Name: Biosensing potenziale del membrane del neurone del motore in embrioni di Zebrafish in tensione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Scopri le proprietà elettriche delle cellule eccitabili in embrioni di Danio rerio utilizzando un indicatore di voltaggio GEVI basato su FRET. Questo metodo non invasivo consente di analizzare l'eccitabilità neuronale in vivo.

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Gli autori desiderano ringraziare Simona Rodighiero per il suo inestimabile supporto con l'analisi di imaging FRET.

1. Generazione di plasmidi pHuC_Mermaid NOTA: La sirena è un biosensore sviluppato accoppiando il dominio di tensione (VSD) della Ciona intestinalis (ora Ciona robusta ) 5 sensori di tensione contenenti fosfatasi (Ci-VSP) con i fluorofori partner FRET Umi-Kinoko Green (mUKG: donatore) e una versione monomerica della proteina fluorescente arancione Kusabira Orange (mKOk: accettore). Per questo biosensore, i cambiamenti conformazionali del dominio VSD, indotti dalla depolarizzazione della membrana, aumentano la prossimità delle proteine ​​fluorescenti donatori e accettore, aumentando così il trasferimento di energia tra di loro (aumentando il rapporto FRET) 3 . Il VSD assicura la localizzazione efficiente del biosensore alla membrana plasmatica. L&#39;espressione neuronale del biosensore (nel midollo spinale, il segnale è rilevabile sia in interneuroni che nei neuroni motori) è ottenuta clonando la sirenaEn frame di lettura (ORF) sotto il promotore pan-neurale zebrafish HuC 6 . <ol><li> Amplificare con la reazione a catena polimerica (PCR) l&#39;ORF della sirena dal plasmide 3 della sirena pCS4 + con la polimerasi di DNA Pfu (bozza) utilizzando il primer universale T3 e il primer sirena Sma I (5&#39;TATCCCGGGATTCGACGGTTCAGATTTTA) per inserire un sito di restrizione SmaI a monte Della sirena ORF. <ol><li> Utilizzare la seguente miscela di PCR: 0,5 μL di DNA polimerasi di Pfu, 7,5 μL del buffer 10x specifico, 1 μL di dNTP 10 mM, 2,5 μL di dimetilsolfossido (DMSO), 0,5 μL (50 ng) del plasmide e 1 ΜL di soluzioni di stock di 20 μM di ogni primer in un volume totale di 50 μL. </li><li> Riscaldare la miscela PCR per 15 s a 95 ° C, prelevarla per 15 s a 50 ° C e allungarla per 4 minuti a 72 ° C per un totale di 35 cicli. </li></ol></li><li> Gel-purifica la specifica puntaPCR utilizzando un kit di depurazione del gel commerciale, seguendo il protocollo del produttore. </li><li> Clonare il frammento del DNA nel vettore blunt pCMV-SC seguendo il protocollo del produttore. </li><li> Linearizzare il plasmide sirena-positivo (denominato pCMV-SC_Mermaid) con l&#39;enzima di restrizione Sma I per il successivo inserimento del promotore HuC. <ol><li> Impostare la reazione di restrizione come segue: 0,5 μL (10 U) di enzima di restrizione SmaI, 2 μL del kit 10x tampone e 5 μg di DNA plasmidico in un volume totale di 20 μL. Incubare la reazione a 25 ° C per 1 ora. </li></ol></li><li> Gel-purifica il plasmide digerito usando un kit di depurazione del gel commerciale seguendo il protocollo del produttore. </li><li> PCR amplifica il promotore HuC (pHuC), con DNA polimera Pfu DNA e DNA genomico zebrafish come template, utilizzando una coppia di primers HuC-specific (HuCprom-forw1_SalI: 5&#39;-GTAGTCGACCAGACTTGTCAAAAGGGTCCA e HuCproM-rev1: 5&#39;-TCCATTCTTGACGTACAAAGATG) e che copre una regione di 3.150 bp a monte dell&#39;ATG. <ol><li> Impostare la miscela PCR utilizzando il seguente schema: 0,5 μL di polimero DNA di Pfu, 7,5 μL del buffer 10x specifico, 1 μL di dNTP 10 mM, 2,5 μL DMSO, 200 ng di DNA genomico e 1 μL di 20 μM Soluzioni di ciascun primer in un volume totale di 50 μL. </li><li> Dopo una fase iniziale di 2 minuti a 95 ° C, scaldare la miscela PCR per 15 s a 95 ° C, prelevare per 15 s a 50 ° C e allungarlo per 4 min a 72 ° C per un totale di 35 cicli . </li></ol></li><li> Gel-purifica il prodotto specifico blunt PCR usando un kit di depurazione del gel commerciale seguendo il protocollo del produttore. </li><li> Si lega una quantità equimolare della pCMV-SC_Mermaid purificata (fase 1.5) e del pHuC DNA (fase 1.7) usando 1 μL di ligasi del DNA T4 e 1 μl del buffer specifico 10X in un volume totale di 10 μL. Incubare la reazione per 16 ore a4 ° C. </li><li> Trasformare una aliquota di cellule competenti con 5 μL di reazione di legatura (passo 1.8) seguendo le istruzioni del produttore. </li><li> Selezionare i cloni pHuC-positive (pHuC_Mermaid) con il promotore inserito nel giusto orientamento mediante una doppia digestione Sal I- Eco RV (il sito di restrizione Sal I è stato inserito a monte del frammento promotore nel passaggio 1.6 mentre il sito di restrizione Eco RV È posizionata a valle della regione di poliadenilazione, PolyA, del plasmid pCMV-SC). <ol><li> Impostare la reazione di restrizione come segue: 0,5 μL (10 U) di entrambi gli enzimi di restrizione Sal I e Eco RV, 2 μL del tampone kit10X e 1 μg di pHuC_Mermaid DNA in un volume totale di 20 μL. Incubare la reazione a 37 ° C per 1 ora. Eseguire le reazioni su un gel agarosio. </li></ol></li></ol> 2. Microinjection dell&#39;embrione <ol><li> Trasferire il fertilizzato, ad esempioGs ottenuti da ceppi selvatici (AB strain) o Sod1-G93R zebrafish adulti 4 ad un piatto di Petri da 10 mm utilizzando una pipetta di plastica. </li><li> Sciacquare gli embrioni in acqua fredda (4 ° C) e immediatamente microiniziarli nel tuorlo con 200 pg di pluuro di pHuC_Mermaid utilizzando un microinjector (per una descrizione generale e dettagliata della procedura di microinjection, vedere Riferimenti 7 e 8). </li><li> Usando una pipetta di plastica, trasferire gli embrioni in un piatto di Petri e incubarli in acqua di pesce a 28 ° C fino a raggiungere la fase di sviluppo desiderata (20-24 ore dopo la fertilizzazione, hpf) per le seguenti analisi. </li></ol> 3. Analisi spontanea del coil di coda NOTA: Valutare il comportamento di coil spontaneo della coda negli embrioni da 20-24 hlf con o senza il riluzolo di farmaco. <ol><li> Trasferire un embrione in un piatto di Petri da 90 mm riempito con acqua di pesce contenente 0,2% DMSO (veicolo riluzolo) e manualmente dechorionate usando twO pinze di gioielliere con punte taglienti. Incubare l&#39;embrione per 5 min. </li><li> Rileva la bobina di coda in RT durante una registrazione video di 1 min usando una fotocamera digitale montata su uno stereomicroscopio. Acquisizione di serie temporali a una risoluzione di 30 fotogrammi / s. </li><li> Calcolare la frequenza delle bobine di coda spontanee contando il numero di curve (sia contralaterali che ipsilaterali) per unità di tempo. </li><li> Per valutare l&#39;effetto del riluzolo di farmaco, utilizzare delicatamente una pipetta di Pasteur plastica per trasferire l&#39;embrione in un nuovo piatto di Petri da 90 mm riempito con acqua di pesce contenente 5 μM riluzolo. <ol><li> Incubare l&#39;embrione per 5 minuti prima di registrare un video di 1 minuto e eseguire l&#39;analisi comportamentale come sopra. </li></ol></li></ol> 4. Imaging per la visualizzazione di Mermaid Biosensor in embrioni viventi: rilevazione simultanea dei segnali di donatore e ricevente <ol><li> Montare gli embrioni da 20 a 24 hpf in agarosio a basso punto di fusione dell&#39;1% nell&#39;acqua di pesce a37 ° C all&#39;interno di un piatto da 35 mm di imaging di vetro. Orientare gli embrioni sui loro lati. Attendere che l&#39;agarosio si solidifichi a temperatura ambiente. </li><li> Trasferire il piatto di imaging allo stadio di un confocale invertito montato su un microscopio invertito. Identificare i neuroni dei motori che esprimono il biosensore con un obiettivo 20X (0,7 apertura numerica, NA) emozionando il mUKG con la linea laser a 488 nm di argon e registrando le sue emissioni tra 495 e 525 nm. </li><li> Per una misura FRET, eccitate mUKG, donatore della coppia FRET, con la linea laser 488 nm. Rilevare contemporaneamente, con uno scanner a risonanza a 8000 Hz in modalità bidirezionale, la fluorescenza emessa dal donatore (fra 495 e 525 nm) e la fluorescenza emessa dall&#39;accettatore mKOk (tra 550 e 650 nm, canale FRET). Se disponibile, utilizzare il laser da 473 nm. NOTA: L&#39;efficienza di eccitazione del donatore sarà leggermente ridotta (85% invece del 93% con 488 nm), ma la eccitazione incrociata dell&#39;acceptore(Dal 17% con il 488 nm al 9% con linea laser 473 nm). </li><li> Per ridurre la fototossicità e lo sbiancamento dei fluorofori, minimizzare l&#39;illuminazione del campione riducendo la potenza della linea laser (sulla finestra del fascio del software di acquisizione). </li><li> Ottimizzare l&#39;eccitazione per abbinare i parametri di guadagno e di offset impostati all&#39;inizio dell&#39;esperimento e mantenuti costanti durante la sessione. Per impostare l&#39;offset, modificare il colore dell&#39;immagine ai valori di intensità (utilizzando la tabella di ricerca Q) e, durante la scansione con il laser spento, ruotare la manopola offset (smart offset) in modo che i pixel di sfondo abbiano un&#39;intensità leggermente Superiore a zero. Con la stessa tabella di ricerca, attivando il laser durante la scansione, ruotare la manopola di guadagno (guadagno intelligente) per ottimizzare il rapporto segnale / rumore, facendo attenzione a evitare pixel saturi. </li><li> Utilizzando un foro aperto (2 unità ariose), acquisire immagini a 16 bit per fornire una gamma dinamica sufficiente per il quantitativoE analizza. Evitate di aumentare la velocità di acquisizione e ridurre al minimo la fotopolimerizzazione. </li><li> Nella finestra Acquisizione software, selezionare una dimensione del campo immagine di 512 x 64 pixel (dimensione pixel: 605 nm) dal menu a discesa. </li><li> Dalla finestra del modo di acquisizione, selezionare xyt (tempo trascorso su un solo piano xy) f rom dal menu a discesa e registrare le variazioni della tensione neuronale spinale embrionale acquisendo un solo piano xy, impostando i parametri di acquisizione per registrare un&#39;immagine ogni 30 Ms per 1 min. </li><li> Per valutare l&#39;effetto della somministrazione del riluzolo sulla depolarizzazione della membrana nello stesso neurone, acquisire un nuovo set di dati 5 min dopo l&#39;aggiunta di acqua di pesce contenente 5 μM riluzolo. </li><li> Per l&#39;analisi FRET, utilizzare la macro ImageJ Biosensor_FRET (esprimendo biosensori FRET a catena singola. </li><li> Valutare il rapporto FRET di membrana basale di ogni neurone a t 1 come ((FRET background - FRET background) / (Donatore medio - Donator background)), dove FRET e DonO l&#39;intensità media è l&#39;intensità media di fluorescenza calcolata nella stessa regione di interesse (ROI) attirata intorno alla cella per ogni canale acquisito e lo sfondo FRET e Donatore è l&#39;intensità media di fluorescenza calcolata in un ROI del campo visivo senza il campione fluorescente. NOTA: Una descrizione dettagliata dettagliata dell&#39;utilizzo del plugin può essere trovata sul sito <a href="http://www.med.unc.edu/microscopy/resources/imagej-plugins-and-macros/biosensor-fret">www.med.unc.edu/microscopy/resources/imagej-plugins-and-macros/biosensor-fret</a> . </li><li> Utilizza un software di grafica per confrontare la frequenza, l&#39;ampiezza e la durata della depolarizzazione tra diversi paradigmi sperimentali. Confronti due gruppi usando un t- test di Student unpaired e considerate i valori medi statisticamente diversi quando P &lt;0.05. </li></ol>

<ol><li>Knöpfel, T., Gallero-Salas, Y., Song, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+voltage+indicators+for+large+scale+cortical+imaging+come+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded voltage indicators for large scale cortical imaging come of age.</a> Curr Opin Chem Biol. 27, 75-83 (2015).</li>
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<li>Brustein, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steps+during+the+development+of+the+zebrafish+locomotor+network%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol+Paris%22%5BJournal%5D)">Steps during the development of the zebrafish locomotor network.</a> J Physiol Paris. 97 (1), 77-86 (2003).</li>
<li>Drapeau, P., Ali, D. W., Buss, R. R., Saint-Amant, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+recording+from+identifiable+neurons+of+the+locomotor+network+in+the+developing+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo recording from identifiable neurons of the locomotor network in the developing zebrafish.</a> J Neurosci Methods. 88, 1-13 (1999).</li>
<li>Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tol2%3A+a+versatile+gene+transfer+vector+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates.</a> Genome Biol. 8, Suppl 1S7 (2007).</li>
<li>Sungmoo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Membrane+Potential+with+Two+Types+of+Genetically+Encoded+Fluorescent+Voltage+Sensors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Imaging Membrane Potential with Two Types of Genetically Encoded Fluorescent Voltage Sensors.</a> J Vis Exp. (108), e53566(2016).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il protocollo qui presentato ci ha consentito di esplorare l&#39;associazione tra le proprietà elettriche dei neuroni dei motori spinali embrionali zebrafish e il comportamento spintaneo di avvolgimento, la prima attività motoria stereotipica, che si presenta intorno a 17 hpf di sviluppo embrionale e dura fino a 24 hpf 10 . Il nostro approccio offre ai ricercatori uno strumento per studiare il sistema neurale di embrioni intatti, mantenendo pienamente la complessità d...

L&#39; analisi di componenti sistemica in vivo consente agli scienziati di indagare sul comportamento cellulare in modo più affidabile. Ciò è particolarmente vero quando l&#39;attività sotto controllo è fortemente influenzata dalle interazioni delle cellule cellulari (sia a contatto che a contatto non dipendente), come nel sistema nervoso, dove la tensione della membrana cambia la comunicazione tra le cellule eccitabili. La comprensione delle informazioni codificate da questi segnali elettrici è la chiave per comprendere il modo in cui il sistema nervoso funziona sia negli stati fisiologici che nelle malattie. Per studiare le proprietà elettriche delle cellule nelle condizioni fisiologiche non invasive, sono stati recentemente sviluppati diversi indicatori di tensione geneticamente codificati 1 . Contrariamente alle precedenti generazioni di sensori di tensione ottica (principalmente coloranti sensibili alla tensione) 2 , GEVI consentono analisi in vivo del sistema neurale intatto eLa loro espressione può essere limitata a specifici tipi di cellule o popolazioni. L&#39;embrione zebrafish è il &quot;substrato&quot; in vivo della scelta che sfrutta il grande potenziale attribuito ai GEVI. Infatti, grazie alla sua chiarezza ottica e al suo sistema nervoso semplificato ma evoluzionatamente conservato, il modello zebrafish consente la semplice identificazione e manipolazione di ogni componente cellulare in una rete. Infatti, l&#39;impiego della GEET Mermaid 3 a base FRET ha portato all&#39;identificazione di alterazioni pre-sintomatiche nel comportamento dei neuroni dei moti spinali in un modello zebrafish della sclerosi laterale amyotrofica (ALS) 4 . Il seguente protocollo in vivo descrive come monitorare le proprietà elettriche dei neuroni del motore spinale in embrioni di zebrafish intatti che esprimono la Sirena in maniera specifica al neurone. Inoltre, dimostra come il farmaco farmacologicamente indottoIn tali proprietà elettriche può essere associato con alterazioni della frequenza delle bobine spontanee embrionali, l&#39;attività stereotipica del motore che caratterizza il comportamento di movimento dei zebrafish in fasi molto avanzate di sviluppo.

<table><tbody><tr><td>Basso punto di fusione Agarosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414</td><td></td></tr><tr><td>DMSO&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W387520</td><td></td></tr><tr><td>Riluzole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R116</td><td></td></tr><tr><td>Pfu Ultra HQ DNA polimerasi&nbsp;</td><td>Agilent Technologies - Divisione Prodotti Stratagene 600389</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer universale T3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV Gel e PCR Clean-Up system</td><td>Promega</td><td>A9280</td><td></td></tr><tr><td>Primer universale SmaI&nbsp;</td><td>Eurofins</td><td></td><td></td></tr><tr><td>StrataClone Mammalian Expression Vector System / pCMV-SC blunt vector&nbsp;</td><td>Agilent Technologies - Divisione Prodotti Stratagene&nbsp;</td><td></td><td></td>240228</tr><tr><td>SmaI&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>R0141S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligasi</td><td>Promega</td><td>M1801</td><td></td></tr><tr><td>SalI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0138S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRV</td><td>New England Biolabs</td><td>R0195S</td><td></td></tr><tr><td>35 mm, piatto di imaging con fondo di vetro&nbsp;</td><td>Pinze Ibidi</td><td>81151</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Stereomicroscopio Sigma-Aldrich</td><td>F6521</td><td></td></tr><tr><td>Leica</td><td>Microsystems</td><td>M10 F</td><td></td></tr><tr><td>Fotocamera digitale</td><td>Leica Microsystems</td><td>DFC 310 FX</td><td></td></tr><tr><td>Leica Application Suite 4.7.1 software&nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QuickTime Player, v10.4</td><td>Microscopio</td> confocale Apple <td></td><td></td></tr><tr><td>(invertito)</td>Leica <td>Microsystems</td><td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>Microiniettore&nbsp;</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>Femtojet</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ macro Biosensor_FRET&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prisma 6.0c&nbsp;</td><td>Software GraphPad, Inc</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

biosensing potenziale del membrane del neurone del motore in embrioni di zebrafish in tensione

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

I protocolli qui descritti sono progettati per consentire ai ricercatori di studiare la comunicazione cellulare senza alterare l'integrità dell'ambiente in cui si trovano le cellule. In particolare, sono stati sviluppati per analizzare l'attività elettrica delle cellule eccitabili, come i neuroni spinali. In uno scenario del genere, è fondamentale preservare l'integrità della cellula spinale, ma è anche importante preservare l'anatomia e la forma fisiologica dei sistemi coinvolti. Infatti, la comprensione del modo in cui il sistema nervoso – e altri sistemi complessi – funziona deve basarsi su un approccio sistemico. Per questo motivo, l'embrione vivo di zebrafish è stato scelto come sistema modello e le variazioni di tensione della membrana del neurone spinale sono state valutate senza interferire con le condizioni fisiologiche degli embrioni. 
Qui, viene descritto un approccio che combina l'impiego di embrioni di zebrafish con un biosensore basato su FRET. Gli embrioni di zebrafish sono caratterizzati da un sistema nervoso molto semplificato e sono particolarmente adatti per applicazioni di imaging grazie alla loro trasparenza, che consente l'impiego di indicatori di tensione basati sulla fluorescenza sulla membrana plasmatica durante lo sviluppo del zebrafish. La sinergia tra queste due componenti permette di analizzare l'attività elettrica delle cellule negli organismi viventi intatti, senza perturbare lo stato fisiologico. Infine, questo approccio non invasivo può coesistere con altre analisi (ad esempio, registrazioni di movimenti spontanei, come mostrato qui).

Un vettore di espressione che trasporta la sequenza di codifica biosensore di Mermaid a base FRET sotto il controllo del promotore pan-neuronale di pHuC, che guida la sintesi della proteina esclusivamente nel sistema nervoso, è stata consegnata in uova fecondate a cellule singole mediante una microinezione in Per ottenere embrioni transgenici transitori ( Figura 1 , Pannello sinistro). Dopo aver masterizzato la tecnica di microinjection, la percentuale...

I protocolli qui descritti consentono lo studio delle proprietà elettriche delle cellule eccitabili nelle condizioni fisiologiche più non invasive impiegando embrioni di zebrafish in un sistema in vivo insieme a un indicatore di tensione geneticamente codificato (GEVI) basato sul trasferimento di energia per risonanza di fluorescenza (FRET) espresso selettivamente nel tipo di cellula di interesse.

Biosensing potenziale del membrane del neurone del motore in embrioni di Zebrafish in tensione

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare le proprietà elettriche di cellule eccitabili in condizioni fisiologiche non invasive, impiegando embrioni di pesce zebra insieme a un GEVI basato sul trasferimento di energia di risonanza fluorescente (FRET). Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali sulla biologia delle cellule eccitabili, come i neuroni. Ad esempio, questo metodo può essere utilizzato per analizzare il ruolo dell'eccitabilità nella patogenesi dei disturbi neurologici.Questo approccio utilizza embrioni trasparenti di zebrafish che esprimono indicatori genetici di tensione basati su FRET. Il metodo consente la misurazione delle proprietà elettriche delle cellule in vivo in modo non invasivo. Pertanto, questa tecnica può fornire informazioni sull'eccitabilità dei neuroni spinali negli embrioni di zebrafish.È possibile applicarlo anche ad altri sistemi in vitro o in vivo suscettibili di studi di imaging. Per iniziare questa procedura, preparare la miscela PCR per amplificare la sequenza codificante il biosensore Mermaid. Riscaldare la miscela PCR per 15 secondi a 95 gradi Celsius.Primerizzare per 15 secondi a 50 gradi Celsius ed allungare per quattro minuti a 72 gradi Celsius per un totale di 35 cicli. Successivamente, purificare il prodotto PCR blunt specifico mediante un kit commerciale di purificazione da gel. Clonare quindi il frammento di DNA nel vettore blunt pCMV-SC e linearizzare il plasmide positivo per Mermaid con l'enzima di restrizione SmaI per l'inserimento del promotore HuC.Impostare la reazione di restrizione in un volume totale di 20 microlitri e incubare la reazione a 25 gradi Celsius per un'ora. Successivamente, purificare il plasmide digerito mediante elettroforesi su gel utilizzando un kit commerciale per la purificazione da gel. Quindi, amplificare mediante PCR il promotore HuC utilizzando la DNA polimerasi PFU e il DNA genomico di pesce zebra come stampo.Preparare la miscela di PCR. Dopo un passaggio iniziale di due minuti a 95 gradi Celsius, riscaldare la miscela di PCR per 15 secondi a 95 gradi Celsius. Primerizzare per 15 secondi a 50 gradi Celsius ed allungare per quattro minuti a 72 gradi Celsius per un totale di 35 cicli.Quindi purificare il prodotto PCR ottuso specifico su gel. Ligatorizzare una quantità equimolare del DNA pCMV-SC Mermaid purificato e del DNA pHuC utilizzando un microlitro di ligasi del DNA T4 e un microlitro del buffer specifico 10x in un volume totale di 10 microlitri. Successivamente, incubare la reazione per 16 ore a quattro gradi Celsius.Trasformare un'aliquote di cellule competenti con cinque microlitri della reazione di ligazione. Selezionare le colonie positive per pHuC con il promotore inserito nell'orientamento corretto mediante una doppia digestione con CEL1-EcoRV. Trasferire le colonie in provette da 15 millilitri e incubarle a 37 gradi Celsius per tutta la notte.Successivamente, estrarre il plasmide dalle cellule ed eseguire la doppia reazione di restrizione CEL1-EcoRV, incubando a 37 gradi Celsius per un'ora. Quindi, eseguire le reazioni su un gel di agarosio. In questo procedimento, trasferire le uova fecondate ottenute da zebrafish adulti di tipo selvaggio o sod1G93R in una piastra di Petri da 10 millimetri.Lavare gli embrioni con acqua fredda per pesci. Successivamente, iniettare immediatamente 200 picogrammi di plasmide pHuC-Mermaid nel tuorlo mediante microiniezione. Trasferire poi gli embrioni in una piastra di Petri e incubarli in acqua per pesci a 28 gradi Celsius fino al raggiungimento dello stadio di sviluppo desiderato per le analisi successive.Per un'analisi spontanea dell'avvolgimento della coda, trasferire gli embrioni in una piastra di Petri rotonda da 90 millimetri riempita con acqua per pesci contenente DMSO allo 0,2%. Rimuovere manualmente la corionatura utilizzando due pinzette da gioielliere con punte appuntite o aghi. Successivamente, incubare gli embrioni per cinque minuti a 28 gradi Celsius.Utilizzando una fotocamera digitale montata su un microscopio stereoscopico, rilevare l'avvolgimento della coda a temperatura ambiente durante una registrazione video di un minuto. Successivamente, acquisire la serie temporale con una risoluzione temporale di 30 fotogrammi al secondo. Quindi, calcolare la frequenza degli avvolgimenti spontanei della coda contando il numero di curvature per unità di tempo.Per valutare l'effetto del farmaco riluzolo, trasferire gli embrioni in una nuova piastra di Petri da 90 millimetri riempita con acqua per pesci contenente riluzolo a cinque micromolari. Quindi incubare gli embrioni per cinque minuti a 28 gradi Celsius prima di registrare un video di un minuto ed eseguire l'analisi del comportamento. A questo punto, montare gli embrioni di 20-24 hpf in agarosio al punto di fusione basso all'uno percento in acqua per pesci all'interno di una piastra per imaging da 35 millimetri con fondo in vetro a 37 gradi Celsius.Orientare gli embrioni lateralmente e attendere che l'agarosio si solidifichi a temperatura ambiente. Successivamente, trasferire la piastra per imaging sul palchetto di un microscopio confocale. Identificare i neuroni motori che esprimono il biosensore eccitando la Umikinoko-Green monomerica con un laser all'argon a 488 nanometri.Impostare quindi l'emissione compresa tra 495 e 525 nanometri e premere registra. Per una misurazione FRET, eccitare mUKG, il donatore della coppia FRET, con il laser a 488 nanometri. Rilevare simultaneamente, mediante due fotomoltiplicatori, la fluorescenza emessa dal donatore e la fluorescenza emessa dall'accettore monomerico Kusibira-Orange.All'inizio dell'esperimento ottimizzare il guadagno e l'offset del fotomoltiplicatore uno, dove viene registrata la fluorescenza mUKG, e mantenerli costanti per tutta la durata della sessione. Per impostare l'offset, modificare il colore dell'immagine in base ai valori di intensità utilizzando la tavolozza Q. Durante la scansione con il laser spento, utilizzare il cursore dell'offset in modo che i pixel dello sfondo abbiano un'intensità leggermente superiore a zero.Utilizzando la stessa tabella di ricerca, accendere il laser. Durante la scansione, utilizzare il cursore del guadagno per massimizzare il rapporto segnale-rumore, avendo cura di evitare pixel saturi. Nella finestra di acquisizione del software, selezionare la modalità di acquisizione xyt e una dimensione del campo dell'immagine di 512 per 64 pixel dal menu a discesa.Impostare quindi la registrazione delle variazioni del voltaggio dei neuroni spinali dell'embrione, acquisendo un singolo piano XY ogni 30 millisecondi per un minuto. Per valutare l'effetto dell'amministrazione di riluzolo sulla depolarizzazione della membrana nello stesso neurone, acquisire un nuovo set di dati cinque minuti dopo l'aggiunta di acqua per pesci contenente riluzolo a cinque micromolar. In questo filmato sono stati registrati i movimenti spontanei a spirale, risposte motorie che consistono esclusivamente in una contrazione completa del corpo che porta la punta della coda verso la testa, allo stadio compreso tra 20 e 24 hpf in un mezzo per pesci normale.Questo filmato mostra gli arrotolamenti spontanei di un embrione dopo l'incubazione in riluzolo a cinque micromolari. Per verificare se alterazioni nell'attività elettrica dei neuroni motori spinali fossero alla base dei cambiamenti indotti dal riluzolo nella frequenza di arrotolamento spontaneo, il potenziale di membrana nei neuroni motori spinali dell'embrione è stato studiato in modo completamente non invasivo misurando il rapporto di intensità di fluorescenza della coppia FRET donatore-accettore del biosensore Mermaid. I neuroni motori spinali primari che esprimevano il biosensore sono stati identificati e le loro attività di depolarizzazione spontanea di base sono state registrate.Insieme alla riduzione della frequenza dei movimenti di avvolgimento della coda, l'amministrazione di riluzolo ha ridotto la frequenza degli eventi di depolarizzazione spontanea. Una volta padroneggiato, questo approccio permetterebbe ai ricercatori di studiare le proprietà elettriche delle reti neurali di embrioni integri, preservando pienamente la complessità delle interazioni tra le cellule nel sistema funzionale in via di sviluppo. Dopo aver visto questo video, dovreste avere una buona comprensione di come l'attività elettrica dei neuroni spinali si correla con la frequenza delle contrazioni spontanee della coda.

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