Polidimetilsilossano-policarbonato dispositivi microfluidici per Cell Migration Studies Sotto perpendicolare chimica e gradienti di ossigeno

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di stabilire un dispositivo microfluidico in polidimetilsilossano-policarbonato per la migrazione delle cellule di mammifero sotto varie combinazioni di gradienti chimici e di ossigeno perpendicolari. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave negli studi sulla migrazione delle cellule di mammifero, compresi gli effetti di questi gradienti sulla migrazione di diversi tipi di cellule o cellule con geni ote. Il vantaggio principale di questa tecnica è che l'intera configurazione sperimentale può essere condotta in un incubatore convenzionale per ottenere condizioni ottimali di coltura cellulare senza noiose configurazioni e strumentazione ingombrante.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla diagnosi della capacità di metastasi delle cellule tumorali poiché la motilità cellulare e i vari gradienti fisiologicamente correlati possono essere caratterizzati utilizzando il dispositivo microfluidico. Questo metodo può fornire informazioni sulla migrazione delle cellule di mammifero. Può anche essere applicato ad altri studi cellulari come i test antidroga in vitro basati su cellule sulle combinazioni di concentrazioni di farmaci e tensioni di ossigeno.

Trasferire due grammi di polidimetilsilossano, o prepolimero PDMS, sullo stampo con i modelli di canali fluidici dello strato superiore per creare un sottile strato di PDMS. Quindi, posizionare lo stampo in una configurazione essiccante per degassare il PDMS per 60 minuti. Dopo il degasaggio, posizionare lo stampo per una notte in un forno a 60 gradi Celsius per l'indurimento PDMS.

Assicurati che lo stampo sia su un piano orizzontale. Dopo aver raffreddato lo stampo a temperatura ambiente, versare altri 13 grammi di prepolimero PDMS sullo stampo, quindi degassare il PDMS nella configurazione dell'essiccatore per 60 minuti. Incorporare lentamente un film di policarbonato o PC di un millimetro di spessore nello strato PDMS fresco come barriera alla diffusione del gas.

Espellere tutte le bolle presenti. Quindi, mettere lo stampo nel forno a 60 gradi Celsius per una notte. Assicurarsi che lo stampo sia su un piano orizzontale.

Dopo aver raffreddato il PDMS polimerizzato a temperatura ambiente, tagliare il dispositivo con un bisturi in un'area di circa 5,5 per cinque centimetri quadrati che può coprire tutti i modelli di canali. Quindi, sbucciare il laboratorio PDMS dallo stampo. Quindi, praticare i fori per gli ingressi e le uscite utilizzando un punzone per biopsia di due millimetri di diametro.

Conservare lo strato superiore di PDMS-PC fabbricato lontano dalla polvere ambientale per un successivo assemblaggio. Per assemblare il dispositivo, posizionare prima lo strato superiore PDMS-PC fabbricato e il wafer con la membrana PDMS codificata in una macchina per il trattamento superficiale al plasma di ossigeno con le superfici di incollaggio rivolte verso l'alto. Trattare le superfici PDMS con 90 watt di plasma di ossigeno per 40 secondi.

Incollare lo strato superiore sulla membrana PDMS subito dopo il trattamento superficiale al plasma di ossigeno. Metti un peso sopra gli strati incollati e mettili in un forno a 60 gradi Celsius durante la notte per favorire l'incollaggio. Una volta che gli strati incollati si sono raffreddati a temperatura ambiente, tagliare la membrana incollata allo strato superiore con un bisturi in un'area di circa 5,5 per cinque centimetri quadrati.

Sbucciare la struttura incollata dal wafer di silicio e praticare dei fori all'ingresso e all'uscita del canale del gradiente chimico utilizzando un punzone per biopsia di due millimetri di diametro. Quindi, posizionare lo strato superiore incollato con membrana e lo strato inferiore PDMS fabbricato nella macchina per il trattamento superficiale al plasma di ossigeno con le superfici di incollaggio rivolte verso l'alto. Per attivare le superfici PDMS, utilizzare il plasma a 90 watt per 40 secondi.

Fissare gli strati superiore e inferiore per l'incollaggio subito dopo il trattamento superficiale. Posizionare il peso sopra l'intero dispositivo incollato e lasciarlo per una notte in un forno a 60 gradi Celsius. Il giorno successivo, estrarre l'intero dispositivo fabbricato dal forno e raffreddarlo a temperatura ambiente.

Iniziare il saggio di migrazione cellulare microfluidica preparando le cellule nel dispositivo come descritto nel protocollo di testo. Il secondo giorno, aspirare il terreno dalle cellule che sono state coltivate dal giorno zero e lavare le cellule con cinque millilitri di DPBS due volte. Aspirare il DPBS e aggiungere due millilitri di tripsina-EDTA, quindi incubare le cellule nell'incubatore per cinque minuti per staccare le cellule dalla superficie del pallone.

Una volta che le cellule sono state staccate e sospese nella soluzione, aggiungere otto millilitri di terreno privo di siero al pallone. Trasferire tutti i liquidi in una provetta conica da 15 millilitri e centrifugarla a 140 volte G per cinque minuti a temperatura ambiente. Dopo la centrifugazione, aspirare il surnatante e aggiungere una quantità appropriata di terreno privo di siero per una densità cellulare finale di un milione di cellule per millilitro.

Quindi, estrarre il dispositivo microfluidico preparato il primo giorno come descritto nel protocollo di testo. Utilizzare una siringa da un millilitro con un ago smussato calibro 14 per iniettare il terreno privo di siero attraverso l'uscita del canale del gradiente chimico fino a quando il terreno non fuoriesce da entrambi gli aghi agli ingressi. Quindi, iniettare 200 microlitri di sospensione cellulare dall'uscita del canale del gradiente chimico.

Osservare la camera di coltura cellulare nel dispositivo al microscopio per confermare che le cellule siano state introdotte nel canale microfluidico. Quindi, posizionare il dispositivo in un contenitore umido e conservarlo in un incubatore per colture cellulari per cinque ore per favorire l'adesione delle cellule sulla superficie del dispositivo. Nel frattempo, preparare la sostanza chimica alla concentrazione desiderata in un mezzo privo di siero.

Aspirare il terreno privo di siero con e senza la sostanza chimica in due siringhe separate da tre millilitri collegate al tubo ad alta purezza. Quindi, posizionare le siringhe su una pompa a siringa con una portata di un microlitro al minuto per un uso successivo. Successivamente, preparare 15 millilitri di una soluzione di idrossido di sodio monomolare e 15 millilitri di soluzione di pirogallolo da 200 milligrammi per millilitro.

Aspirare la soluzione di idrossido di sodio in una siringa da 15 millilitri collegata a un tubo PFTE ad alta purezza e aspirare la soluzione di pirogallolo in una siringa da 15 millilitri collegata a un tubo ad alta purezza. Posizionare le siringhe su una pompa a siringa con una portata di cinque microlitri al minuto per un uso successivo. Dopo l'incubazione di cinque ore, estrarre l'intero dispositivo e posizionarlo su una piastra di Petri di 15 centimetri di diametro.

Fissare il dispositivo nella piastra di Petri utilizzando lo stucco adesivo, quindi trasferire la piastra di Petri in un microscopio per l'imaging di cellule vive in un'incubatrice. Collegare il tubo dalle siringhe agli ingressi del canale del gradiente chimico per la generazione del gradiente chimico. Quindi, collegare l'uscita al tubo che conduce a un serbatoio di scarico.

Accendere la pompa a siringa con le siringhe per la generazione del gradiente chimico. Quindi, collegare il tubo ad alta purezza dalle siringhe contenenti cloruro di sodio e pirogallolo agli ingressi del canale del gradiente di ossigeno. Collegare il tubo all'uscita per raccogliere i rifiuti e accendere la pompa a siringa con le siringhe per la generazione del gradiente di ossigeno.

Aggiungere circa 15 millilitri di acqua distillata doppia alla capsula di Petri per mantenere il dispositivo idratato. Quindi, imposta il microscopio per l'imaging di cellule vive per l'acquisizione di immagini in time-lapse e scatta un'immagine ogni 15 minuti. Eseguire la raccolta e l'analisi dei dati, nonché la caratterizzazione dei gradienti come descritto nel protocollo di testo.

Qui sono mostrati i risultati rappresentativi dei gradienti chimici generati all'interno del dispositivo microfluidico per la migrazione cellulare. Il risultato della simulazione numerica concorda bene con la caratterizzazione sperimentale utilizzando la soluzione di fluoresceina come sostanza chimica. I gradienti di altre sostanze chimiche come la chemochina SDF-1 alfa possono anche essere stimati in anticipo utilizzando la simulazione.

I gradienti di ossigeno generati all'interno del dispositivo possono essere caratterizzati sperimentalmente utilizzando un colorante a fluorescenza sensibile all'ossigeno. In genere, i gradienti di ossigeno dall'1% a monte al 16% a valle possono essere stabiliti stabilmente all'interno del dispositivo. Qui sono mostrate le tipiche immagini time-lapse raccolte durante gli esperimenti utilizzando un microscopio per l'imaging di cellule vive.

Dopo l'analisi delle immagini, è possibile calcolare le traiettorie di migrazione delle cellule A549 e i loro movimenti medi. In assenza di gradienti, le celle mostrano una migrazione casuale e il movimento medio è vicino allo zero. Con solo un gradiente di chemochine alfa SDF-1, le cellule mostrano un comportamento chemiotattico e migrano verso la direzione ad alto gradiente di chemochine come previsto.

Con solo un gradiente di ossigeno, le cellule si muovono verso la direzione a basso contenuto di ossigeno mostrando un comportamento aerotattico che non è stato ben studiato per le cellule di mammifero. È interessante notare che, sia con i gradienti di chemochine che con quelli di ossigeno, le cellule si spostano verso il gradiente di basso ossigeno, dimostrando che il gradiente di ossigeno ha effetti dominanti. Questa osservazione richiede ulteriori studi.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di livellare bene il dispositivo durante la fabbricazione ed eliminare le bolle d'aria all'interno della configurazione del dispositivo microfluidico durante l'esperimento di migrazione cellulare. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare un dispositivo microfluidico PDMS-PC e impostare gli esperimenti per studiare la migrazione delle cellule di mammifero sotto combinazioni di gradienti chimici e di ossigeno.