L'isolamento e arricchimento di fegato progenitrici sottoinsiemi identificati da un marcatore combinazione romanzo di superficie

Gli obiettivi generali di questo protocollo di digestione epatica sono valutare i vari sottogruppi di progenitori epatici mediante citometria a flusso e isolare queste cellule ad alta purezza utilizzando un nuovo cocktail di marcatori di superficie per ulteriori analisi a valle. Questo metodo può aiutare a rispondere a varie domande sulla biologia delle cellule progenitrici del fegato, ad esempio, quali sono le caratteristiche specifiche del loro sottoinsieme e quali sono le loro cause distanti durante il danno epatico. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente l'isolamento delle cellule progenitrici per un'elevata purezza e vitalità, che è importante per l'analisi in vitro.

Sebbene questa tecnica di digestione fornisca informazioni sulla biologia delle cellule progenitrici, può effettivamente essere utilizzata per l'isolamento di popolazioni di cellule ematopoietiche ed endoteliali. Per preparare una preparazione a singola cellula da un fegato di topo, trasferire i lobi su una capsula di Petri essiccata e utilizzare un bisturi per tagliare i tessuti in cubi omogenei di circa due millimetri cubi. Trasferisci i pezzi in due provette da centrifuga coniche da 15 millilitri per fegato contenenti 2,5 millilitri di tampone digestivo ciascuna.

E posizionare i campioni in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius con agitazione delicata a cinque e 10 minuti. Dopo 15 minuti di digestione, utilizzare una pipetta da 1.000 microlitri con una punta tagliata per titolare delicatamente i pezzi di fegato. Quindi rimetti i tubi nella vasca da bagno e lascia che i pezzi si depositino per due minuti.

Successivamente, filtrare due aliquote da circa 700 microlitri del surnatante attraverso un filtro da 100 micron pre-bagnato con 800 microlitri di tampone di raccolta. E sostituire il surnatante rimosso con un tampone di digestione fresco. Quando il tessuto epatico non è più visibile, far passare tutto il surnatante dai tubi di digestione attraverso il filtro.

E raccogliere tutte le cellule mediante centrifugazione. Risospendere i pellet in un millilitro di tampone di lisi di potassio cloruro di ammonio a temperatura ambiente, interrompendo la lisi con cinque millilitri di tampone di raccolta fresco dopo un minuto. Raccogliere le cellule con un'altra centrifugazione.

Quindi, aspirare accuratamente il surnatante senza disturbare il pellet sciolto. E risospendere le cellule in quattro millilitri di tampone di raccolta fresco su ghiaccio. Per determinare il numero di cellule del campione di fegato mediante citometria a flusso, in primo luogo, mescolare 20 microlitri di sospensione di cellule epatiche con 174 microlitri di PBS in una provetta di polistirene da 1,5 millilitri e sei microlitri di iodio propidio.

Aggiungere le microsfere di conteggio che consentono la quantificazione delle cellule e caricare la miscela di microsfere e cellule sul citometro a flusso. Gate sul lato di dispersione tramite parametri di dispersione in avanti per evitare detriti. Escludendo i doppietti tramite un'altezza di diffusione in avanti rispetto al gate dell'area di diffusione in avanti e le cellule morte positive allo iodio propidio.

Quindi, caricare un campione da 30 microlitri sul citometro a flusso e registrare gli eventi. Per colorare le cellule epatiche per l'analisi citofluorimetrica dei sottogruppi progenitori, trasferire 2x10^5 aliquote delle cellule in provette di reazione da 1,5 millilitri. E pellettare le celle mediante centrifugazione.

Risospendere i pellet nel blocco Fc per cinque minuti di incubazione su ghiaccio. Quindi aggiungere 50 microlitri del cocktail di anticorpi di interesse per la colorazione della superficie cellulare nelle provette appropriate per un'incubazione di 20 minuti su ghiaccio al riparo dalla luce. Al termine dell'incubazione, lavare i campioni in 400 microlitri di tampone di colorazione per campione.

E risospendere i pellet in 100 microlitri dell'appropriato cocktail di anticorpi secondari per 20 minuti su ghiaccio al riparo dalla luce. Quindi lavare le cellule con altri 400 microlitri di tampone colorante. E risospendere i pellet in 300 microlitri di tampone colorante contenente ioduro di propidio.

Misurare il campione utilizzando un citometro a flusso. Per arricchire la popolazione di cellule progenitrici mediante separazione basata su microsfere magnetiche, trasferire 1,5-2x10^6 cellule nel numero appropriato di provette coniche da 15 millilitri e raccogliere le cellule mediante centrifugazione. Risospendere i pellet in 400 microlitri di HBSS integrato con BSA.

E aggiungi 40 microlitri di microsfere anti-CD31 e 30 microlitri di microsfere anti-CD45 per un'incubazione di 15 minuti a quattro gradi Celsius. Successivamente, lavare le celle in cinque millilitri di HBSS più BSA. E risospendere i pellet in 100 microlitri di perle di rimozione delle cellule morte per un'incubazione di 15 minuti a temperatura ambiente.

Mentre le cellule sono in incubazione, equilibrare una colonna di selezione positiva di dimensioni adeguate per fegato con tre millilitri di HBSS più BSA. Quindi aggiungere 900 microlitri di HBSS plus BSA alle celle e filtrare le cellule attraverso una rete filtrante in poliammide da 100 micron. Caricare le cellule filtrate incubate a microsfere sulle colonne che raccolgono l'eluato nella provetta da centrifuga.

Quando tutte le cellule sono fluite attraverso la colonna, lavare le colonne tre volte con tre millilitri di HBSS più BSA. Pellettare le celle per centrifugazione e risospendere il pellet della cella in 100 microlitri di tampone di risciacquo e blocco Fc. Estrarre i pellet cellulari da quattro a sei fegati o fino a meno di 1x10^6 cellule selezionate negativamente.

Dopo cinque minuti, etichettare le cellule con l'anticorpo biotinilato anti-GP38 per 10 minuti su ghiaccio. Al termine dell'incubazione, raccogliere le cellule mediante centrifugazione per risospensione in 400 microlitri di tampone di risciacquo e cinque microlitri di microsfere Anti-Biotina. Dopo 15 minuti a quattro gradi Celsius, lavare immediatamente le celle in cinque millilitri di tampone di risciacquo.

E risospendere il pellet in un millilitro di tampone di risciacquo fresco. Posizionare le celle risospese su un rack da 15 cm refrigerato e avviare la separazione magnetica automatica. Quindi centrifugare il flusso continuo e risospendere i pellet nella soluzione appropriata per l'analisi sperimentale a valle pianificata.

Il gating sulle cellule che sono negative per CD45, CD31 e asialoglicoproteina un recettore seleziona per le cellule progenitrici del fegato che possono quindi essere raggruppate in base alla loro espressione di glicoproteina 38 e CD133. Le cellule gp38 positive CD133 positive e le cellule gp38 negative CD133 positive rappresentano le popolazioni cellulari più abbondanti tra le cellule CD45 negative CD31 negative ASGPR1 nel fegato di topo adulto sano con apparenti differenze nella loro espressione di vari marcatori di superficie precedentemente associati alle cellule progenitrici. L'isolamento di queste cellule progenitrici basato su microsfere magnetiche, come appena dimostrato, si traduce in una purezza superiore al 90% delle cellule epatiche con un alto grado di vitalità.

Quando si tenta di isolare queste cellule non comuni, è importante prendere in considerazione gli enzimi utilizzati durante le fasi di digestione del fegato, poiché enzimi diversi possono produrre preferenzialmente specifiche sottopopolazioni progenitrici e ridurre notevolmente i livelli di espressione di CD133. È importante ricordare che la purezza e la resa cellulare dipendono dalla preparazione delicata delle sospensioni monocellulari del fegato. E che l'elevata quantità di detriti cellulari e la contaminazione cellulare morente possono influire negativamente sul successo di questo protocollo.