Name: Utilizzando biologia sintetica per Ingegnere cellule viventi che si interfacciano con materiali programmabili (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Scopri come utilizzare E. coli ingegnerizzate per controllare superfici materiali programmabili attraverso modifiche genetiche e funzionalizzazione. Questo metodo offre sensori dinamici per la medicina molecolare.

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Gli autori ringraziano il sostegno di premio FA9550-13-1-0108 dall&#39;Ufficio Air Force di ricerca scientifica degli Stati Uniti. Gli autori inoltre riconoscono il sostegno di premio N00014-15-1-2502 dal Office of Naval Research degli Stati Uniti, il finanziamento dell&#39;Istituto per Critical Tecnologia e Scienza Applicata presso Virginia Polytechnic Institute e State University, e dal National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program, il numero di riconoscimento 1.607.310.

<ol><li>Zhang, R., Heyde, K. C., Scott, F. Y., Paek, S. -H., Ruder, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programming+Surface+Chemistry+with+Engineered+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth.+Biol%22%5BJournal%5D)">Programming Surface Chemistry with Engineered Cells.</a> ACS Synth. Biol. , (2016).</li>
<li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+graphene+oxide+films+used+as+matrix+of+MALDI-TOF-MS+for+detection+of+octachlorodibenzo-p-dioxin%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">Reduced graphene oxide films used as matrix of MALDI-TOF-MS for detection of octachlorodibenzo-p-dioxin.</a> Chem. Commun. 46, 6974-6976 (2010).</li>
<li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-Cost+Detection+of+Zika+Virus+Using+Programmable+Biomolecular+Components%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components.</a> Cell. 165, 1255-1266 (2016).</li>
<li>Bähring, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+Sensing+Properties+of+a+Self-Assembled+Supramolecular+Oligomer%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Eur.+J%22%5BJournal%5D)">Design and Sensing Properties of a Self-Assembled Supramolecular Oligomer.</a> Chem. Eur. J. 22, 1958-1967 (2016).</li>
<li>Nicolau Jr, D. V., Armitage, J. P., Maini, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directional+persistence+and+the+optimality+of+run-and-tumble+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Comp.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Directional persistence and the optimality of run-and-tumble chemotaxis.</a> Comp. Biol. Chem. 33, 269-274 (2009).</li>
<li>Du, J., Shao, Z., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+microbial+factories+for+synthesis+of+value-added+products%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Ind.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineering microbial factories for synthesis of value-added products.</a> J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 38, 873-890 (2011).</li>
<li>Kim, H., Kim, M. J. <a target="_blank" href="http://ieeexplore.ieee.org/document/7365478/">Electric Field Control of Bacteria-Powered Microrobots Using a Static Obstacle Avoidance Algorithm.</a> IEEE Trans. Rob. 32, 125-137 (2016).</li>
<li>Gardner, T. S., Cantor, C. R., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+genetic+toggle+switch+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Construction of a genetic toggle switch in Escherichia coli.</a> Nature. 403, 339-342 (2000).</li>
<li>Heyde, K. C., Ruder, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+Host-Microbiome+Interactions+using+an+in+Silico+Model+of+Biomimetic+Robots+and+Engineered+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Exploring Host-Microbiome Interactions using an in Silico Model of Biomimetic Robots and Engineered Living Cells.</a> Sci. Rep. 5, 11988(2015).</li>
<li>Rice, M. K., Ruder, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+biological+nanomaterials+using+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Tech.+Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Creating biological nanomaterials using synthetic biology.</a> Sci. Tech. Adv. Mater. 15, 014401(2014).</li>
<li>Green, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avidin.+3.+The+nature+of+the+biotin-binding+site%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Avidin. 3. The nature of the biotin-binding site.</a> Biochem. J. 89, 599-609 (1963).</li>
<li>Mesulam, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetramethyl+benzidine+for+horseradish+peroxidase+neurohistochemistry%3A+a+non-carcinogenic+blue+reaction+product+with+superior+sensitivity+for+visualizing+neural+afferents+and+efferents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Tetramethyl benzidine for horseradish peroxidase neurohistochemistry: a non-carcinogenic blue reaction product with superior sensitivity for visualizing neural afferents and efferents.</a> J Histochem. Cytochem. 26, 106-117 (1978).</li>
<li>Litcofsky, K. D., Afeyan, R. B., Krom, R. J., Khalil, A. S., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iterative+plug-and-play+methodology+for+constructing+and+modifying+synthetic+gene+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">Iterative plug-and-play methodology for constructing and modifying synthetic gene networks.</a> Nat. Meth. 9, 1077-1080 (2012).</li>
<li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+Chemical+Synthesis%2C+Assembly%2C+and+Cloning+of+a+Mycoplasma+genitalium+Genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Complete Chemical Synthesis, Assembly, and Cloning of a Mycoplasma genitalium Genome.</a> Science. 319, 1215-1220 (2008).</li>
<li>Diamandis, E. P., Christopoulos, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biotin-%28strept%29avidin+system%3A+principles+and+applications+in+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">The biotin-(strept)avidin system: principles and applications in biotechnology.</a> Clin. Chem. 37, 625-636 (1991).</li>
<li>Nerurkar, L. S., Namba, M., Brashears, G., Jacob,, Lee, A. J., Sever, Y. J., L, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+of+herpes+simplex+virus+in+clinical+specimens+by+use+of+capture+biotin-streptavidin+enzyme-linked+immunosorbent+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Micro%22%5BJournal%5D)">Rapid detection of herpes simplex virus in clinical specimens by use of capture biotin-streptavidin enzyme-linked immunosorbent assay.</a> J. Clin. Micro. 20, 109-114 (1984).</li>
<li>Cui, Y., Wei, Q., Park, H., Lieber, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanowire+Nanosensors+for+Highly+Sensitive+and+Selective+Detection+of+Biological+and+Chemical+Species%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nanowire Nanosensors for Highly Sensitive and Selective Detection of Biological and Chemical Species.</a> Science. 293, 1289-1292 (2001).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Abbiamo presentato una nuova strategia per l&#39;interfacciamento cellule ingegnerizzate vive con una superficie del materiale funzionalizzato. Ciò è stato realizzato attraverso lo sviluppo di una linea cellulare in grado di sintetizzare livelli elevati di biotina quando indotta con IPTG. Gli elevati livelli di biotina possono poi essere utilizzati per modificare la superficie funzionalizzata. I protocolli dettagliati come ingegnere alla linea di cellule di E. coli e come creare due superfici funzionalizzate di...

Qui, si riportano le procedure per sviluppare un substrato programmabile capace di rispondere ad un segnale chimico da una linea cellulare ingegnerizzata. 1 Facciamo questo con la creazione di una interfaccia biotina-streptavidina che risponde alla biotina prodotta da coli sinteticamente ingegnerizzato Escherichia (E. coli) cellule. In precedenza, le superfici programmabili sono stati progettati per una vasta gamma di applicazioni, dalla rilevazione della tossina 2 e point-of-care diagnosi 3 di difesa e sicurezza. 4 Mentre superfici programmabili possono essere utili come sensori e attuatori, possono essere fatti &quot;intelligenti&quot; di dotandoli la capacità di adattarsi a differenti sfide ambientali. Al contrario, anche microrganismi semplici, come E. coli, hanno adattabilità intrinseca e sono in grado di rispondere alle sfide con soluzioni sofisticate e spesso inaspettati. Questa capacità di adattamento ha permesso E.popolazioni coli, controllate dai loro reti geniche complesse, a costi contenuti cercare risorse, 5 creare prodotti a valore aggiunto, 6 e perfino la robotica micro-scala di potenza. 7 Accoppiando i vantaggi adattivi di cellule viventi con l&#39;uso di superfici programmabili, possiamo creare un substrato intelligente in grado di rispondere alle diverse condizioni ambientali. Biologia sintetica ha dato ricercatori nuove capacità di programmare il comportamento degli organismi viventi. Da Engineering cellule di contenere reti di regolazione nuovo gene, i ricercatori possono progettare le cellule che presentano una serie di comportamenti programmati. 8, 9 Al di là della ricerca di base, questi comportamenti possono essere utilizzati per applicazioni come il controllo assemblaggio materiale e biologicamente la produzione di prodotti a valore aggiunto. 10 Qui, abbiamo dettaglio come abbiamo utilizzato gli strumenti della biologia sintetica per itgineer un ceppo di E. coli che sintetizza biotina su di induzione. Questo ceppo è stato sviluppato utilizzando metodi enzima di restrizione di clonazione per assemblare un plasmide, pKE1-lacI-bioB. Questo plasmide, quando trasformato in ceppo di E. coli K-12 MG1655, conferisce cellule con la capacità di esprimere livelli elevati di bioB, un enzima essenziale per la sintesi biotina. Quando le cellule trasformate sono state indotte con isopropil β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) e provvisto di un precursore biotina, desthiobiotin (DTB), sono stati prodotti livelli elevati di biotina. interazione Legame di biotina con streptavidina è uno dei più forti legami non covalenti presenti in natura. Come tale, l&#39;interazione biotina-streptavidina è sia ben caratterizzati e altamente impiegati in biotecnologia. 11 All&#39;interno di questo manoscritto, presentiamo due strategie che impiegano l&#39;interazione biotina-streptavidina per rilevare e rilevare biotina cellule-prodotto con una superficie funzionalizzata. Noifare riferimento a queste superfici contrastanti come schemi di controllo &quot;diretto&quot; &quot;indiretti&quot; e. Nello schema controllo indiretto, biotina cellule prodotte compete con biotina che è stato coniugato e immobilizzato su una superficie polistirolo da streptavidina siti di legame. Inoltre, la streptavidina è coniugato con perossidasi di rafano (HRP). HRP modifica 3, 3 &#39;, 5, 5&#39;-tetrametilbenzidina (TMB), per produrre un segnale ottico, 12 che possono essere monitorato quantificando l&#39;assorbanza spettrale (cioè, densità ottica) a 450 nm (OD 450). Così, il sistema di controllo indiretto consente ai ricercatori di misurare biotina cellule-prodotto dal monitoraggio del attentuation del segnale OD 450. Lo schema di controllo diretto sfrutta l&#39;evento streptavidina-biotina immobilizzando streptavidina direttamente ad una superficie del materiale e consentendo biotina cellule prodotte e HRP biotinilato a competere per streptavidina siti di legame. Ancora una volta, lalivelli relativi di biotina cellule prodotte sono monitorati misurando un segnale OD 450. Nel loro insieme, le cellule ingegnerizzate e le superfici funzionalizzate ci permettono di controllare le proprietà di una superficie programmabili inducendo reti nelle cellule viventi. In altre parole, abbiamo creato un sistema che sfrutta l&#39;adattabilità degli organismi viventi e l&#39;affidabilità e la specificazione di un&#39;interfaccia materiale ingegnerizzato collegando questi sistemi.

<table><tbody><tr><td>LB Brodo, Miller&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-795-027</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9744500</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillina&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP26481</td><td></td></tr><tr><td>M9, sali minimi, 5x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6030</td><td></td></tr><tr><td>acidi casaimino.</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1424-100</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di magnesio, Anidro</td><td>Fisher Scientific</td><td>M65-500</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio, Diidrato</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>Destrosio (D-glucosio), Anidro</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>NEB Turbo Cell Line</td><td>New England Biolabs</td><td>C2984l</td><td></td></tr><tr><td>Oligonucleotide Primer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td>25N sintesi, purificazione DSL</td></tr><tr><td>Q5 Polimerasi ad alta fedeltà</td><td>New England Biolabs</td><td>M0491S</td><td></td></tr><tr><td>Q5 Tampone di reazione</td><td>New England Biolabs</td><td>B9027S</td><td></td></tr><tr><td>dNTP Solution Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447S</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>Bioexpress</td><td>E-3120-125</td><td></td></tr><tr><td>Etidio Bromuro, 1%</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1302-10</td><td></td></tr><tr><td>Kit di estrazione su gel</td><td>Epoch Biolabs</td><td>2260250</td><td></td></tr><tr><td>Kit di minipreparazione del DNA plasmidico GenCatch</td><td>Epoch Biolabs</td><td>2160250</td><td></td></tr><tr><td>AatII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0117S</td><td></td></tr><tr><td>SacII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0157S</td><td></td></tr><tr><td>HindIII-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3104S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3101S</td><td></td></tr><tr><td>Cutsmart Buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>B7204S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligasi</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligasi Reaction Buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>B0202S</td><td></td></tr><tr><td>ColiRolle Glass Plating Beads&nbsp;</td><td>EMD Millipore</td><td>7101-3</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>Isopropil &beta;-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1755-10</td><td></td></tr><tr><td>NHS-Destiobiotin (DTB)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16129</td><td></td></tr><tr><td>Succinimidil Trans-4-(maleimidilmetil) Cicloesano-1-carbossilato (SMCC)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S1534</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil solfossido (DMSO)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>Succinimidil 3-(2-piridilditio) propionato (SPDP)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S1531</td><td></td></tr><tr><td>NHS-LC-LC-biotina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21343</td><td></td></tr><tr><td>Perossidasi di rafano (HRP)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31490</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), 10x Soluzione</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399500</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidina (SA)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21145</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitolo (DTT)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP172-5</td><td></td></tr><tr><td>Acido etilendiamminotetaacetico (EDTA)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S311-500</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>T164-500</td><td></td></tr><tr><td>Perossido di idrogeno</td><td>Fisher Scientific</td><td>H325-4</td><td></td></tr><tr><td>3, 3', 5, 5'-tetrametilbenzidina (TMB)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC229280050</td><td></td></tr><tr><td>Concentratori centrifughi Vivaspin 500</td><td>Viva Products</td><td>VS0192</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di sodio, anidro</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP333-500</td><td></td></tr><tr><td>Piastre in polistirene a 96 pozzetti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>266120</td><td></td></tr></tbody></table>

utilizzando biologia sintetica per ingegnere cellule viventi che si interfacciano con materiali programmabili

Using Synthetic Biology to Engineer Living Cells That Interface with Programmable Materials

Abbiamo sviluppato un&#39;interfaccia abiotico-biotici che permette alle cellule ingegnerizzate per controllare le proprietà del materiale di una superficie funzionalizzata. Questo sistema è composto creando due moduli: un ceppo sinteticamente stratificato di cellule di E. coli e un&#39;interfaccia materiale funzionalizzato. All&#39;interno di questo documento, i dettagli di un protocollo per l&#39;ingegneria genetica comportamenti selezionati all&#39;interno di un ceppo di E. coli che utilizzano strategie di clonazione molecolare. Una volta sviluppato, questo ceppo produce livelli elevati di biotina quando esposti ad un induttore chimico. Inoltre, noi dettaglio protocolli per creare due superfici funzionalizzate differenti, ognuno dei quali è in grado di rispondere alla biotina cellule sintetizzato. Nel loro insieme, presentiamo una metodologia per la creazione di un sistema collegato, abiotici-biotici che permette progettato cellule per controllare la composizione dei materiali e il montaggio su substrati non viventi.

Risultati rappresentativi sono presentati nelle cinque figure allegate. In primo luogo, vi presentiamo il processo di clonazione verrà visualizzata graficamente (figura 1), in modo che il lettore possa seguire visivamente i passaggi critici per la creazione del sinteticamente ingegnerizzato ceppo di E. coli. Per caratterizzare la dinamica di popolazione delle cellule, forniamo una curva di crescita (figura 2) generato misurando la densità ottica...

Questo documento presenta una serie di protocolli per lo sviluppo di cellule ingegnerizzate e superfici funzionalizzate che consentono sinteticamente progettati E. coli di controllare e manipolare superfici materiche programmabili.

Utilizzando biologia sintetica per Ingegnere cellule viventi che si interfacciano con materiali programmabili

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is ...

L'obiettivo generale di queste procedure è utilizzare E.coli ingegnerizzati sinteticamente per controllare e manipolare superfici di materiali programmabili combinando strategie di modificazione genetica e funzionalizzazione delle superfici. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali in campi come la medicina molecolare e il monitoraggio ambientale. Utilizzando cellule programmate geneticamente per interpretare un ambiente locale e modificare di conseguenza un materiale funzionalizzato, forniamo uno strumento modulare per una vasta gamma di applicazioni.Il principale vantaggio di questa tecnica è che le cellule vive sono in grado di agire come sensori dinamici capaci di leggere, elaborare e registrare le condizioni circostanti attraverso interfacce funzionalizzate. Dopo aver preparato le soluzioni e aver raccolto il surnatante arricchito in biotina da E.coli produttore di biotina secondo il protocollo descritto nel testo, aggiungere 1,4 microlitri di soluzione SPDP a 20 microlitri di soluzione di streptavidina (SA). Avvolgere il tubo nella pellicola di alluminio e incubare a temperatura ambiente per un'ora e mezza, consentendo al cross linker SPDP di legarsi

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