proteine, in vivo gli esperimenti di trasferimento adottivo e saggi di cultura in vitro (colture di metilcellulosa o liquido).

Identificazione e isolamento di Oligopotent e dei progenitori mieloidi Lineage-commesso dal midollo osseo del topo

Questo protocollo descrive in dettaglio un metodo monostrato e privo di siero-per generare in modo efficiente cellule simili a epatociti da cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) in 18 giorni. Ciò comporta sei passaggi in quanto gli hPSC si differenziano in sequenza in tipi di cellule intermedie come la striscia primitiva, l'endoderma definitivo, il foregut posteriore e i progenitori del germoglio epatico prima di formare cellule simili a epatociti.

Differenziazione efficiente delle cellule staminali pluripotenti umane nelle cellule del fegato

L'obiettivo di questo articolo è quello di fornire un approccio standardizzato per indurre la differenziazione del progenitore epatico umano dalle cellule staminali pluripotenti. Lo sviluppo di questa procedura con formulazioni di media pronti all'uso offre all'utente un sistema facile per generare cellule epatiche umane per la ricerca e la traduzione biomedica.

Specifica del progenitore epatico da cellule staminali pluripotenti utilizzando un sistema di differenziazione definito

Questo articolo fornisce una metodologia dettagliata per la dissociazione dei tessuti e gli approcci di frazionamento cellulare che consentono l'arricchimento di cellule epiteliali vitali dalle regioni prossimali e distali del polmone umano. Qui questi approcci sono applicati per l'analisi funzionale di cellule progenitrici epiteliali polmonari attraverso l'uso di modelli di coltura di organoidi 3D.

Isolamento e arricchimento di cellule progenitrici epiteliali polmonari umane per la coltura di organoidi

Qui delineiamo e dimostriamo un protocollo per l'isolamento primario delle cellule endoteliali sinusoidali epatiche del topo (LSEC). Il protocollo si basa sulla perfusione di collagenasi epatica, sulla purificazione delle cellule non parenchimali mediante centrifugazione a bassa velocità e sulla selezione magnetica delle perline CD146. Abbiamo anche fenotipo e caratterizzato questi LSECs isolati utilizzando la citometria a flusso e la microscopia elettronica a scansione.

Isolamento e caratterizzazione di cellule endoteliali sinusoidali primarie del fegato di topo

Gli epatociti carichi di lipidi sono inerenti alla rigenerazione del fegato, ma di solito vengono persi con la centrifugazione a gradiente di densità. Qui, presentiamo un protocollo di isolamento cellulare ottimizzato che mantiene gli epatociti steatosici, producendo popolazioni rappresentative di epatociti rigeneranti dopo epatectomia parziale nei topi.

Isolamento di epatociti rigeneranti dopo epatectomia parziale nei topi

Qui presentiamo un metodo non genetico per generare sferoidi epatici autologhi umani usando cellule mononucleate isolate dal sangue periferico allo stato stazionario.

Sferoidi epatici umani da sangue periferico per studi sulle malattie del fegato

Gli epatociti derivati da cellule staminali pluripotenti possono essere purificati attraverso la selezione cellulare, utilizzando una combinazione di colorazione con molecole di adesione alle cellule mitocondriali e leucocitarie attivate (ALCAM, nota anche come CD166).

Applicazione della colorazione dei mitocondri vivi nella selezione cellulare per purificare gli epatociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane

Scopri come isolare e arricchire sottopopolazioni di progenitori epatici da fegato di topo mediante citometria a flusso e un cocktail di marcatori di superficie innovativo. Questo protocollo garantisce elevata purezza e vitalità cellulare per analisi in vitro.

L'isolamento e arricchimento di fegato progenitrici sottoinsiemi identificati da un marcatore combinazione romanzo di superficie

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