Name: Polidimetilsilossano-policarbonato dispositivi microfluidici per Cell Migration Studies Sotto perpendicolare chimica e gradienti di ossigeno (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 23 s
Description: Scopri la migrazione cellulare mammifera con un dispositivo microfluidico PDMS-PC che genera gradienti chimici e di ossigeno perpendicolari. Questo metodo semplifica gli studi sulla metastasi tumorale.

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Questo documento si basa sul lavoro sostenuto dagli Istituti Nazionali di Ricerca Sanitaria (NHRI) di Taiwan nell'ambito dell'Innovative Research Grant (IRG) (EX105-10523EI), dal Ministero della Scienza e della Tecnologia di Taiwan (MOST 103-2221-E-001-001-MY2, 104-2221-E-001-015-MY3, 105-2221-E-001-002-MY2), dal Progetto Tematico Academia Sinica (AS-105-TP-A06) e dal Programma di Ricerca in Nanoscienze e Nanotecnologie. Gli autori desiderano ringraziare la signora Rachel A. Lucas per aver corretto le bozze del manoscritto.

1. fabbricazione del dispositivo Microfluidic NOTA: L&#39;intero dispositivo microfluidica è fabbricato utilizzando il morbido processo di stampaggio litografia replica 13. <ol><li> Fabbricazione di stampi per strati PDMS nel dispositivo microfluidico <ol><li> Progettare i modelli di canale microfluidica utilizzando disponibili in commercio illustrazione o il software di disegno. Inviare il file a una società per alta risoluzione trasparenza stampa 14 fotomaschere. </li><li> Wafer di silicio Pulire con acetone (≥99.5%), alcol isopropilico (IPA; ≥99.9%) e di incisione ossido tamponato (BOE; 6: 1 NH 4 F.HF). Risciacquare con acqua deionizzata (DI) e disidratare il wafer con una pistola di azoto. </li><li> cappotto Spin approssimativo 20 g di photoresist tono negativo, SU-8 2050 sui wafer a 500 giri al minuto per 15 secondi e poi 2.000 rpm per 30 sec. NOTA: La condizione di spin coating dovrebbe produrre SU-8 2050 fotoresistere strati con uno spessore di circa 75 micron su wafer dopo litografia ottica. </li><li> cuocere morbido i wafer su una piastra C 65 ° per 3 minuti e poi a 95 ° C per 9 min. Dopo la cottura morbida, esporre i wafer utilizzando un assetto maschera con le maschere di trasparenza destinati ai raggi UV; l&#39;energia totale esposizione dovrebbe essere di circa 300 mJ / cm 2. bake post-esposizione (PEB) i wafer a 65 ° C per 2 minuti e poi a 95 ° C per 7 minuti. </li><li> Dopo il PEB, immergere le cialde di SU-8 sviluppatore con forte agitazione o in un bagno a ultrasuoni (37 kHz e 180 W di potenza ultrasonica efficace) per 7 minuti. Lavare il wafer con acetone e IPA per rimuovere il residuo SU-8. </li><li> Posizionare il wafer e 100 ml di silano (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyltrichlorosilane) in un diametro di 6 cm Petri in un essiccatore collegato con una pompa a vuoto a membrana per wafer superficie silanizzazione per evitare l&#39;incollaggio indesiderato. Accendere la pompa per 15 minuti, spegnerlo, E sigillare l&#39;essiccatore con un vuoto per 30 min. </li><li> Prendere le cialde silanizzati fuori dalla essiccatore e incollate a 15 cm di diametro piatti Petri per il seguente processo di litografia soffice: </li></ol></li><li> Fabbricazione e montaggio di strati PDMS <ol><li> Preparazione del PDMS pre-polimero <ol><li> Mescolare PDMS monomero (base) e l&#39;agente di indurimento in un rapporto di 10: 1 (v / v). Degassare la miscela nella configurazione essiccatore per 60 min. </li></ol></li><li> Realizzazione dello strato superiore PC-embedded <ol><li> Trasferimento 2 g di PDMS pre-polimero sullo stampo con i modelli di canale fluidici alto livello per renderlo un sottile strato di PDMS. Mettere lo stampo nel setup essiccatore a Degas il PDMS per 60 min. </li><li> Posizionare la notte stampo 60 ° C forno per PDMS polimerizzazione. Assicurarsi che lo stampo è su un piano orizzontale. </li><li> Raffreddare lo stampo a temperatura ambiente. Versare un ulteriore 13 g di PDMS pre-polimero sullo stampo e degassarla PDMS in thinstallazione di essiccatore e per 60 min. </li><li> Lentamente incorporare a 1 mm film PC spessore nello strato PDMS fresco come una barriera di diffusione di gas; espellere eventuali bolle se necessario. </li><li> Mettere la notte muffa in C forno a 60 °, e assicurarsi che sia su un piano orizzontale. </li><li> Raffreddare il PDMS curate a temperatura ambiente. Tagliare il dispositivo con un bisturi per una superficie di circa 5,5 x 5 cm 2, che può coprire tutti i modelli di canale, e staccare la lastra PDMS dallo stampo. </li><li> Punch fori per ingressi e le uscite con 2 mm di diametro biopsia pugno. Conservare lo strato PDMS-PC top fabbricato a partire da polvere ambiente per il montaggio in seguito. </li></ol></li><li> Realizzazione dello strato inferiore PDMS <ol><li> Versare 11 g di PDMS pre-polimero sullo stampo per lo strato inferiore. Mettere lo stampo in un essiccatore a Degas il PDMS per 60 min. Mantenere la notte dello stampo in forno a 60 ° per curare il PDMS. Assicurarsi che è sdraiata su un piano orizzontale. </li><li> Raffreddare °e PDMS a temperatura ambiente. Tagliare il dispositivo ad una superficie di circa 5,5 x 5 cm 2, che può coprire tutti i modelli di canale, e sfilarlo dello stampo. Conservare lo strato PDMS fondo fabbricato a partire da polvere ambiente per il montaggio in seguito. </li></ol></li><li> Realizzazione della membrana PDMS <ol><li> cappotto Spin circa 4 g di PDMS pre-polimero su un wafer di vuoto silanizzata a 100 rpm per 90 secondi e poi 3.000 rpm per 4 sec. Cuocere il wafer spin-rivestito in un forno a 60 ° C durante la notte. </li></ol></li><li> Assemblaggio del dispositivo <ol><li> Posizionare lo strato superiore PDMS-PC fabbricato e il wafer con la membrana PDMS spin-rivestito in una macchina di trattamento di superficie al plasma 2 O con le superfici di incollaggio rivolto verso l&#39;alto. Trattare le superfici PDMS con 90 W di O 2 plasma per 40 sec. </li><li> Incollare lo strato superiore sulla membrana PDMS subito dopo il trattamento superficiale al plasma O 2. Mettere un peso (circa 600 g) sulla parte superiore degli strati legati e metterli in un60 ° C overnight forno per promuovere bonding. </li><li> Raffreddare i strati incollati a temperatura ambiente e tagliare la membrana legato allo strato superiore con un bisturi per una superficie di circa 5,5 x 5 cm 2, che può coprire tutti i modelli di canale. Staccare la struttura legato dal wafer di silicio e perforare agli ingressi e uscita del canale sfumatura chimica utilizzando a 2 mm di diametro biopsia punch. </li><li> Posizionare lo strato superiore della membrana-legato e lo strato inferiore PDMS fabbricate in O macchina di trattamento di superficie al plasma 2, con le superfici di incollaggio rivolto verso l&#39;alto, per attivare le superfici PDMS utilizzando il plasma a 90 W per 40 sec. </li><li> Attaccare gli strati superiore e inferiore insieme per incollaggio immediatamente dopo il trattamento di superficie. Mettere un peso (circa 600 g) sopra l&#39;intero dispositivo di incollaggio e metterlo in un forno a 60 ° C durante la notte. </li><li> Prendere l&#39;intero dispositivo fabbricato dal forno e raffreddare a temperatura ambiente. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Assay Migrazione cellulare Microfluidic NOTA: In questo lavoro, si usa una linea cellulare di uso comune, adenocarcinomic alveolari cellule epiteliali basali umano (A549), e una chemochina, fattore delle cellule stromali derivate (SDF-1α), come esempi. Per i ricercatori che lavorano su altre cellule e chemochine, regolare i processi sperimentali di conseguenza. <ol><li> Giorno 0: preparazione delle cellule <ol><li> Cultura lo stock di cellule A549 in terreno di coltura completo contenente DMEM F12 L-glutammina sostituto, il 10% (v / v) di siero fetale bovino (FBS), e 1% (v / v) Antimicrob-antimicotico. Sub-cultura per dissociazione con 0,25% tripsina-EDTA. </li><li> Preparare sospensioni cellulari per gli esperimenti mediante centrifugazione cellule dissociate a 140 xg per 3 min a temperatura ambiente. Per gli esperimenti di dispositivi microfluidici, contare le cellule utilizzando un emocitometro e seme di almeno 1 x 10 6 cellule in un pallone T75 con 10 ml di completoterreno di coltura. NOTA: Tutti i processi di coltura cellulare vengono eseguite in un incubatore con 37 ° C e 5% CO 2 nell&#39;atmosfera. </li></ol></li><li> Giorno 1: preparazione Dispositivo <ol><li> Posizionare il dispositivo nella macchina del plasma O 2 e trattarlo con O 2 al plasma a 90 W per 40 secondi per rendere il canale microfluidica superfici idrofile. </li><li> Immediatamente dopo il trattamento superficiale, installare due 14 aghi smussati G inserendo direttamente gli aghi nei fori del diametro di 2 mm punzonate nello strato PDMS alle bocche canale gradiente chimico. Assicurarsi che gli aghi non bloccano i canali microfluidica. Disegnare 0,8 ml di DDH 2 O utilizzando una siringa da 1 ml con un ottuso 14 ago G. Iniettare il DDH 2 O nel canale gradiente di chimica dalla presa fino a quando l&#39;acqua fuoriesce da entrambi gli aghi alle bocche. </li><li> Preparare 1 ml di soluzione di fibronectina 50 mg / ml diluendo fibronectina magazzino con Dulbecco &amp; #39; s fosfato-Buffered Saline (DPBS). </li><li> Infondere la soluzione fibronectina dalla presa del canale sfumatura chimica utilizzando una siringa da 1 ml con un ottuso 14 ago G finché la soluzione fuoriesce da entrambi gli aghi alle bocche. </li><li> Incubare tutta la notte in un dispositivo convenzionale incubatore di coltura cellulare. </li></ol></li><li> Giorno 2: Cell semina e la microscopia di imaging <ol><li> cellulare semina <ol><li> Aspirare il mezzo dalle cellule che sono state coltivate dal giorno 0 e lavare le cellule con 5 ml di DPBS 2 volte. Aspirare il DPBS, aggiungere 2 ml di tripsina-EDTA e incubare le cellule in incubatore per 5 minuti per staccare le cellule dalla superficie matraccio. </li><li> Attendere finché le cellule vengono staccate e sospese nella soluzione e aggiungere 8 ml di mezzo privo di siero (DMEM F12 + 1% (v / v) Antimicrob-antimicotico soluzione) al pallone. Trasferire tutto il liquido in un tubo da 15 ml e centrifugare a 140 xg per 5 min a temperatura ambiente. </li&gt; <li> Aspirare il surnatante dopo centrifugazione ed aggiungere una quantità appropriata di mezzo privo di siero per rendere la densità cellulare finale 1 x 10 6 cellule / ml. Estrarre il dispositivo a microfluidi preparato il giorno 1. Contare le cellule utilizzando un emocitometro o di un altro strumento automatico conteggio delle cellule. </li><li> Iniettare mezzo privo di siero dalla presa del canale sfumatura chimica utilizzando una siringa da 1 ml con un ottuso 14 ago G finché il fluido scorre da entrambi gli aghi alle bocche. Iniettare 200 microlitri della sospensione cellulare dalla presa del canale sfumatura chimica. </li><li> Osservare la camera di coltura cellulare nel dispositivo al microscopio per confermare che le cellule sono state introdotte al canale microfluidica. Posizionare il dispositivo in un contenitore umido (ad esempio, una scatola di plastica con DDH 2 O all&#39;interno) e tenerlo in un incubatore di coltura cellulare per 5 ore per promuovere l&#39;adesione delle cellule sulla superficie periferica. </li></ol></li><li> Preparazione di REAGEnt per la generazione di gradiente chimico <ol><li> Preparare la chimica (SDF-1α) alla concentrazione desiderata (100 ng / ml) in mezzo privo di siero. Disegnare il terreno privo di siero con e senza la chimica in due separati 3 ml siringhe collegati al tubo di elevata purezza. Impostare le siringhe su una pompa a siringa con una portata di 1 ml / min per un uso successivo. </li></ol></li><li> Preparazione dei reagenti per la generazione di ossigeno gradiente <ol><li> Rendere 15 ml di soluzione 1 M di NaOH e 15 ml di 200 mg / ml soluzione pirogallolo. Disegnare il NaOH e soluzioni pirogallolo in due separati 15 ml siringhe collegate a elevata purezza tubi in PTFE e tubi di grande purezza, rispettivamente. Impostare le siringhe su una pompa a siringa con una portata di 5 ml / min per un uso successivo. </li></ol></li><li> configurazione del dispositivo microfluidica <ol><li> Dopo l&#39;incubazione 5 ore, prendere l&#39;intero dispositivo fuori e metterlo su un 15 cm di diametro Petri. Fissare il dispositivo nella scatola di Petri con stucco adesivo. trasferire ilCapsula di Petri per un live microscopio imaging cellulare in un incubatore. </li><li> Collegare il tubo dalle siringhe per la generazione del gradiente chimica agli ingressi del canale sfumatura chimica. Collegare l&#39;uscita dei tubi che porta ad un serbatoio dei rifiuti. Accendere la pompa a siringa con le siringhe per la generazione di gradiente chimico. </li><li> Collegare il tubo di elevata purezza dalle siringhe contenenti NaOH e pirogallolo agli ingressi del canale gradiente di ossigeno. Collegare il tubo alla presa per la raccolta dei rifiuti. Accendere la pompa a siringa con le siringhe per la generazione del gradiente di ossigeno. </li><li> Aggiungere circa 15 ml di DDH 2 O per la piastra di Petri per mantenere il dispositivo idratata. Impostare il microscopio imaging cellulare dal vivo per la cattura di immagini e ritardi, e scattare una foto ogni 15 min. </li></ol></li></ol></li><li> 3 ° giorno: la raccolta e l&#39;analisi dei dati <ol><li> Trasferire i file immagine catturati a un computer. Analizzare le immagini utilizzando l&#39;immagine di un open sourcesoftware ANALISI, ImageJ, con un plugin open source per Allineamento manuale (https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html) e un software gratuito Chemiotassi Tool (http://ibidi.com/xtproducts / it / software-and-Immagine-Analysis / Manual-Immagine-Analysis / chemiotassi-e-migrazione-Tool) 15, 16. </li></ol></li></ol> 3. Caratterizzazione dei gradienti NOTA: I gradienti chimici e ossigeno possono essere caratterizzati prima o dopo gli esperimenti cellulari. <ol><li> Simulazione numerica del gradiente chimico <ol><li> Stimare la natura flusso laminare di microfluidica utilizzando computazionali dinamiche fluidici simulazione (CFD). </li></ol></li><li> Caratterizzazione sperimentale del gradiente dell&#39;ossigeno <ol><li> Preparare un colorante sensibile all&#39;ossigeno fluorescente, tris (2,2&#39;-bipiridile) di rutenio (III) cloruro esaidrato, soluzione in acqua ad una concentrazione di 5mg / ml. </li><li> Disegnare la soluzione colorante sensibile all&#39;ossigeno in due separati 3 ml siringhe collegati al tubo di elevata purezza. Impostare le siringhe su una pompa a siringa con una portata di 1 ml / min (identici ai flussi utilizzati per la generazione del gradiente chimica). </li><li> Collegare il tubo dalle siringhe agli ingressi del canale sfumatura chimica. Collegare l&#39;uscita dei tubi che porta ad un serbatoio dei rifiuti. Accendere la pompa a siringa con le siringhe per la generazione di gradiente chimico. </li><li> Misurare l&#39;intensità di fluorescenza utilizzando un microscopio invertito a fluorescenza con la luce di eccitazione che passa attraverso un 470 ± 20 nm filtro ottico. Raccogliere l&#39;emissione di luce attraverso un filtro passa-emissione lunga 515 nm utilizzando una fotocamera CCD fresco. </li><li> Collegare il tubo di elevata purezza dalle siringhe contenenti NaOH e pirogallolo agli ingressi del canale gradiente di ossigeno. Collegare il tubo alla presa per la raccolta dei rifiuti. Accendere la pompa a siringa con le siringhe per l&#39;ossigenogenerazione di gradiente. </li><li> Raccogliere le immagini di fluorescenza del colorante sensibile all&#39;ossigeno che scorre nella camera di coltura cellulare. </li><li> Arrestare il flusso per la generazione di gradienti di ossigeno e scollegare tutte le tubazioni al canale generazione di ossigeno. Collegare il tubo di elevata purezza dalle bombole di gas all&#39;uscita del canale gradiente di ossigeno. </li><li> Raccogliere le immagini di fluorescenza del colorante sensibile all&#39;ossigeno che scorre nella camera di coltura cellulare quando scorre l&#39;aria, azoto puro, e ossigeno puro nel tubo collegato al canale del gradiente di ossigeno. </li><li> Stimare i gradienti di ossigeno analizzando le immagini di fluorescenza utilizzando l&#39;equazione di Stern-Volmer in base alle referenze 10 e 11. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Le fasi più critiche per fabbricare il PDMS dispositivo microfluidica con una pellicola sottile PC embedded sono: (1) espellendo tutte le bolle quando si inserisce il film PC nelle PDMS pre-polimero mentre fabbricare lo strato superiore PDMS-PC e (2) assicurandosi tutti i PDMS vulcanizzazione processi vengono eseguiti su un piano orizzontale ben livellato. Per gli esperimenti di migrazione delle cellule, le fasi più critiche sono: (1) l&#39;eliminazione delle bolle all&#39;interno del dispositivo microfluidica, tubi e pompe a siringa durante gli esperimenti; (2) portare il dispositivo microfluidico è posto su un piano orizzontale ben livellato durante l&#39;imaging cellulare dal vivo per l&#39;osservazione migrazione cellulare; e (3) mantenendo il dispositivo idratata con l&#39;aggiunta di DDH 2 O alla piastra di Petri durante gli esperimenti e fare in modo che l&#39;acqua non è asciugata. Al fine di realizzare con successo il dispositivo di microfluidica PDMS-PC ibrido senza delaminazione, è fondamentale per rimuovere tutte le bolle durante la fi PCinserimento lm. Il film PC può essere inserito lentamente da un angolo (circa 15 a 30 gradi dalle PDMS superficie pre-polimero) per impedire la generazione di bolle durante l&#39;inserimento del film PC nelle PDMS pre-polimero. Se necessario, l&#39;intero PDMS pre-polimero con la pellicola PC incorporato può essere collocato in un essiccatore collegato alla pompa a vuoto per 10 min per espellere le bolle intrappolate. Se il film PC galleggia dopo il processo di vuoto, un puntale può essere utilizzato per premere il film PC verso il basso sullo strato PDMS indurito. Ripetere i processi di vuoto e premere se necessario. Per gli esperimenti di cella, una mancanza di bolle d&#39;aria è critico per la coltura cellulare microfluidica. Assicurarsi che bolle d&#39;aria vengono introdotti l&#39;intera impostazione microfluidica (comprese le pompe siringa, tubi, e il dispositivo di microfluidica) quando si effettuano i collegamenti. Se le bolle d&#39;aria vengono create all&#39;interno della configurazione microfluidica causa della diminuzione della solubilità gas sotto la temperatura elevata del experiments all&#39;interno dell&#39;incubatrice, tutti i componenti sperimentali (incluse le siringhe e tubi) e reagenti (incluso il mezzo di crescita, pirogallolo, e NaOH) possono essere posizionati in incubatore anticipo (almeno 20 minuti prima dell&#39;uso) per minimizzare la variazione di temperatura . Siringa pompe spesso generano calore dal funzionamento dei motori all&#39;interno delle pompe. Di solito è accettabile utilizzare pompe a siringa all&#39;interno incubatori; tuttavia, fare controllare la temperatura dell&#39;incubatrice durante gli esperimenti. Se la temperatura eleva durante gli esperimenti, procedure di raffreddamento addizionali devono essere effettuate. Diversi metodi di raffreddamento fattibili possono essere impiegati, ad esempio in un riquadro di ghiaccio nell&#39;incubatrice, riducendo il numero di pompe a siringa posta all&#39;interno dell&#39;incubatore, o utilizzando un incubatore con un sistema di raffreddamento forza. Il dispositivo di coltura cellulare microfluidica PDMS-PC sviluppato in questo documento è in grado di generare in modo affidabile perpendicolari chimici e ossigeno gradienti fostudi di migrazione cellulare r. La limitazione del dispositivo realizzato è che i profili gradiente ossigeno generati dipendono dall&#39;equilibrio tra flusso di ossigeno, azionata da scavenging reazione chimica, e la diffusione di ossigeno dall&#39;atmosfera ambiente, attraverso il dispositivo, e nel mezzo. Come risultato, i profili gradiente di ossigeno non può essere arbitrariamente controllati all&#39;interno del dispositivo. Rispetto alle piattaforme di coltura cellulare microfluidici esistenti, il dispositivo sviluppato in questo lavoro è il primo grado di svolgere studi di coltura cellulare in combinazioni di gradienti chimici e ossigeno. L&#39;intero dispositivo può essere fabbricato mediante il processo di stampaggio di litografia replica morbido convenzionale, senza allineamento noioso e strumentazione costosa. I gradienti possono essere numericamente simulati e sperimentalmente caratterizzati per fornire condizioni microambiente come più fisiologico per studi sulle cellule in vitro. Utilizzando un metodo reazione chimica spazialmente confinati con una pellicola PC come gas dibarriera la La fusione, il gradiente di ossigeno può essere generato senza usare bombole di gas in pressione e sofisticate unità di controllo del flusso di gas. Inoltre, la configurazione richiede solo piccole quantità di sostanze chimiche (meno di 10 ml al giorno) per mantenere i gradienti di ossigeno. Dal momento che il controllo della tensione di ossigeno è limitata localmente intorno al canale microfluidica, e non disturba la concentrazione di ossigeno ambiente, l&#39;intero setup può essere inserito all&#39;interno di una convenzionale incubatore di coltura cellulare senza temperatura supplementare, l&#39;umidità, e strumentazione di controllo di CO 2. Come risultato, il dispositivo sviluppato ha un grande potenziale per essere utilizzato praticamente in laboratori biologici. A causa di limitazioni tecniche, comportamenti cellulare in tensioni di ossigeno sono raramente stati studiati nella letteratura esistente. Con l&#39;aiuto del dispositivo realizzato in questo documento, coltura cellulare in gradienti di ossigeno può essere eseguita in maniera facile che promuove notevolmente studi cellulari in gradienti di ossigeno. Furthermore, un principio di funzionamento simile può essere applicata per generare altri gradienti gassosi fisiologicamente rilevanti, come l&#39;anidride carbonica e l&#39;ossido nitrico, per coltura cellulare in vitro 17. Queste funzionalità dimostrano che il PDMS-PC dispositivo di microfluidica mostra un grande potenziale per varie applicazioni di coltura cellulare, tra cui test di droga e la proliferazione cellulare e saggi di migrazione, per avanzare in studi su colture cellulari in vitro.

La distribuzione spaziale dei fattori solubili e tensione di ossigeno può regolare una serie di importanti funzioni cellulari in vivo 1, 2, 3, 4. Per studiare meglio il loro effetto sulle cellule, una piattaforma coltura in vitro di cellule in grado di generare stabilmente chimici e ossigeno gradienti è altamente desiderata. Vari fattori solubili giocano un ruolo chiave nelle attività biologiche e influenzano il comportamento cellulare. Recentemente, grazie al progresso di tecniche microfluidica, sono stati sviluppati un certo numero di dispositivi microfluidici grado di generare stabilmente gradienti chimici per studiare la migrazione cellulare 5. Inoltre, diversi studi hanno anche rivelato la necessità di tensione di ossigeno per colture in vitro di cellule 6, 7, 8. Però,il controllo della tensione di ossigeno per la coltura cellulare si basa principalmente su oltre chimica diretta per lo scavenging ossigeno o cellulari incubatori con bombole di gas sotto pressione. Inoltre chimica diretta altera il mezzo di coltura cellulare e colpisce le risposte cellulari. incubatori controllo Oxygen richiedono una progettazione speciale incubatore, controllo di flusso di gas preciso, e un grande volume di gas azoto per ottenere condizioni di ipossia. Inoltre, è praticamente impossibile controllare la distribuzione spaziale di ossigeno tramite questa impostazione, che ritarda lo studio comportamento cellulare in varie tensioni di ossigeno e gradienti. Per superare queste limitazioni, sono stati sviluppati vari dispositivi microfluidici per generare gradienti di ossigeno per applicazioni di coltura cellulare 9. Tuttavia, la maggior parte di essi si azionano con i gas in pressione, che possono causare problemi di evaporazione e di generazione di bolle. Pertanto, essi spesso richiedono strumentazione sofisticata e potrebbero non essere affidabile per coltura cellulare Studi a lungo termineS. Per superare le sfide e di studiare ulteriormente le interazioni tra chimiche e ossigeno gradienti per la migrazione delle cellule, abbiamo sviluppato un dispositivo di coltura cellulare microfluidica fatto di polidimetilsilossano (PDMS) con un policarbonato incorporato (PC) a film sottile 10. Il dispositivo è composto da due strati di canali microfluidici separati da una membrana PDMS. Lo strato superiore è uno strato PDMS-PC per la generazione di gradienti di ossigeno; lo strato inferiore è realizzato in PDMS per la generazione gradiente chimica e coltura cellulare. Il dispositivo può generare simultaneamente perpendicolari chimici e ossigeno gradienti senza usare bombole di gas e sofisticati sistemi di controllo di flusso. Nel dispositivo, PDMS offre grande trasparenza ottica, permeabilità ai gas, e la compatibilità biologica per coltura cellulare e imaging. Il film PC incorporato funge da barriera di diffusione di gas per il controllo della tensione di ossigeno efficiente. Nel canale microfluidico, abbiamo utilizzato una serie di canali a forma di serpentinas per generare gradienti chimici. Il design è stato ampiamente sfruttato per generare gradienti chimici in dispositivi microfluidici per diverse applicazioni grazie alla sua affidabilità e semplicità di setup sperimentale. Inoltre, i profili gradiente chimica possono essere progettati variando le geometrie dei canali preventivamente con simulazione numerica. Per la generazione del gradiente di ossigeno, abbiamo approfittato del metodo reazione chimica spazialmente confinate che è stato precedentemente sviluppato nel nostro laboratorio 10, 11, 12. L&#39;ossigeno può essere scavenging dalle aree designate senza spurgo di azoto. Per l&#39;utilizzo pratico nei laboratori biologici, l&#39;intero apparato sperimentale è compatibile con tradizionali incubatori per colture cellulari. Integrando questi metodi, possiamo allo stesso tempo di generare chimici e ossigeno gradienti stabili senza bombole di gas sfusi e strumentazione sofisticata al fine di studiare la migrazione delle cellule.

<table><tbody><tr><td>Siringa da 1 ml</td><td>Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ</td><td>302104</td><td></td></tr><tr><td>Provetta per microcentrifuga da 1,5 ml</td><td>Smartgene</td><td>6011-000</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 10 ml</td><td>Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ</td><td>302151</td><td></td></tr><tr><td>Provetta da centrifuga da 15 ml</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA</td><td>Falcon 352096</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri da 150 mm</td><td>Dogger Science</td><td>DP-43151</td><td></td></tr><tr><td>1H,1H,2H,2H-Perfluoroottiltriclorosilano</td><td>Alfa Aesar, Ward Hill, MA</td><td>78560-45-9</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 3 ml</td><td>Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ</td><td>302118</td> Wafer fittizio in silicone da <td></td></tr><tr><td>4 ''</td><td>Wollemi Technical, Taoyuan, Taiwan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>ECHO Chemical, Miaoli, Taiwan</td><td>AH3102-000000-72EC</td><td></td></tr><tr><td>AG Allineatore per maschera a doppia esposizione</td><td>M& R Nano Technology, Taoyuan, Taiwan</td><td>AG500-4D-D-V-S-H</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione antibiotico-antimiotica</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA</td><td>GIBCO 15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Punzone per biopsia</td><td>Miltex, Plainsboro, NJ</td><td>33-31</td><td></td></tr><tr><td>Ago smussato</td><td>JensenGlobal, Santa Barbara, CA</td><td>Calibro 14</td><td></td></tr><tr><td>Emocitometro a linea luminosa</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>Z359629</td><td>per conteggio cellulare</td></tr><tr><td>Buffered Oxide Etch</td><td>ECHO Chemical, Miaoli, Taiwan</td><td>PH3101-000000-72EC</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore per colture cellulari</td><td>Caron, Marietta, OH</td><td>6016-1</td><td></td></tr><tr><td>COMSOL Multiphysics</td><td>COMSOL, Burlington, MA</td><td>Ver. 4.3b</td><td>per la simulazione numerica dei gradienti chimici nel dispositivo</td></tr><tr><td>D-PBS</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA</td><td>GIBCO 14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Desicattor</td><td>A-VAC Industries, Anaheim, CA</td><td>35.10001.01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12+GlutaMax-1</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA</td><td>GIBCO 10565-018</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA</td><td>GIBCO 10082</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina da plasma umano</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>F2006</td><td></td></tr><tr><td>Invertito Microscopio a fluorescenza</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germania</td><td>DMIL LED</td><td></td></tr><tr><td>Alcool isopropilico (IPA)</td><td>ECHO Chemical, Miaoli, Taiwan</td><td>CMOS112-00000-72EC</td><td></td></tr><tr><td>JuLi Smart Fluorescence Cell Imager</td><td>NanoEnTek, Seoul, Corea</td><td>DBJ01B</td><td></td></tr><tr><td>Forno per convenzione meccanica</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA</td><td>Lindberg Blue M MO1450C</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Showa Chemical Industry, Tokyo, Giappone</td><td>1943-0150</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di trattamento al plasma</td><td>Nordson MARCH, Concord CA</td><td>PX-250</td><td>per il trattamento superficiale al plasma di ossigeno</td></tr><tr><td>Film in policarbonato (PC)</td><td>Quantum Beam Technologies, Tainan Taiwan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polidimetiltilossano (PDMS)</td><td>Dow Corning, Midland, MI</td><td>SYLGARD 184</td><td></td></tr><tr><td>Pirogallolo</td><td>Alfa Aesar, Ward Hill, MA</td><td>A13405</td><td></td></tr><tr><td>Stucco adesivo rimovibile</td><td>3M</td><td>860</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend Mach 1.6R Centrifuga da tavolo</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spin Coater</td><td>ELS Technology, Hsinchu, Taiwan</td><td>ELS 306MA</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2050</td><td>MicroChem, Westborough, MA</td><td>SU-8 2050</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 Sviluppatore</td><td>MicroChem, Westborough, MA</td><td>Y020100</td><td></td></tr><tr><td>Lama chirurgica</td><td>Feather, Osaka, Giappone</td><td>5005093</td> per pompa siringa <td>da taglio PDMS</td></tr><tr><td></td><td>Chemyx, Houston, TX</td><td>Fusion 400</td><td></td></tr><tr><td>T75 Pallone per colture cellulari</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA</td><td>Nunc 156367</td><td></td></tr><tr><td>soluzione blu di tripano, 0,4%</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA</td><td>GIBCO 25200</td><td></td></tr><tr><td>Tygon Tubi in PTFE</td><td>Saint-Gobain Performance Plastics, Akron, OH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tygon Tubing</td><td>Saint-Gobain Performance Plastics, Akron, OH</td><td>621</td><td></td></tr></tbody></table>

polidimetilsilossano-policarbonato dispositivi microfluidici per cell migration studies sotto perpendicolare chimica e gradienti di ossigeno

Polydimethylsiloxane-polycarbonate Microfluidic Devices for Cell Migration Studies Under Perpendicular Chemical and Oxygen Gradients

Questo documento riporta un dispositivo microfluidica fatto di polidimetilsilossano (PDMS) con un policarbonato incorporato (PC) a film sottile per studiare la migrazione delle cellule in combinazioni di prodotti chimici e di ossigeno gradienti. Entrambi i gradienti chimici e ossigeno possono influenzare notevolmente la migrazione delle cellule in vivo; tuttavia, a causa di limitazioni tecniche, pochissima ricerca è stata condotta per studiare gli effetti in vitro. Il dispositivo sviluppato in questa ricerca si avvale di una serie di canali a forma di serpentina per generare i gradienti chimici desiderate e sfrutta un metodo reazione chimica spazialmente confinati per la generazione del gradiente di ossigeno. Le direzioni dei gradienti chimici e ossigeno sono perpendicolari l&#39;uno all&#39;altro per consentire semplice interpretazione dei risultati migrazione. Al fine di generare in modo efficiente i gradienti di ossigeno con consumo di prodotti chimici minimo, il film sottile PC incorporato viene utilizzato come barriera di diffusione di gas. Il dispositivo microfluidica sviluppatopuò essere azionato da pompe siringa e collocato in un incubatore cella convenzionale durante gli esperimenti di migrazione cellulare per consentire la semplificazione di installazione e condizioni di coltura delle cellule ottimizzate. In esperimenti sulle cellule, abbiamo usato il dispositivo per studiare le migrazioni di cellule alveolari adenocarcinomic umane basali epiteliali, A549, sotto le combinazioni di chemochine (fattore derivato dalle cellule stromali, SDF-1α) e gradienti di ossigeno. I risultati sperimentali mostrano che il dispositivo può generare stabilmente perpendicolari chemochine e ossigeno gradienti ed è compatibile con le cellule. I risultati dello studio indicano che la migrazione gradienti di ossigeno possono svolgere un ruolo fondamentale nel guidare la migrazione delle cellule, e il comportamento cellulare in combinazioni di pendenze non possono essere previsti da quelli sotto singole sfumature. Il dispositivo fornisce uno strumento potente e pratico per i ricercatori per studiare le interazioni tra chimiche e ossigeno gradienti di coltura cellulare, che può promuovere un miglioramento degli studi di migrazione cellulare in più in vivo -come microenviam-.

Fabbricato PDMS-PC ibrido microfluidica dispositivo coltura cellulare. Figura. 1 mostra una foto e un&#39;illustrazione del dispositivo microfluidica. Lo strato inferiore contiene quattro livelli dei canali a forma di serpentina per generare soluzioni di reagenti introdotte da due ingressi separati con sei diversi rapporti di miscelazione. Teoricamente, i sei diversi rapporti di miscelazione sono 1: 0, 4: 1, 3: 2, 2: 3, 1: 4, e 0: 1 (a sinistra: destra) tra le due soluzioni introdotte dagli ingressi. I gradienti chimici costruiti dai sei diverse soluzioni miscelatore rapporto possono essere generati nella camera di coltura cellulare, situato a valle. Gli strati superiore e inferiore sono separati da una membrana PDMS. Nello strato superiore, i reagenti per l&#39;ossigeno reazione chimica scavenging vengono introdotti nel canale microfluidico da due entrate separate. I reagenti sono mescolati tra loro per la reazione immediatamente prima che scorre sulla parte superiore della camera di coltura cellulare perscavenging l&#39;ossigeno dal fondo del canale, senza contatto chimica diretta. Il film PC embedded, con un coefficiente di diffusione di gas più piccolo rispetto al PDMS, agisce come una barriera di diffusione che rende ossigeno scavenging più efficiente. L&#39;ossigeno si diffonde gradualmente nuovo nella camera di coltura cellulare attraverso il PDMS nella zona a valle per formare un gradiente di ossigeno lungo la direzione del flusso. Dal momento che la reazione chimica di ossigeno scavenging è spazialmente limitata, solo le tensioni di ossigeno locali sono interessati. Come risultato, il dispositivo può essere utilizzato in un incubatore cella convenzionale senza alterarne la tensione di ossigeno globale. Negli esperimenti di migrazione, le cellule vengono seminate all&#39;interno della camera di coltura cellulare per l&#39;osservazione. Il mezzo di crescita e reagenti chimici vengono introdotti al dispositivo utilizzando pompe a siringa con portate controllate. Caratterizzazione dei gradienti chimici e ossigeno generato all&#39;interno del dispositivo. A causa di tegli flusso laminare natura della microfluidica, comportamenti di flusso possono essere previsti con computazionali dinamiche fluidici simulazione (CFD). In questo lavoro, abbiamo costruito un modello 3D e svolta la simulazione utilizzando un software di modellazione multifisica disponibile in commercio. Figura. 2 (a) mostra un confronto tra i profili di concentrazione di fluoresceina sperimentalmente caratterizzati tutta la larghezza della camera di coltura cellulare basato su misure di intensità di fluorescenza ei risultati della simulazione numerica. L&#39;accordo tra i risultati sperimentali e di simulazione suggerisce che il modello CFD può ben stimare i gradienti chimici generati all&#39;interno del dispositivo. Figura. 2 (b) traccia il gradiente simulato SDF-1α generato nella camera di coltura cellulare. Figura. 3 mostra i risultati gradiente ossigeno caratterizzazione scorre il colorante fluorescente sensibile all&#39;ossigeno all&#39;interno della camera di coltura cellulare prima degli esperimenti cellulari. Il risultato indica che un gradi ossigenoent, che vanno da circa 1 a 16%, può essere stabilita utilizzando il protocollo suddetto. Risultati della migrazione delle cellule. A dimostrazione, abbiamo effettuato studi di migrazione cellulare A549 in 4 combinazioni di chemochine (SDF-1α) e gradienti di ossigeno: (1) non chemochine e non gradienti di ossigeno come un controllo, (2) con un gradiente di chemochine e senza un gradiente di ossigeno, (3) con un gradiente di ossigeno e senza un gradiente chemochine, e (4) sia con chemochine e gradienti di ossigeno. Figura. 4 mostra la foto dell&#39;intero apparato sperimentale. Gli esperimenti sono stati tutti eseguiti in un incubatore tradizionale coltura cellulare con l&#39;intero setup (compresi i dispositivi microfluidici, pompe a siringa, e vivere microscopi imaging cellulare) posto al suo interno. I risultati della migrazione cellulare sono mostrati in Fig. 5. Figura. 5 (a) mostra le immagini raccolte durante gli esperimenti che utilizzano il imaging cellulare dal vivo analizzatore e Fig. 5 (b) e (c) trame le traiettorie di migrazione delle cellule e dei movimenti in media sotto le quattro combinazioni analizzati dal software ImageJ con i plugin. I risultati mostrano che la distanza media migrazione cellulare nel controllo avvicina a zero, il che suggerisce movimento casuale delle cellule nell&#39;esperimento. Al contrario, con solo il gradiente chemochina, il movimento media delle celle è verso sinistra, dove la concentrazione SDF-1α è maggiore. I risultati suggeriscono il comportamento chemiotassi SDF-1α di cellule A549, che è stato segnalato in precedenza. Nell&#39;esperimento solo con gradienti di ossigeno, il movimento media delle celle è verso l&#39;alto, dove la tensione di ossigeno è inferiore. Più interessante, nell&#39;esperimento con perpendicolari chemochine e ossigeno gradienti, il movimento media delle celle verso l&#39;alto e senza alcun movimento evidente nella direzione orizzontale (chemochine direzione del gradiente). Figura 1: Fabbricato PDMS-PC dispositivo di coltura cellulare microfluidica. (A) La foto sperimentale del dispositivo fabbricato in grado di generare in modo affidabile perpendicolari gradienti chimici e ossigeno per studi di migrazione cellulare. Il canale gradiente chimica è riempito con blu e giallo coloranti alimentari per dimostrare la generazione gradiente all&#39;interno della camera di coltura cellulare. Il canale del gradiente di ossigeno è piena di colorante alimentare rosso. La barra della scala è di 1 cm. (B) L&#39;schematica del dispositivo microfluidico. Lo strato superiore è fabbricato utilizzando PDMS con uno strato PC incorporato come una barriera di diffusione di gas per un efficace controllo del gradiente di ossigeno all&#39;interno della camera di coltura cellulare. (C) Gli stampi master per la fabbricazione degli strati superiore e inferiore. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55292/55292fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per</a>visualizzare una versione più grande di questa figura. <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/55292/55292fig2.jpg" /> Figura 2: gradiente chimico all&#39;interno del dispositivo di coltura cellulare microfluidica. (A) simulato numericamente e sperimentalmente caratterizzato gradiente di concentrazione di fluoresceina all&#39;interno della camera di coltura cellulare per tutta la larghezza della camera di coltura cellulare (direzione Y). La somiglianza tra i gradienti simulati e misurati sperimentalmente indica che la simulazione può anche prevedere il gradiente chimico. La figura inserto mostra il modello tridimensionale (3D) costruito per la simulazione. (B) risultati della simulazione numerica del SDF-1α chemochina gradiente attraverso la larghezza della camera di coltura cellulare per gli studi di migrazione cellulare. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55292/55292fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare un</a>grande versione di questa figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55292/55292fig3.jpg" /> Figura 3: gradiente di ossigeno all&#39;interno del dispositivo di coltura cellulare microfluidica. Sperimentalmente misurata gradienti di ossigeno all&#39;interno della camera di coltura cellulare lungo la direzione del flusso. I gradienti sono stati stimati utilizzando il colorante fluorescente di ossigeno-sensibili e analisi delle immagini. I gradienti, da sinistra a destra della camera, sono caratterizzati, ei risultati mostrano profili gradiente coerenti in tutta la larghezza della camera. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55292/55292fig4.jpg" /> Figura 4: Foto del setup sperimentale. L&#39;intera configurazione, inclusi i dispositivi microfluidica, pompe siringa e un live microscopio imaging cellulare, è collocato all&#39;interno di un incubatore tradizionale coltura cellulare per ottimizzarecondizioni di coltura cellulare durante gli esperimenti. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55292/55292fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/55292/55292fig5.jpg" /> Figura 5: la migrazione delle cellule risultati dello studio sotto perpendicolari SDF-1α e ossigeno gradienti. (A) immagini acquisite prima e dopo lo studio migrazione cellulare 12 h. I percorsi di migrazione delle cellule possono essere analizzati dalle immagini e ritardi catturati utilizzando il microscopio dal vivo imaging cellulare. (B) i percorsi di migrazione cellulare e il movimento di migrazione media analizzato dalle immagini catturate inferiore a 4 diverse combinazioni di pendenza: nessun gradiente, solo il gradiente chemochina, solo il gradiente di ossigeno, ed entrambe le chemochine e ossigeno gradienti. Le immagini sono state catturate ogni 15 min. La barra della scala è di 250 micron. (C) Piazzole delle distanze medie migrazione cellulare nel perpendicolare (gradiente di ossigeno) e orizzontale (gradiente chemochine) le istruzioni sotto quattro diverse combinazioni di gradiente. I dati sono espressi come media ± SD, ottenuti da tre gruppi sperimentali indipendenti, e 10 cellule sono state analizzate in ciascun esperimento. I (test t spaiato, p &lt;0,01) risultati statistici significativamente differenti sono indicate con lettere diverse (A e B). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55292/55292fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

Il controllo dei gradienti chimici e di ossigeno è essenziale per le colture cellulari. Questo articolo riporta un dispositivo microfluidico in polidimetilsilossano-policarbonato (PDMS-PC) in grado di generare in modo affidabile combinazioni di gradienti chimici e di ossigeno per studi di migrazione cellulare, che può essere praticamente utilizzato nei laboratori biologici senza strumentazione sofisticata.

Polidimetilsilossano-policarbonato dispositivi microfluidici per Cell Migration Studies Sotto perpendicolare chimica e gradienti di ossigeno

This paper reports a microfluidic device made of polydimethylsiloxane (PDMS) with an embedded polycarbonate (PC) thin film to study cell migration under ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è stabilire un dispositivo microfluidico in polidimetilsilossano-policarbonato per lo studio della migrazione di cellule mammifere in presenza di diverse combinazioni di gradienti chimici e di ossigeno perpendicolari. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali negli studi sulla migrazione cellulare dei mammiferi, inclusi gli effetti di tali gradienti sulla migrazione di diversi tipi cellulari o di cellule con geni modificati. Il vantaggio principale di questa tecnica è che l'intero apparato sperimentale può essere eseguito all'interno di un incubatore convenzionale, garantendo condizioni ottimali per la coltura cellulare senza richiedere allestimenti complessi o strumentazioni ingombranti.Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla diagnosi della capacità di metastasi delle cellule tumorali, poiché la motilità cellulare e i vari gradienti fisiologicamente correlati possono essere caratterizzati utilizzando il dispositivo microfluidico. Questo metodo può fornire informazioni sul processo di migrazione delle cellule dei mammiferi. Può inoltre essere applicato ad altri studi cellulari, come test farmacologici in vitro basati su cellule, riguardanti combinazioni di concentrazioni farmacologiche e tensioni di ossigeno.Trasferire due grammi di polidimetilsilossano, o pre-polimero PDMS, sullo stampo con i canali fluidici del livello superiore per formare uno strato sottile di PDMS. Successivamente, posizionare lo stampo in un sistema a desurratore per degasare il PDMS per 60 minuti. Dopo il degasaggio, lasciare lo stampo tutta la notte in un forno a 60 gradi Celsius per la polimerizzazione del PDMS.Assicurarsi che lo stampo sia su un piano orizzontale. Dopo aver raffreddato lo stampo a temperatura ambiente, versare ulteriori 13 grammi di prepolimero PDMS sullo stampo, quindi sottoporre il PDMS a degasaggio nell'apparato a desiccante per 60 minuti. Immergere lentamente un film di policarbonato, o PC, spesso un millimetro, nello strato fresco di PDMS come barriera alla diffusione dei gas.Espellere eventuali bolle d'aria presenti. Successivamente, posizionare lo stampo nel forno a 60 gradi Celsius per tutta la notte. Assicurarsi che lo stampo sia su un piano orizzontale.Dopo aver raffreddato il PDMS polimerizzato a temperatura ambiente, tagliare il dispositivo con un bisturi in modo da ottenere una superficie di circa 5,5 per cinque centimetri quadrati, sufficiente a coprire tutti i canali. Successivamente, staccare il labirinto in PDMS dallo stampo. Poi, praticare fori per gli ingressi e le uscite utilizzando un punzone per biopsia di due millimetri di diametro.Conservare il livello superiore di PDMS-PC realizzato lontano dalla polvere ambiente per un successivo assemblaggio. Per assemblare il dispositivo, posizionare innanzitutto il livello superiore di PDMS-PC realizzato e la wafer con la membrana di PDMS spin-ricoperta all'interno di una macchina per trattamento superficiale al plasma di ossigeno, con le superfici da incollare rivolte verso l'alto. Trattare le superfici di PDMS con un plasma di ossigeno a 90 watt per 40 secondi.Incollare lo strato superiore sulla membrana in PDMS immediatamente dopo il trattamento superficiale al plasma di ossigeno. Posizionare un peso sulla parte superiore degli strati incollati e inserirli in un forno a 60 gradi Celsius per tutta la notte per favorire l'adesione. Una volta che gli strati incollati si sono raffreddati a temperatura ambiente, tagliare la membrana unita allo strato superiore con un bisturi in un'area di circa 5,5 per cinque centimetri quadrati.Sollevare la struttura legata dalla fettuccia di silicio e praticare dei fori negli ingressi e nelle uscite del canale per il gradiente chimico utilizzando un punzone per biopsia di due millimetri di diametro. Successivamente, posizionare lo strato superiore con la membrana legata e lo strato inferiore di PDMS realizzato all'interno della macchina per il trattamento superficiale al plasma d'ossigeno, con le superfici da incollare rivolte verso l'alto. Per attivare le superfici di PDMS, utilizzare il plasma a 90 watt per 40 secondi.Unire immediatamente gli strati superiore e inferiore per l'adesione subito dopo il trattamento della superficie. Posizionare un peso sopra l'intero dispositivo incollato e lasciarlo tutta la notte in un forno a 60 gradi Celsius. Il giorno successivo, rimuovere l'intero dispositivo realizzato dal forno e farlo raffreddare a temperatura ambiente.Avviare il saggio di migrazione cellulare microfluidico preparando le cellule nel dispositivo come descritto nel protocollo testuale. Al secondo giorno, aspirare il mezzo dalle cellule coltivate a partire dal giorno zero e lavare le cellule due volte con cinque millilitri di DPBS. Aspirare il DPBS e aggiungere due millilitri di tripsina-EDTA, quindi incubare le cellule nell'incubatrice per cinque minuti per staccarle dalla superficie della fiasca.Una volta che le cellule si sono staccate e sono sospese nella soluzione, aggiungere otto millilitri di mezzo privo di siero nel flacone. Trasferire tutti i liquidi in un tubo conico da 15 millilitri e centrifugare a 140 ×g per cinque minuti a temperatura ambiente. Al termine della centrifugazione, aspirare il soprannatante e aggiungere una quantità appropriata di mezzo privo di siero per ottenere una densità cellulare finale di un milione di cellule per millilitro.Quindi, prelevare il dispositivo microfluidico preparato il primo giorno come descritto nel protocollo testuale. Utilizzare una siringa da un millilitro con un ago ottuso da 14 gauge per iniettare il mezzo privo di siero attraverso l'uscita del canale del gradiente chimico finché il mezzo non fuoriesce da entrambi gli aghi alle entrate. Successivamente, iniettare 200 microlitri della sospensione cellulare dall'uscita del canale del gradiente chimico.Osservare la camera di coltura cellulare nel dispositivo al microscopio per confermare che le cellule siano state introdotte nel canale microfluidico. Successivamente, posizionare il dispositivo in un contenitore umidificato e mantenerlo in un'incubatrice per colture cellulari per cinque ore per favorire l'adesione delle cellule sulla superficie del dispositivo. Nel frattempo, preparare il composto chimico alla concentrazione desiderata in un mezzo privo di siero.Aspirare il mezzo senza siero, con e senza il composto chimico, in due siringhe separate da tre millilitri collegate a un tubo di alta purezza. Successivamente, posizionare le siringhe su una pompa per siringhe con un flusso di un microlitro al minuto per un uso successivo. Preparare quindi 15 millilitri di una soluzione di idrossido di sodio uno molare e 15 millilitri di una soluzione di pirogallolo 200 milligrammi per millilitro.Aspirare la soluzione di idrossido di sodio in una siringa da 15 millilitri collegata a un tubo in PFTE ad alta purezza e aspirare la soluzione di pirogallolo in una siringa da 15 millilitri collegata a un tubo ad alta purezza. Montare le siringhe su una pompa per siringhe con un flusso di cinque microlitri al minuto per un uso successivo. Dopo l'incubazione di cinque ore, rimuovere l'intero dispositivo e posizionarlo su una piastra di Petri di 15 centimetri di diametro.Fissare il dispositivo nella piastra di Petri utilizzando una pasta adesiva, quindi trasferire la piastra di Petri su un microscopio per l'immagine di cellule vive all'interno di un incubatore. Collegare i tubicini delle siringhe agli ingressi del canale per il gradiente chimico al fine di generare un gradiente chimico. Successivamente, collegare l'uscita al tubicino che conduce a un serbatoio di raccolta dei rifiuti.Accendere la pompa per siringa con le siringhe per la generazione del gradiente chimico. Successivamente, collegare il tubo ad alta purezza dalle siringhe contenenti cloruro di sodio e pirogallolo agli ingressi del canale per il gradiente di ossigeno. Collegare il tubo all'uscita per raccogliere lo scarto e accendere la pompa per siringa con le siringhe per la generazione del gradiente di ossigeno.Aggiungere circa 15 millilitri di acqua distillata due volte a una piastra di Petri per mantenere il dispositivo idratato. Successivamente, configurare il microscopio per l'immagineggiamento di cellule vive per l'acquisizione di immagini in differita e acquisire un'immagine ogni 15 minuti. Eseguire la raccolta e l'analisi dei dati, nonché la caratterizzazione dei gradienti come descritto nel protocollo testuale.Qui sono mostrati risultati rappresentativi di gradienti chimici generati all'interno del dispositivo microfluidico per la migrazione cellulare. Il risultato della simulazione numerica è in buon accordo con la caratterizzazione sperimentale ottenuta utilizzando una soluzione di fluoresceina come sostanza chimica. I gradienti di altre sostanze chimiche, come il chemiochimico SDF-1 alpha, possono essere stimati preventivamente mediante simulazione.I gradienti di ossigeno generati all'interno del dispositivo possono essere caratterizzati sperimentalmente utilizzando un colorante fluorescente sensibile all'ossigeno. In genere, all'interno del dispositivo si possono stabilire in modo stabile gradienti di ossigeno che vanno dall'1% a monte al 16% a valle. Qui vengono mostrate immagini tipiche con intervallo temporale acquisite durante gli esperimenti mediante un microscopio per l'immagineggiamento di cellule vive.Dopo l'analisi delle immagini, possono essere calcolate le traiettorie di migrazione delle cellule A549 e i loro movimenti medi. In assenza di gradienti, le cellule mostrano una migrazione casuale e il movimento medio è prossimo a zero. In presenza di un solo gradiente del chemochina SDF-1 alpha, le cellule mostrano un comportamento chemotattico e migrano verso la direzione del gradiente di chemochina più elevato, come previsto.Con un solo gradiente di ossigeno, le cellule si muovono verso la direzione a basso contenuto di ossigeno, mostrando un comportamento aerotattico che non è stato ampiamente studiato nelle cellule mammifere. In modo interessante, in presenza di gradienti sia di chemochina che di ossigeno, le cellule si dirigono verso il gradiente a basso contenuto di ossigeno, dimostrando che il gradiente di ossigeno ha effetti dominanti. Questa osservazione richiede ulteriori studi.Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di livellare correttamente il dispositivo durante la fabbricazione ed eliminare le bolle d'aria all'interno del sistema microfluidico durante l'esperimento sulla migrazione cellulare. Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come preparare un dispositivo microfluidico in PDMS-PC e configurare gli esperimenti per studiare la migrazione delle cellule mammifere in presenza di gradienti chimici e di ossigeno.

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