Polidimetilsilossano-policarbonato dispositivi microfluidici per Cell Migration Studies Sotto perpendicolare chimica e gradienti di ossigeno

L'obiettivo generale di questo esperimento è stabilire un dispositivo microfluidico in polidimetilsilossano-policarbonato per lo studio della migrazione di cellule mammifere in presenza di diverse combinazioni di gradienti chimici e di ossigeno perpendicolari. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali negli studi sulla migrazione cellulare dei mammiferi, inclusi gli effetti di tali gradienti sulla migrazione di diversi tipi cellulari o di cellule con geni modificati. Il vantaggio principale di questa tecnica è che l'intero apparato sperimentale può essere eseguito all'interno di un incubatore convenzionale, garantendo condizioni ottimali per la coltura cellulare senza richiedere allestimenti complessi o strumentazioni ingombranti.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla diagnosi della capacità di metastasi delle cellule tumorali, poiché la motilità cellulare e i vari gradienti fisiologicamente correlati possono essere caratterizzati utilizzando il dispositivo microfluidico. Questo metodo può fornire informazioni sul processo di migrazione delle cellule dei mammiferi. Può inoltre essere applicato ad altri studi cellulari, come test farmacologici in vitro basati su cellule, riguardanti combinazioni di concentrazioni farmacologiche e tensioni di ossigeno.

Trasferire due grammi di polidimetilsilossano, o pre-polimero PDMS, sullo stampo con i canali fluidici del livello superiore per formare uno strato sottile di PDMS. Successivamente, posizionare lo stampo in un sistema a desurratore per degasare il PDMS per 60 minuti. Dopo il degasaggio, lasciare lo stampo tutta la notte in un forno a 60 gradi Celsius per la polimerizzazione del PDMS.

Assicurarsi che lo stampo sia su un piano orizzontale. Dopo aver raffreddato lo stampo a temperatura ambiente, versare ulteriori 13 grammi di prepolimero PDMS sullo stampo, quindi sottoporre il PDMS a degasaggio nell'apparato a desiccante per 60 minuti. Immergere lentamente un film di policarbonato, o PC, spesso un millimetro, nello strato fresco di PDMS come barriera alla diffusione dei gas.

Espellere eventuali bolle d'aria presenti. Successivamente, posizionare lo stampo nel forno a 60 gradi Celsius per tutta la notte. Assicurarsi che lo stampo sia su un piano orizzontale.

Dopo aver raffreddato il PDMS polimerizzato a temperatura ambiente, tagliare il dispositivo con un bisturi in modo da ottenere una superficie di circa 5,5 per cinque centimetri quadrati, sufficiente a coprire tutti i canali. Successivamente, staccare il labirinto in PDMS dallo stampo. Poi, praticare fori per gli ingressi e le uscite utilizzando un punzone per biopsia di due millimetri di diametro.

Conservare il livello superiore di PDMS-PC realizzato lontano dalla polvere ambiente per un successivo assemblaggio. Per assemblare il dispositivo, posizionare innanzitutto il livello superiore di PDMS-PC realizzato e la wafer con la membrana di PDMS spin-ricoperta all'interno di una macchina per trattamento superficiale al plasma di ossigeno, con le superfici da incollare rivolte verso l'alto. Trattare le superfici di PDMS con un plasma di ossigeno a 90 watt per 40 secondi.

Incollare lo strato superiore sulla membrana in PDMS immediatamente dopo il trattamento superficiale al plasma di ossigeno. Posizionare un peso sulla parte superiore degli strati incollati e inserirli in un forno a 60 gradi Celsius per tutta la notte per favorire l'adesione. Una volta che gli strati incollati si sono raffreddati a temperatura ambiente, tagliare la membrana unita allo strato superiore con un bisturi in un'area di circa 5,5 per cinque centimetri quadrati.

Sollevare la struttura legata dalla fettuccia di silicio e praticare dei fori negli ingressi e nelle uscite del canale per il gradiente chimico utilizzando un punzone per biopsia di due millimetri di diametro. Successivamente, posizionare lo strato superiore con la membrana legata e lo strato inferiore di PDMS realizzato all'interno della macchina per il trattamento superficiale al plasma d'ossigeno, con le superfici da incollare rivolte verso l'alto. Per attivare le superfici di PDMS, utilizzare il plasma a 90 watt per 40 secondi.

Unire immediatamente gli strati superiore e inferiore per l'adesione subito dopo il trattamento della superficie. Posizionare un peso sopra l'intero dispositivo incollato e lasciarlo tutta la notte in un forno a 60 gradi Celsius. Il giorno successivo, rimuovere l'intero dispositivo realizzato dal forno e farlo raffreddare a temperatura ambiente.

Avviare il saggio di migrazione cellulare microfluidico preparando le cellule nel dispositivo come descritto nel protocollo testuale. Al secondo giorno, aspirare il mezzo dalle cellule coltivate a partire dal giorno zero e lavare le cellule due volte con cinque millilitri di DPBS. Aspirare il DPBS e aggiungere due millilitri di tripsina-EDTA, quindi incubare le cellule nell'incubatrice per cinque minuti per staccarle dalla superficie della fiasca.

Una volta che le cellule si sono staccate e sono sospese nella soluzione, aggiungere otto millilitri di mezzo privo di siero nel flacone. Trasferire tutti i liquidi in un tubo conico da 15 millilitri e centrifugare a 140 ×g per cinque minuti a temperatura ambiente. Al termine della centrifugazione, aspirare il soprannatante e aggiungere una quantità appropriata di mezzo privo di siero per ottenere una densità cellulare finale di un milione di cellule per millilitro.

Quindi, prelevare il dispositivo microfluidico preparato il primo giorno come descritto nel protocollo testuale. Utilizzare una siringa da un millilitro con un ago ottuso da 14 gauge per iniettare il mezzo privo di siero attraverso l'uscita del canale del gradiente chimico finché il mezzo non fuoriesce da entrambi gli aghi alle entrate. Successivamente, iniettare 200 microlitri della sospensione cellulare dall'uscita del canale del gradiente chimico.

Osservare la camera di coltura cellulare nel dispositivo al microscopio per confermare che le cellule siano state introdotte nel canale microfluidico. Successivamente, posizionare il dispositivo in un contenitore umidificato e mantenerlo in un'incubatrice per colture cellulari per cinque ore per favorire l'adesione delle cellule sulla superficie del dispositivo. Nel frattempo, preparare il composto chimico alla concentrazione desiderata in un mezzo privo di siero.

Aspirare il mezzo senza siero, con e senza il composto chimico, in due siringhe separate da tre millilitri collegate a un tubo di alta purezza. Successivamente, posizionare le siringhe su una pompa per siringhe con un flusso di un microlitro al minuto per un uso successivo. Preparare quindi 15 millilitri di una soluzione di idrossido di sodio uno molare e 15 millilitri di una soluzione di pirogallolo 200 milligrammi per millilitro.

Aspirare la soluzione di idrossido di sodio in una siringa da 15 millilitri collegata a un tubo in PFTE ad alta purezza e aspirare la soluzione di pirogallolo in una siringa da 15 millilitri collegata a un tubo ad alta purezza. Montare le siringhe su una pompa per siringhe con un flusso di cinque microlitri al minuto per un uso successivo. Dopo l'incubazione di cinque ore, rimuovere l'intero dispositivo e posizionarlo su una piastra di Petri di 15 centimetri di diametro.

Fissare il dispositivo nella piastra di Petri utilizzando una pasta adesiva, quindi trasferire la piastra di Petri su un microscopio per l'immagine di cellule vive all'interno di un incubatore. Collegare i tubicini delle siringhe agli ingressi del canale per il gradiente chimico al fine di generare un gradiente chimico. Successivamente, collegare l'uscita al tubicino che conduce a un serbatoio di raccolta dei rifiuti.

Accendere la pompa per siringa con le siringhe per la generazione del gradiente chimico. Successivamente, collegare il tubo ad alta purezza dalle siringhe contenenti cloruro di sodio e pirogallolo agli ingressi del canale per il gradiente di ossigeno. Collegare il tubo all'uscita per raccogliere lo scarto e accendere la pompa per siringa con le siringhe per la generazione del gradiente di ossigeno.

Aggiungere circa 15 millilitri di acqua distillata due volte a una piastra di Petri per mantenere il dispositivo idratato. Successivamente, configurare il microscopio per l'immagineggiamento di cellule vive per l'acquisizione di immagini in differita e acquisire un'immagine ogni 15 minuti. Eseguire la raccolta e l'analisi dei dati, nonché la caratterizzazione dei gradienti come descritto nel protocollo testuale.

Qui sono mostrati risultati rappresentativi di gradienti chimici generati all'interno del dispositivo microfluidico per la migrazione cellulare. Il risultato della simulazione numerica è in buon accordo con la caratterizzazione sperimentale ottenuta utilizzando una soluzione di fluoresceina come sostanza chimica. I gradienti di altre sostanze chimiche, come il chemiochimico SDF-1 alpha, possono essere stimati preventivamente mediante simulazione.

I gradienti di ossigeno generati all'interno del dispositivo possono essere caratterizzati sperimentalmente utilizzando un colorante fluorescente sensibile all'ossigeno. In genere, all'interno del dispositivo si possono stabilire in modo stabile gradienti di ossigeno che vanno dall'1% a monte al 16% a valle. Qui vengono mostrate immagini tipiche con intervallo temporale acquisite durante gli esperimenti mediante un microscopio per l'immagineggiamento di cellule vive.

Dopo l'analisi delle immagini, possono essere calcolate le traiettorie di migrazione delle cellule A549 e i loro movimenti medi. In assenza di gradienti, le cellule mostrano una migrazione casuale e il movimento medio è prossimo a zero. In presenza di un solo gradiente del chemochina SDF-1 alpha, le cellule mostrano un comportamento chemotattico e migrano verso la direzione del gradiente di chemochina più elevato, come previsto.

Con un solo gradiente di ossigeno, le cellule si muovono verso la direzione a basso contenuto di ossigeno, mostrando un comportamento aerotattico che non è stato ampiamente studiato nelle cellule mammifere. In modo interessante, in presenza di gradienti sia di chemochina che di ossigeno, le cellule si dirigono verso il gradiente a basso contenuto di ossigeno, dimostrando che il gradiente di ossigeno ha effetti dominanti. Questa osservazione richiede ulteriori studi.

Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di livellare correttamente il dispositivo durante la fabbricazione ed eliminare le bolle d'aria all'interno del sistema microfluidico durante l'esperimento sulla migrazione cellulare. Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come preparare un dispositivo microfluidico in PDMS-PC e configurare gli esperimenti per studiare la migrazione delle cellule mammifere in presenza di gradienti chimici e di ossigeno.