Fabbricazione di dispositivi microfluidici basati su carta tridimensionale per gli immunodosaggi

L'obiettivo generale di questo protocollo è dimostrare il nostro processo di fabbricazione di dispositivi tridimensionali basati su carta, che utilizziamo come piattaforma per sviluppare saggi immunologici point of care. Questo metodo fornisce una piattaforma microfluidica basata su carta con un processo di produzione affidabile, in modo tale che il tempo e gli sforzi possano essere indirizzati allo sviluppo di saggi anziché alla progettazione di dispositivi. Il vantaggio principale della nostra tecnica è che consente di preparare molti dispositivi in parallelo e in una quantità desiderabile per i progetti di ricerca accademica.

In generale, i nuovi utenti avranno difficoltà con questo metodo perché ci sono molte variabili da considerare quando si fabbricano dispositivi, come il corretto allineamento degli strati. Gli errori possono causare il malfunzionamento dei dispositivi. Una dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale perché l'assemblaggio può essere difficile da immaginare utilizzando solo i dettagli forniti nei manoscritti.

Innanzitutto, prepara strati di carta da filtro qualitativa tagliando un foglio di carta in un formato carta standard per facilitare la creazione di modelli utilizzando una stampante a cera. Caricare un foglio di carta singolo nel vassoio della stampante. Quindi stampa i livelli precedentemente progettati.

Quindi, taglia una fila di una membrana di nylon in fogli usando un tagliacarte da tavolo, prestando molta attenzione nel maneggiare la membrana di nylon per mantenerne l'integrità e proteggerla dallo strappo. Conservare il materiale inutilizzato in un armadio essiccatore, poiché le membrane in nylon sono sensibili all'umidità. Utilizzando una stampante a cera, stampa un modello di strato di cattura su un pezzo di carta da copia e fissalo con del nastro adesivo a una scatola luminosa che funga da guida per il posizionamento della membrana di nylon.

Successivamente, posizionare un foglio di carta da copia pulito sul foglio di carta da copia precedentemente stampato. Fissare il foglio di carta pulito alla scatola luminosa, ma non fissare i due fogli insieme. Ora, posiziona un foglio tagliato di membrana di nylon sul foglio pulito di carta da copia, assicurandoti che la membrana copra l'area stampata dello strato inferiore di carta da copia.

Fissare con nastro adesivo tutti e quattro i lati della membrana di nylon al foglio di carta da copia. Caricare un foglio di membrana di nylon supportato dalla carta da copia ad esso applicata nel vassoio della stampante ad alimentazione manuale. Quindi stampa un foglio di membrana di nylon alla volta.

Fissare gli strati stampati su una cornice acrilica per un riscaldamento uniforme sopra e sotto lo strato quando viene posizionato in un forno a convezione a gravità. Ora, mettete gli strati in forno a 150 gradi Celsius per 30 secondi fino a quando la cera non si scioglie nello spessore della carta. Dopo aver tolto la carta dal forno, verificare che la cera abbia permeato lo spessore della carta capovolgendola e verificando la presenza di imperfezioni nel disegno.

Rimuovere la carta e la membrana di nylon dalla cornice in acrilico. Quindi rimuovere la membrana di nylon dal foglio di supporto della carta da copia utilizzando un tagliacarte. Modellate fogli bifacciali di pellicole adesive utilizzando un plotter a coltelli robotizzato con file di progettazione precedentemente preparati.

Successivamente, fissa uno strato di carta con motivo adesivo su una scatola luminosa con il lato stampato rivolto verso il basso. Staccare un lato del rivestimento protettivo dal foglio di adesivo del modello. Premere insieme il foglio di adesivo e lo strato di carta.

Quindi posizionare il dispositivo parzialmente assemblato in una custodia protettiva. Successivamente, passare l'assemblaggio a due strati risultante attraverso una plastificatrice automatizzata per premere completamente insieme l'adesivo e la carta, rimuovendo eventuali sacche d'aria dagli strati adiacenti. Fissare uno strato coniugato su un telaio acrilico in modo che la zona idrofila da trattare sia sospesa e non a contatto con il telaio.

Aggiungere 2,5 microlitri di BSA e un X PBS alla zona idrofila sullo strato coniugato. Dopo aver lasciato asciugare il campione a temperatura ambiente per due minuti, asciugarlo a 65 gradi Celsius per cinque minuti. Successivamente, aggiungere cinque microlitri di nanoparticelle di oro colloidale a cinque OD coniugate all'anticorpo anti-beta hCG, quindi ripetere il processo di essiccazione.

Fissare uno strato di canale laterale su un telaio acrilico in modo che la zona idrofila da trattare sia sospesa e non a contatto con il telaio. Aggiungere 10 microlitri di agente bloccante per trattare il canale laterale, quindi ripetere lo stesso processo di essiccazione utilizzato per lo strato coniugato. Successivamente, fissare uno strato di cattura su un telaio acrilico in modo che la zona idrofila da trattare sia sospesa e non a contatto con il telaio.

Trattare lo strato di cattura con cinque microlitri di anticorpo anti-alfa hCG. Dopo aver lasciato asciugare il campione a temperatura ambiente per due minuti, asciugarlo a 65 gradi Celsius per otto minuti. Aggiungere due microlitri di agente bloccante, quindi ripetere lo stesso processo di essiccazione utilizzato per lo strato di cattura.

Fissare lo strato di lavaggio alla scatola luminosa con il lato stampato rivolto verso l'alto. Se si utilizzano fori di allineamento, rimuoverli dagli strati successivi utilizzando uno strumento di perforazione portatile. Rimuovere la pellicola protettiva sul retro dello strato di cattura per esporre l'adesivo.

Allineare lo strato di cattura sopra lo strato di lavaggio utilizzando i fori di allineamento come guida, quindi premere i due strati insieme ed evitare di toccare le zone idrofile per ridurre al minimo la contaminazione o i danni al dispositivo. Successivamente, rimuovere la pellicola protettiva sul retro dello strato di incubazione per esporre l'adesivo. Allineare lo strato di incubazione sopra lo strato di cattura e premerli insieme.

Continuate ad aggiungere i livelli in questo modo fino a quando tutti i livelli attivi non sono stati assemblati. A questo punto, posizionare il dispositivo parzialmente assemblato in una guida protettiva e fissare saldamente gli strati insieme utilizzando una plastificatrice. Rimuovere la pellicola protettiva sul retro dello strato di lavaggio e applicare lo strato di macchia sul fondo del dispositivo.

Dopo la laminazione per completare l'assemblaggio del dispositivo microfluidico tridimensionale a base di carta, tagliare il numero desiderato di dispositivi da fogli di dispositivi completamente assemblati utilizzando le forbici. Aggiungere 20 microlitri di un campione di controllo positivo di tampone hCG nella zona idrofila sulla parte superiore del dispositivo. Una volta che il campione è entrato completamente nel dispositivo, aggiungere 15 microlitri di tampone di lavaggio.

Dopo che la prima aliquota di tampone di lavaggio è penetrata completamente nel dispositivo, aggiungere una seconda aliquota da 15 microlitri di tampone di lavaggio. Per rivelare i risultati del test, staccare i tre strati superiori del dispositivo utilizzando una pinzetta per esporre lo strato di cattura. Il metodo di stampa in cera può essere utilizzato per formare barriere idrofobiche all'interno di dispositivi microfluidici a base di carta e produce percorsi fluidici con dimensioni riproducibili, il che è fondamentale per i saggi con prestazioni e tempi di durata ripetibili.

Le prestazioni del test immunologico basato su carta hCG sono state dimostrate eseguendo 35 test positivi e 35 negativi in parallelo. Il coefficiente di variazione per ciascun set di dati è stato determinato essere dell'1% per i saggi eseguiti utilizzando campioni negativi e del 3% per i saggi eseguiti utilizzando campioni positivi. Un disallineamento tra gli strati che comprendono il canale di incubazione e la zona di cattura può causare lo sviluppo di un pattern irregolare nel segnale positivo, che può comportare un'interpretazione errata del segnale qualitativo.

Se la cera non viene stampata in quantità sufficiente o non viene lasciata sciogliere completamente attraverso lo spessore della carta, l'integrità delle barriere idrofobiche risultanti può essere compromessa e portare a perdite all'interno del dispositivo. I saggi che richiedono più tempo del previsto per essere completati possono indicare un malfunzionamento nella fabbricazione di un dispositivo. I dispositivi microfluidici cartacei forniscono ai ricercatori una piattaforma versatile per sviluppare test analitici a basso costo e point of care.

Sebbene esistano numerose applicazioni, l'approccio che dimostriamo qui si traduce in un'architettura generale del dispositivo per eseguire saggi immunologici, che sono fondamentali nel settore sanitario. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di verificare la presenza di imperfezioni durante il processo di fabbricazione e prima di trattare gli strati con costosi reagenti biochimici. Una volta padroneggiato, questo metodo, dalla stampa degli strati all'assemblaggio degli strati trattati, può essere utilizzato per preparare un foglio di immunodosaggi funzionali in due ore.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come fabbricare dispositivi tridimensionali basati su carta ed essere abbastanza a tuo agio da adattare questa piattaforma ad altri tipi di saggi di interesse.