Utilizzando biologia sintetica per Ingegnere cellule viventi che si interfacciano con materiali programmabili

L'obiettivo generale di queste procedure è utilizzare E.coli ingegnerizzati sinteticamente per controllare e manipolare superfici di materiali programmabili combinando strategie di modificazione genetica e funzionalizzazione delle superfici. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali in campi come la medicina molecolare e il monitoraggio ambientale. Utilizzando cellule programmate geneticamente per interpretare un ambiente locale e modificare di conseguenza un materiale funzionalizzato, forniamo uno strumento modulare per una vasta gamma di applicazioni.

Il principale vantaggio di questa tecnica è che le cellule vive sono in grado di agire come sensori dinamici capaci di leggere, elaborare e registrare le condizioni circostanti attraverso interfacce funzionalizzate. Dopo aver preparato le soluzioni e aver raccolto il surnatante arricchito in biotina da E.coli produttore di biotina secondo il protocollo descritto nel testo, aggiungere 1,4 microlitri di soluzione SPDP a 20 microlitri di soluzione di streptavidina (SA). Avvolgere il tubo nella pellicola di alluminio e incubare a temperatura ambiente per un'ora e mezza, consentendo al cross linker SPDP di legarsi alla SA tramite un gruppo amminico, formando una SA attivata con piridilditio. Al termine dell'incubazione, aggiungere 2,4 microlitri di soluzione DTT al tubo e incubare il campione a temperatura ambiente per un'ora, permettendo il distacco della piridina-2-tione e ottenendo una SA attivata con sulfidrile. Successivamente, aggiungere 7,5 microlitri di soluzione SCC a 72 microlitri di soluzione di HRP, avvolgere nella pellicola di alluminio e incubare a temperatura ambiente per un'ora e mezza.

Questo produce una HRP attivata con maleimide legata tramite un gruppo amminico. Mescolare 17 microlitri di soluzione di biotina LC-LC con 200 microlitri di soluzione di BSA, avvolgere il tubo nella stagnola e incubare il campione a temperatura ambiente per un'ora e mezza. Questo passaggio consente al biotina di coniugarsi alla BSA attraverso un legame ammidico.

Trasferire la soluzione di SA-SPDP, l'HRP-SMCC e la soluzione di biotina coniugata con BSA in concentratori centrifughi separati contenuti in provette da centrifuga. Centrifugare l'SA-SPDP a 10.000 × g fino a quando il volume nel tubo raggiunge i 100 microlitri o per 16 minuti, quindi riempire la provetta da centrifuga fino a 500 microlitri utilizzando PBS-EDTA e ripetere la centrifugazione e l'aggiunta di PBS-EDTA altre cinque volte. Dopo aver centrifugato la soluzione fino a un volume di 100 microlitri, conservare il prodotto iniziale a quattro gradi Celsius.

Per l'HRP SMCC, centrifugare i tubi a 10.000 ×g fino a quando il volume raggiunge 25 microlitri o per 16 minuti. Riempire il tubo da centrifuga fino a 4500 microlitri utilizzando PBS prima di ripetere la centrifugazione e l'aggiunta di PBS altre cinque volte. Dopo aver centrifugato la soluzione fino a un volume di 100 microlitri, conservare la soluzione madre a quattro gradi Celsius.

Per la biotina BSA, centrifugare il campione a 10.000 volte g fino a quando il volume raggiunge 100 microlitri o per 12 minuti, quindi portare il volume del tubo da centrifuga a 500 microlitri utilizzando PBS. Dopo aver ripetuto la centrifugazione e l'aggiunta di PBS altre quattro volte, centrifugare il tubo fino a quando il volume raggiunge 100 microlitri o per 12 minuti, quindi aggiungere 100 microlitri di PBS al tubo e conservare la soluzione madre a quattro gradi Celsius. Successivamente, mescolare 25 microlitri di HRP al 10 milligrammi per millilitro con 25 microlitri di soluzione di SA al 10 milligrammi per millilitro e conservare il tubo a quattro gradi Celsius durante la notte; quindi preparare due aliquote di biotina BSA in PBS aggiungendo 10 microlitri della soluzione madre di biotina BSA a 490 microlitri di PBS.

Trasferire 100 microlitri della soluzione in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Avvolgere la piastra con della pellicola e incubare a 37 gradi Celsius per un'ora. Successivamente, aggiungere 200 microlitri di Tween 80 0,5% e BPS nei pozzetti.

Incubare la piastra a temperatura ambiente per due minuti, quindi aspirare e decantare il liquido. Dopo aver ripetuto il lavaggio tre volte, aggiungere 200 microlitri della soluzione di rivestimento allo 0,5% in ciascun pozzetto, quindi incubare la piastra a 37 gradi Celsius per un'ora. Dopo un ulteriore ciclo di lavaggi come in precedenza, mescolare 12 millilitri di soluzione di rivestimento allo 0,5% con 7,5 microlitri di Tween 80 allo 0,5%, quindi utilizzare questa soluzione per diluire il stock di SA-HRP di uno a 10.000.

Aggiungere con la pipetta 80 microlitri di SA-HRP diluito in ogni pozzetto di una piastra a 96 pozzetti, quindi aggiungere 20 microlitri del campione di biotina preparato in ogni pozzetto della piastra. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per un'ora. Questo passaggio consente un legame competitivo tra biotina libera e biotina BSA immobilizzata per i siti di legame dell'SA-HRP.

Successivamente, dopo aver lavato la piastra tre volte come in precedenza, preparare una soluzione di 20 millilitri di acetato di sodio 50 millimolare, 1% TMB e 3% perossido di idrogeno in un rapporto di 1.000 a 10 a uno. Aggiungere 200 microlitri della soluzione in ogni pozzetto della piastra, avvolgerla con pellicola d'alluminio e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti. Pipettare 50 microlitri di acido solforico 2 molare in ogni pozzetto per arrestare la reazione, quindi utilizzare un lettore di piastre per misurare l'OD a 450 nm.

Dopo aver preparato le soluzioni secondo il protocollo descritto nel testo, aggiungere 7,5 microlitri di biotina LC-LC a 72 microlitri di HRP. Avvolgere la soluzione nella pellicola d'alluminio e incubare il campione a temperatura ambiente per un'ora e mezza con agitazione. Questo passaggio induce la coniugazione della biotina all'HRP mediante un legame ammidico.

Trasferire la soluzione in un concentratore centrifugo all'interno di una provetta da centrifuga e centrifugare a 10.000 ×g fino a quando il volume raggiunge i 100 microlitri o per 12 minuti; quindi utilizzare PBS per portare il volume della provetta a 500 microlitri e ripetere la centrifugazione e l'aggiunta di tampone per quattro volte. Successivamente, aggiungere 100 microlitri di SA a 0,17 microgrammi per millilitro in PBS in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Avvolgere la piastra con della pellicola d'alluminio e incubare a 37 gradi Celsius per un'ora.

Per lavare le pozzette della piastra, pipettare 200 microlitri di Tween 80 allo 0,5% in ciascuna pozzetta. Incubare la piastra a temperatura ambiente per due minuti e quindi eliminare il liquido. Dopo aver ripetuto il lavaggio altre tre volte, aggiungere 200 microlitri della soluzione di rivestimento allo 0,5% nelle pozzette.

Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per un'ora prima di lavare i pozzetti tre volte come in precedenza. Utilizzando la soluzione di biotina HRP lavata e concentrata precedentemente preparata, diluire il ceppo stock di biotina HRP di uno a 10.000, quindi aggiungere 80 microlitri della soluzione nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti. Aggiungere 20 microlitri del campione di biotina preparato in ciascun pozzetto della piastra e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per un'ora per consentire il legame competitivo tra biotina libera e biotina HRP per i siti di legame di SA immobilizzati.

Dopo aver lavato le pozzette tre volte come in precedenza, preparare una soluzione di 20 millilitri di acetato di sodio 50 millimolare, 1% TMV e 3% perossido di idrogeno in un rapporto di 1.000 a 10 a uno. Aggiungere 200 microlitri della soluzione in ciascuna pozzetta della piastra, coprirla con della pellicola e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti; quindi aggiungere 50 microlitri di acido solforico 2 molare in ciascuna pozzetta per arrestare la reazione. Infine, utilizzare un lettore di piastre per misurare l'OD a 450 nm.

Le cellule di tipo selvatico di E.coli MG1655 ingegnerizzate e inducibili sono state coltivate e monitorate in mezzo minimo, nonché in mezzo minimo integrato con DTB e/o IPTG. Questi grafici mostrano i valori di densità ottica a 600 nm misurati ogni cinque minuti per 24 ore. In questo esperimento, la proteina fluorescente mCherry è stata utilizzata al posto del gene bioB, in modo da poter misurare il profilo di induzione quando le cellule ingegnerizzate sono state indotte con IPTG.

Questi risultati dimostrano l'efficacia della rete genica induttibile. Sono riportati qui i segnali ottici a OD 450 in risposta a diverse concentrazioni di biotina, per entrambi gli schemi di superficie funzionalizzata indiretta e diretta. In questo esperimento, i prodotti di cellule ingegnerizzate indotte sono stati utilizzati per modificare chimicamente la superficie funzionalizzata.

Le diverse concentrazioni di biotina sono presentate come misurate mediante la superficie funzionalizzata del sistema di controllo indiretto per cellule di tipo selvaggio, cellule non indotte contenenti il plasmide pKE1-lacI-bioB e cellule indotte contenenti il plasmide pKE1-lacI-bioB. Una volta acquisita padronanza, le cellule possono essere ingegnerizzate geneticamente in due giorni, mentre le tecniche di funzionalizzazione superficiale diretta e indiretta possono essere completate ciascuna in cinque ore, se eseguite correttamente. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di evitare la contaminazione delle colture cellulari batteriche e di coprire le superfici durante la funzionalizzazione per prevenire lo sbiancamento fotoindotto.

Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come funzionalizzare le superfici per entrambi gli schemi di controllo diretto e indiretto. Non dimenticare che lavorare con bromuro di etidio può essere estremamente pericoloso e che precauzioni, come l'uso di guanti, devono essere sempre adottate durante l'esecuzione di questa procedura.