Identificazione di Plant proteine ​​Ice vincolante attraverso la valutazione di Ice-ricristallizzazione inibizione e isolanti Utilizzando Ice-affinità Purificazione

L'obiettivo generale di questo protocollo è identificare nuove proteine leganti il ghiaccio o IBP dalle piante testando l'attività di legame del ghiaccio e isolando i peptidi nativi utilizzando la purificazione di affinità del ghiaccio. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della tolleranza al gelo delle piante, in particolare delle proteine che legano il ghiaccio. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente di isolare le proteine che legano il ghiaccio dagli estratti nativi senza l'uso di complicati metodi di purificazione.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché la configurazione dell'apparato può essere difficile da concettualizzare. Iniziare questo protocollo con la configurazione dell'apparato splat come descritto nel protocollo di testo. Per indurre l'espressione di proteine leganti il ghiaccio, o IBP, in erbe resistenti al gelo o altre specie vegetali tolleranti al gelo, le piante si acclimatano al freddo per un massimo di una settimana a quattro gradi Celsius in condizioni di scarsa illuminazione.

Ottenere circa 0,1 grammi di tessuto fogliare tagliando alla base del fusto e poi mettendolo in un tubo da 1,5 millilitri. Congelare immediatamente il campione in azoto liquido e conservarlo a meno 80 gradi Celsius fino al momento dell'uso. Per lisare le cellule, macinare il campione di tessuto in una polvere fine usando un mortaio e un pestello sotto azoto liquido.

Assicurarsi che l'azoto liquido non evapori durante il processo di omogeneizzazione. Posizionare immediatamente i campioni macinati sul ghiaccio e lasciare evaporare completamente l'azoto liquido. Quindi aggiungere un millilitro di un tampone nativo per l'estrazione delle proteine e una pipetta per mescolare.

Agitare delicatamente i campioni durante la notte a quattro gradi Celsius ed eseguire i passaggi rimanenti alla stessa temperatura. Il giorno successivo, rimuovere i detriti cellulari centrifugando i campioni a circa 1.600 volte G per cinque minuti. Trattenere la frazione solubile e centrifugare per altri cinque minuti se i detriti cellulari persistono.

I campioni chiarificati possono essere conservati a meno 20 gradi Celsius fino all'uso. Versare 100 millilitri di esano nella camera esterna allestita con la pellicola polarizzata e aggiungere da cinque a sei perle di essiccazione per evitare l'accumulo di umidità sui vetrini. Quindi aggiungere una piccola quantità di grasso per vuoto alla piastra che copre il bagno e torcere per garantire una tenuta ermetica e prevenire l'evaporazione dell'esano.

40 minuti prima di iniziare l'esperimento, posizionare il blocco di raffreddamento in una scatola di polistirolo direttamente sotto il tubo di plastica e coprirlo completamente con ghiaccio secco. Prima di iniziare il test, assicurarsi che la provetta sia in piano. Quindi rimuovere il ghiaccio secco dalla parte superiore del blocco freddo.

Innanzitutto, testare questa procedura con acqua per determinare dove cadrà il campione sul blocco di raffreddamento. Immergere il puntale monouso apposto su una pipetta automatica in olio da immersione, che consentirà al campione di cadere anziché aderire all'esterno della pipetta. Usa un tovagliolo di carta per rimuovere l'olio in eccesso.

Aspirare quindi 10 microlitri di acqua. Posizionare la pipetta direttamente sopra il tubo di plastica prima di rilasciare l'acqua. Quando l'acqua colpisce il blocco di raffreddamento, si dovrebbe sentire un suono distinto di splat, creando un monostrato di cristalli di ghiaccio.

Quindi, posizionare un vetrino di copertura del microscopio sul segno di goccia che è stato determinato con acqua. Immediatamente prima di iniziare il test, accendere la fonte di luce e raschiare il ghiaccio che si è formato sul fondo della camera di vetro. Quindi eseguire il saggio splat con il campione, come fatto per l'acqua, rilasciando 10 microlitri di campione sul vetrino di copertura per creare un monostrato di cristalli di ghiaccio.

Rimuovere rapidamente e con attenzione il vetrino del microscopio dal blocco freddo utilizzando una pinzetta e posizionarlo nel bagno di esano sopra la pellicola polarizzante. Guardando sotto il microscopio, inserire il vetrino del microscopio nel campo visivo e regolare la lente dell'obiettivo in modo che la polarizzazione incrociata consenta la visualizzazione di cristalli di ghiaccio ad alto contrasto. Collegare la fotocamera al microscopio e regolare le impostazioni su macro per consentire una visualizzazione chiara dei cristalli di ghiaccio e acquisire l'immagine.

Ripetere questi passaggi per tutti i campioni. In genere si posizionano fino a sei vetrini con un campione diverso nella camera dell'esano. Una volta terminato, spegnere la fonte di luce.

Quindi posizionare una piastra di plastica sopra il bagno di esano, assicurando una tenuta ermetica, e lasciare che i cristalli di ghiaccio si ricottino durante la notte. Dopo l'incubazione, catturare le immagini delle pellicole di ghiaccio come prima. Dopo aver acclimatato a freddo il tessuto vegetale come prima, raccogliere circa 100-150 grammi di biomassa macinata in provette da 20 millilitri.

Congelare immediatamente i campioni e mantenerli a meno 80 gradi Celsius prima dell'uso. Preparare il campione come prima, utilizzando un rapporto uno a uno per la risospensione del tessuto fogliare. Utilizzare ulteriori compresse di inibitori della proteasi per evitare la degradazione delle IBP da parte delle proteasi endogene.

Per rimuovere i detriti cellulari, setacciare il lisato attraverso due strati di garza tre volte. Pellettare i detriti mediante centrifugazione a 30.000 volte G per 40 minuti a quattro gradi Celsius. Quindi aumentare il volume del campione a 120 millilitri utilizzando il tampone di estrazione proteica nativo e utilizzare immediatamente la lisade per la purificazione dell'affinità del ghiaccio per evitare qualsiasi perdita di attività di legame del ghiaccio.

Dopo aver raffreddato il dito di ghiaccio a meno 0,5 gradi Celsius, immergerlo successivamente in un tubo da 50 millilitri contenente acqua distillata fredda. Aggiungere alcune scaglie di ghiaccio per facilitare la nucleazione del ghiaccio e lasciare che si formi un sottile strato di ghiaccio sul dito. Questo processo richiede in genere tra i 20 e i 30 minuti.

Posizionare il campione in un becher di vetro da 150 millilitri contenente una piccola ancoretta magnetica, che viene posta in un contenitore di polistirene sopra l'agitatore magnetico. Assicurarsi che il dito di ghiaccio sia centrato e abbassato almeno a metà nel campione liquido. Quindi sigillare il contenitore.

Lasciare che il programma venga eseguito per circa due giorni, controllando ogni 24 ore. Una volta che il 50% del campione è congelato, interrompere il programma. L'incorporazione di IBP nell'emisfero di ghiaccio comporterà l'incisione del ghiaccio.

Per rimuovere l'emisfero di ghiaccio, riscaldare la sonda a quattro gradi Celsius. Quindi sciacquare l'emisfero con acqua distillata per rimuovere le proteine non legate e scongelare a quattro gradi Celsius. Se l'emisfero di ghiaccio contiene ancora pigmento, o per aumentare la purificazione del campione, ripetere i passaggi di purificazione due o tre volte.

Qui sono mostrati estratti raccolti da un controllo tampone privo di IBP ed estratti da Arabidopsis thaliana wild-type che non contengono IBP. Dopo 18 ore, il controllo del tampone e gli estratti di A.thaliana non sono in grado di limitare la crescita dei cristalli di ghiaccio. Al contrario, i piccoli cristalli di ghiaccio osservati con estratti di A. thaliana transgenica che esprimono BP da Lolium perenne acclimatato al freddo limitano sostanzialmente la crescita dei cristalli di ghiaccio.

Dopo il primo ciclo di purificazione, l'alto grado di incisione del ghiaccio sulla superficie dell'emisfero indica che i BP si sono adsorbiti sul ghiaccio e hanno modificato la crescita dei cristalli di ghiaccio. Per rimuovere ulteriori soluti, pigmenti e proteine contaminanti, è stato utilizzato un secondo ciclo di affinità per il ghiaccio, ottenendo un emisfero di ghiaccio più chiaro. Seguendo questa procedura, la formatura del ghiaccio e l'isteresi termica possono essere valutate utilizzando un osmometro nanolitro al fine di caratterizzare ulteriormente le proteine leganti il ghiaccio.

Inoltre, le frazioni isolate possono essere inviate per la spettrometria di massa al fine di identificare le sequenze peptidiche.