Biosensing potenziale del membrane del neurone del motore in embrioni di Zebrafish in tensione

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare le proprietà elettriche di cellule eccitabili in condizioni fisiologiche non invasive, impiegando embrioni di pesce zebra insieme a un GEVI basato sul trasferimento di energia di risonanza fluorescente (FRET). Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali sulla biologia delle cellule eccitabili, come i neuroni. Ad esempio, questo metodo può essere utilizzato per analizzare il ruolo dell'eccitabilità nella patogenesi dei disturbi neurologici.

Questo approccio utilizza embrioni trasparenti di zebrafish che esprimono indicatori genetici di tensione basati su FRET. Il metodo consente la misurazione delle proprietà elettriche delle cellule in vivo in modo non invasivo. Pertanto, questa tecnica può fornire informazioni sull'eccitabilità dei neuroni spinali negli embrioni di zebrafish.

È possibile applicarlo anche ad altri sistemi in vitro o in vivo suscettibili di studi di imaging. Per iniziare questa procedura, preparare la miscela PCR per amplificare la sequenza codificante il biosensore Mermaid. Riscaldare la miscela PCR per 15 secondi a 95 gradi Celsius.

Primerizzare per 15 secondi a 50 gradi Celsius ed allungare per quattro minuti a 72 gradi Celsius per un totale di 35 cicli. Successivamente, purificare il prodotto PCR blunt specifico mediante un kit commerciale di purificazione da gel. Clonare quindi il frammento di DNA nel vettore blunt pCMV-SC e linearizzare il plasmide positivo per Mermaid con l'enzima di restrizione SmaI per l'inserimento del promotore HuC.

Impostare la reazione di restrizione in un volume totale di 20 microlitri e incubare la reazione a 25 gradi Celsius per un'ora. Successivamente, purificare il plasmide digerito mediante elettroforesi su gel utilizzando un kit commerciale per la purificazione da gel. Quindi, amplificare mediante PCR il promotore HuC utilizzando la DNA polimerasi PFU e il DNA genomico di pesce zebra come stampo.

Preparare la miscela di PCR. Dopo un passaggio iniziale di due minuti a 95 gradi Celsius, riscaldare la miscela di PCR per 15 secondi a 95 gradi Celsius. Primerizzare per 15 secondi a 50 gradi Celsius ed allungare per quattro minuti a 72 gradi Celsius per un totale di 35 cicli.

Quindi purificare il prodotto PCR ottuso specifico su gel. Ligatorizzare una quantità equimolare del DNA pCMV-SC Mermaid purificato e del DNA pHuC utilizzando un microlitro di ligasi del DNA T4 e un microlitro del buffer specifico 10x in un volume totale di 10 microlitri. Successivamente, incubare la reazione per 16 ore a quattro gradi Celsius.

Trasformare un'aliquote di cellule competenti con cinque microlitri della reazione di ligazione. Selezionare le colonie positive per pHuC con il promotore inserito nell'orientamento corretto mediante una doppia digestione con CEL1-EcoRV. Trasferire le colonie in provette da 15 millilitri e incubarle a 37 gradi Celsius per tutta la notte.

Successivamente, estrarre il plasmide dalle cellule ed eseguire la doppia reazione di restrizione CEL1-EcoRV, incubando a 37 gradi Celsius per un'ora. Quindi, eseguire le reazioni su un gel di agarosio. In questo procedimento, trasferire le uova fecondate ottenute da zebrafish adulti di tipo selvaggio o sod1G93R in una piastra di Petri da 10 millimetri.

Lavare gli embrioni con acqua fredda per pesci. Successivamente, iniettare immediatamente 200 picogrammi di plasmide pHuC-Mermaid nel tuorlo mediante microiniezione. Trasferire poi gli embrioni in una piastra di Petri e incubarli in acqua per pesci a 28 gradi Celsius fino al raggiungimento dello stadio di sviluppo desiderato per le analisi successive.

Per un'analisi spontanea dell'avvolgimento della coda, trasferire gli embrioni in una piastra di Petri rotonda da 90 millimetri riempita con acqua per pesci contenente DMSO allo 0,2%. Rimuovere manualmente la corionatura utilizzando due pinzette da gioielliere con punte appuntite o aghi. Successivamente, incubare gli embrioni per cinque minuti a 28 gradi Celsius.

Utilizzando una fotocamera digitale montata su un microscopio stereoscopico, rilevare l'avvolgimento della coda a temperatura ambiente durante una registrazione video di un minuto. Successivamente, acquisire la serie temporale con una risoluzione temporale di 30 fotogrammi al secondo. Quindi, calcolare la frequenza degli avvolgimenti spontanei della coda contando il numero di curvature per unità di tempo.

Per valutare l'effetto del farmaco riluzolo, trasferire gli embrioni in una nuova piastra di Petri da 90 millimetri riempita con acqua per pesci contenente riluzolo a cinque micromolari. Quindi incubare gli embrioni per cinque minuti a 28 gradi Celsius prima di registrare un video di un minuto ed eseguire l'analisi del comportamento. A questo punto, montare gli embrioni di 20-24 hpf in agarosio al punto di fusione basso all'uno percento in acqua per pesci all'interno di una piastra per imaging da 35 millimetri con fondo in vetro a 37 gradi Celsius.

Orientare gli embrioni lateralmente e attendere che l'agarosio si solidifichi a temperatura ambiente. Successivamente, trasferire la piastra per imaging sul palchetto di un microscopio confocale. Identificare i neuroni motori che esprimono il biosensore eccitando la Umikinoko-Green monomerica con un laser all'argon a 488 nanometri.

Impostare quindi l'emissione compresa tra 495 e 525 nanometri e premere registra. Per una misurazione FRET, eccitare mUKG, il donatore della coppia FRET, con il laser a 488 nanometri. Rilevare simultaneamente, mediante due fotomoltiplicatori, la fluorescenza emessa dal donatore e la fluorescenza emessa dall'accettore monomerico Kusibira-Orange.

All'inizio dell'esperimento ottimizzare il guadagno e l'offset del fotomoltiplicatore uno, dove viene registrata la fluorescenza mUKG, e mantenerli costanti per tutta la durata della sessione. Per impostare l'offset, modificare il colore dell'immagine in base ai valori di intensità utilizzando la tavolozza Q. Durante la scansione con il laser spento, utilizzare il cursore dell'offset in modo che i pixel dello sfondo abbiano un'intensità leggermente superiore a zero.

Utilizzando la stessa tabella di ricerca, accendere il laser. Durante la scansione, utilizzare il cursore del guadagno per massimizzare il rapporto segnale-rumore, avendo cura di evitare pixel saturi. Nella finestra di acquisizione del software, selezionare la modalità di acquisizione xyt e una dimensione del campo dell'immagine di 512 per 64 pixel dal menu a discesa.

Impostare quindi la registrazione delle variazioni del voltaggio dei neuroni spinali dell'embrione, acquisendo un singolo piano XY ogni 30 millisecondi per un minuto. Per valutare l'effetto dell'amministrazione di riluzolo sulla depolarizzazione della membrana nello stesso neurone, acquisire un nuovo set di dati cinque minuti dopo l'aggiunta di acqua per pesci contenente riluzolo a cinque micromolar. In questo filmato sono stati registrati i movimenti spontanei a spirale, risposte motorie che consistono esclusivamente in una contrazione completa del corpo che porta la punta della coda verso la testa, allo stadio compreso tra 20 e 24 hpf in un mezzo per pesci normale.

Questo filmato mostra gli arrotolamenti spontanei di un embrione dopo l'incubazione in riluzolo a cinque micromolari. Per verificare se alterazioni nell'attività elettrica dei neuroni motori spinali fossero alla base dei cambiamenti indotti dal riluzolo nella frequenza di arrotolamento spontaneo, il potenziale di membrana nei neuroni motori spinali dell'embrione è stato studiato in modo completamente non invasivo misurando il rapporto di intensità di fluorescenza della coppia FRET donatore-accettore del biosensore Mermaid. I neuroni motori spinali primari che esprimevano il biosensore sono stati identificati e le loro attività di depolarizzazione spontanea di base sono state registrate.

Insieme alla riduzione della frequenza dei movimenti di avvolgimento della coda, l'amministrazione di riluzolo ha ridotto la frequenza degli eventi di depolarizzazione spontanea. Una volta padroneggiato, questo approccio permetterebbe ai ricercatori di studiare le proprietà elettriche delle reti neurali di embrioni integri, preservando pienamente la complessità delle interazioni tra le cellule nel sistema funzionale in via di sviluppo. Dopo aver visto questo video, dovreste avere una buona comprensione di come l'attività elettrica dei neuroni spinali si correla con la frequenza delle contrazioni spontanee della coda.