Biosensing potenziale del membrane del neurone del motore in embrioni di Zebrafish in tensione

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di studiare le proprietà elettriche delle cellule eccitabili in condizioni fisiologiche non invasive utilizzando embrioni di zebrafish insieme a un GEVI basato su FRET. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave riguardanti la biologia delle cellule eccitabili come i neuroni. Ad esempio, questi metodi possono essere utilizzati per analizzare il ruolo dell'eccitabilità nella patogenesi dei disturbi neurologici.

Questo approccio impiega embrioni trasparenti di zebrafish che esprimono indicatori di voltaggio geneticamente codificati basati su FRET. L'approccio consente la misurazione delle proprietà elettriche delle cellule in vivo in modo non invasivo. Quindi questo metodo può fornire informazioni sull'eccitabilità dei neuroni spinali negli embrioni di zebrafish.

Può anche essere applicato ad altri sistemi in vitro o in vivo suscettibili di studi di imaging. Per iniziare questa procedura, preparare la miscela PCR per amplificare la sequenza di codifica del biosensore Mermaid. Riscaldare la miscela PCR per 15 secondi a 95 gradi Celsius.

Adescarlo per 15 secondi a 50 gradi Celsius e allungarlo per quattro minuti a 72 gradi Celsius per un totale di 35 cicli. Successivamente, purificare il prodotto specifico per la PCR blunt utilizzando un kit di purificazione in gel commerciale. Quindi clonare il frammento di DNA nel vettore smussato pCMV-SC e linearizzare il plasmide Mermaid-positivo con l'enzima di restrizione SmaI per l'inserimento del promotore HuC.

Impostare la reazione di restrizione in un volume totale di 20 microlitri e incubare la reazione a 25 gradi Celsius per un'ora. Successivamente, purificare il plasmide digerito utilizzando un kit di purificazione in gel commerciale. Quindi la PCR amplifica il promotore HuC con PFU DNA polimerasi e DNA genomico di zebrafish come stampo.

Prepara la miscela PCR. Dopo un passaggio iniziale di due minuti a 95 gradi Celsius, riscaldare la miscela PCR per 15 secondi a 95 gradi Celsius. Adescarlo per 15 secondi a 50 gradi Celsius e allungarlo per quattro minuti a 72 gradi Celsius per un totale di 35 cicli.

Quindi purificare in gel il prodotto specifico per la PCR blunt. Ligate una quantità equimolare di pCMV-SC Mermaid purificato e DNA pHuC utilizzando un microlitro di DNA ligasi T4 e un microlitro del tampone Specific 10x in un volume totale di 10 microlitri. Successivamente, incubare la reazione per 16 ore a quattro gradi Celsius.

Trasformare un'aliquota di cellule competenti con cinque microlitri della reazione di legatura. Selezionare i cloni pHuC-positivi con il promotore inserito nell'orientamento corretto mediante una doppia digestione CEL1-EcoRV. Trasferire i cloni in provette da 15 millilitri e incubarli a 37 gradi Celsius durante la notte.

Successivamente, estrarre il plasmide dalle cellule e impostare la reazione di doppia restrizione CEL1-EcoRV e incubarla a 37 gradi Celsius per un'ora. Quindi eseguire le reazioni su un gel di agarosio. In questa procedura trasferire le uova fecondate ottenute dal pesce zebra adulto di tipo selvatico o sod1G93R in una capsula di Petri da 10 millimetri.

Sciacquare gli embrioni in acqua fredda di pesce. Quindi microiniettarli immediatamente nel tuorlo con 200 picogrammi di plasmide pHuC-Mermaid. Successivamente, trasferire gli embrioni in una capsula di Petri e incubarli in acqua di pesce a 28 gradi Celsius fino a raggiungere lo stadio di sviluppo desiderato per le analisi successive.

Per un'analisi spontanea dell'avvolgimento della coda, trasferire gli embrioni in una capsula di Petri rotonda da 90 millimetri riempita con acqua di pesce contenente lo 0,2% di DMSO. E decorionarli manualmente usando due pinze da gioielliere con punte affilate o aghi. Successivamente, incubare gli embrioni per cinque minuti a 28 gradi Celsius.

Utilizzando una fotocamera digitale montata su uno stereomicroscopio, è possibile rilevare l'avvolgimento della coda a temperatura ambiente durante una registrazione video di un minuto. Successivamente, acquisire le serie temporali con una risoluzione temporale di 30 fotogrammi al secondo. Quindi calcola la frequenza degli avvolgimenti spontanei della coda contando il numero di curve per unità di tempo.

Per valutare l'effetto del farmaco riluzolo, trasferire gli embrioni in una nuova capsula di Petri da 90 millimetri riempita con acqua di pesce contenente cinque micromolari di riluzolo. Quindi incubare gli embrioni per cinque minuti a 28 gradi Celsius prima di registrare un video di un minuto ed eseguire l'analisi comportamentale. Ora monta gli embrioni da 20 a 24 hpf in agarosio a basso punto di fusione all'uno per cento in acqua di pesce all'interno di una capsula di imaging con fondo di vetro da 35 millimetri a 37 gradi Celsius.

Orientare gli embrioni su un lato e attendere che l'agarosio si solidifichi a temperatura ambiente. Quindi trasferire la piastra di imaging sul tavolino di un microscopio confocale. Identificare i motoneuroni che esprimono il biosensore eccitando il monomero Umikinoko-Green con laser ad argon a 488 nanometri.

Quindi impostare la sua emissione tra 495 e 525 nanometri e premere il record. Per una misurazione FRET eccitate mUKG, il donatore della coppia di Fret, con il laser a 488 nanometri. Contemporaneamente, utilizzando due fotomoltiplicatori, si rileva la fluorescenza emessa dal donatore e la fluorescenza emessa dall'accettore monomerico Kusibira-Orange.

All'inizio dell'esperimento ottimizzare il guadagno e l'offset del fotomoltiplicatore uno in cui viene registrata la fluorescenza mUKG e mantenerli costanti per tutta la sessione. Per impostare l'offset, modificare il colore dell'immagine in base ai valori di intensità utilizzando la tabella di ricerca Q. Durante la scansione con il laser spento, utilizzare il cursore di offset in modo che i pixel di sfondo abbiano un'intensità leggermente superiore a zero.

Utilizzando la stessa tabella di ricerca, accendere il laser. Durante la scansione, utilizzare il cursore del guadagno per massimizzare il rapporto segnale/rumore, facendo attenzione a evitare pixel saturi. Nella finestra di acquisizione del software, selezionare la modalità di acquisizione xyt e una dimensione del campo immagine di 512 x 64 pixel dal menu a discesa.

Quindi impostare la registrazione dei cambiamenti nella tensione dei neuroni spinali dell'embrione per acquisire un singolo piano XY ogni 30 millisecondi per un minuto. Per valutare l'effetto della somministrazione di riluzolo sulla depolarizzazione della membrana nello stesso neurone, acquisire un nuovo set di dati cinque minuti dopo l'aggiunta di acqua di pesce contenente cinque riluzolo micromolare. In questo film, le risposte motorie che consistono esclusivamente in una contrazione di tutto il corpo che porta la punta della coda alla testa sono state registrate allo stadio da 20 a 24 hpf in un normale mezzo di pesce.

Questo filmato mostra gli avvolgimenti spontanei di un embrione in seguito all'incubazione in cinque riluzolo micromolari. Per verificare se le alterazioni dell'attività elettrica dei motoneuroni spinali fossero alla base dei cambiamenti indotti dal riluzolo nella frequenza di avvolgimento spontaneo, il potenziale di membrana nei motoneuroni spinali dell'embrione è stato studiato in modo completamente non invasivo misurando il rapporto di intensità della fluorescenza della coppia FRET donatore-accettore del biosensore Mermaid. Sono stati identificati i motoneuroni spinali primari che esprimono il biosensore e sono state registrate le loro attività di depolarizzazione spontanea basale.

Insieme alla riduzione della frequenza dei movimenti di avvolgimento della coda, la somministrazione di riluzolo ha ridotto la frequenza degli eventi di depolarizzazione spontanea. Una volta padroneggiato, questo approccio consentirebbe ai ricercatori di studiare le proprietà elettriche delle reti neurali di embrioni intatti, preservando completamente la complessità delle interazioni tra le cellule nel sistema funzionale in via di sviluppo. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come l'attività elettrica dei neuroni spinali sia correlata alla frequenza degli avvolgimenti spontanei della coda.