Hemi-laringeo Setup per lo studio delle vibrazioni del popolare vocale in tre dimensioni
25 novembre 2017
Questo documento introduce un protocollo per la preparazione di campioni di hemi-laringe facilitando una vista multi-dimensionale di vibrazione del popolare vocale, al fine di indagare i vari aspetti biofisici della produzione vocale negli esseri umani e non umani mammiferi.
Per capire come si crea la voce umana e dei mammiferi, è importante indagare le vibrazioni delle corde vocali. Poiché sono difficili da studiare all'interno del corpo, le laringi asportate sono state utilizzate per ottenere informazioni più dettagliate sul comportamento e sulle proprietà delle corde vocali. In questo video, dimostriamo come creare una cosiddetta configurazione emi-laringe.
Una metà della laringe viene rimossa per visualizzare la vibrazione delle corde vocali non solo dall'alto ma anche lateralmente. Questo è utile per studiare le caratteristiche vibratorie che rimangono nascoste in una configurazione convenzionale utilizzando un'intera laringe. In questa dimostrazione verrà utilizzata la laringe di un cervo rosso.
Poiché i campioni di laringe utilizzati vengono solitamente congelati in azoto liquido e conservati in congelatore, è necessario scongelare correttamente il campione scelto per non alterare le proprietà biomeccaniche del tessuto. Per prima cosa, inserisci la laringe congelata in un'autoclave a doppia piega o in qualsiasi altro sacchetto di plastica con sigillatura impermeabile. Aggiungi anche un peso, che aiuta a mantenere la laringe sotto la superficie dell'acqua.
Sigillare il sacchetto e metterlo a bagnomaria con una temperatura di circa 30 gradi Celsius fino a quando la laringe non sarà completamente scongelata. Dopo che la laringe è completamente scongelata, estrarla dal sacchetto e pulirla accuratamente con una soluzione salina. Se presenti, rimuovere le strutture superflue come i muscoli esterni del collo o l'osso ioide.
Per alcune questioni di ricerca bioacustica, le strutture sopralaringee potrebbero essere mantenute intatte, il che tuttavia limita la visibilità delle corde vocali dall'alto. Accorciare la trachea a una lunghezza di circa 45 centimetri in modo che possa essere utilizzata in seguito per montare la laringe su un tubo di alimentazione dell'aria. Prima di procedere con la preparazione, controllare sempre la laringe per eventuali anomalie tissutali e occasionalmente comparsa di crepe introdotte durante il processo di congelamento rapido.
Il passo successivo prevede l'esposizione di metà della cartilagine tiroidea. Per prima cosa, rimuovi i muscoli laringei esterni usando un bisturi. Iniziare la procedura di taglio con un taglio verticale iniziale attraverso la parte anteriore della cartilagine tiroidea.
Condurre con cura il taglio più sul lato che deve essere rimosso per evitare danni alla corda vocale che deve essere preservata e studiata. Se la cartilagine è troppo rigida a causa dell'ossificazione, utilizzare una piccola sega. Quindi, tagliare la cartilagine cricoidea a metà strada.
Creare l'incisione verticalmente tra le cartilagini aritenoidi e fermarsi approssimativamente e il livello orizzontale della tacca tiroidea inferiore. Collegare entrambe le incisioni praticando un taglio orizzontale partendo dall'estremità inferiore dell'incisione verticale nella cartilagine cricoidea e portare il taglio verso la tacca tiroidea inferiore. Piegare il lato della laringe che sta per essere rimosso verso l'estremità anteriore e fare un taglio verticale attraverso il tessuto molle sul lato interno della cartilagine tiroidea.
Questo è il momento più cruciale dell'intera procedura. Pertanto, prestare la massima attenzione quando si crea l'incisione dall'attacco anteriore delle corde vocali alla cartilagine tiroidea. Se la cartilagine tiroidea viene sezionata correttamente, la glottide risultante conterrà sempre un leggero spazio anteriore.
Al fine di esporre le corde vocali per ottenere una buona visione superiore, a volte è utile rimuovere anche le strutture sopra le corde vocali. In alcuni casi, i tessuti laringei molli interni perdono la loro connessione con la cartilagine tiroidea dopo la procedura di taglio e interferiscono con la corda vocale. In tal caso, la rimozione di questo tessuto superfluo è inevitabile.
Infine, asportare una piccola parte della cartilagine tiroidea posteriore in modo da facilitare l'adduzione delle corde vocali attraverso gli aritenoidi. La laringe ha ora un mortas a forma di L che corrisponde alla disposizione della piastra di classe a forma di L utilizzata nella configurazione. Il lato sinistro dell'emilaringe fornisce una vista mediale in cui sono visibili le incisioni nella tiroide e nella cartilagine cricoidea, insieme alla rana vocale rimanente e alla cartilagine aritenoide.
Il setup sperimentale per gli emilaringi si compone di tre parti fondamentali. Un tubo di alimentazione dell'aria che eroga aria riscaldata e umidificata nella laringe. Successivamente due placche trasparenti in sostituzione delle parti laringee rimosse e i rebbi per l'adduzione della corda vocale studiata e la stabilizzazione della laringe.
Ora monteremo la laringe sul tubo di alimentazione dell'aria. Coprire il tubo con la crema fissativa per protesi e montare la laringe utilizzando la trachea. La crema fissativa per protesi funziona come adesivo e sigilla eventuali spazi vuoti.
Fissare la trachea con una cinghia di plastica stretta o un altro morsetto utile. Coprire anche i bordi del taglio con la crema fissativa per protesi e attaccare le placche trasparenti. Stabilizzare la cartilagine tiroidea e addotti la corda vocale utilizzando i rebbi.
In questa fase, la configurazione emi-laringea è pronta per l'uso. Applicare il flusso d'aria e verificare la presenza di eventuali perdite. Se l'aria fuoriesce lateralmente, sigillare le fessure aggiungendo altra crema fissativa.
Per vedere le vibrazioni delle corde vocali in tempo reale, è possibile applicare la luce stroboscopica. L'applicazione principale della configurazione emi-laringe è quella di osservare la vibrazione delle corde vocali non solo dall'alto ma anche lateralmente. A tale scopo, vengono utilizzate due videocamere sincronizzate ad alta velocità.
Uno per la vista dall'alto e uno per la vista laterale. Qui vediamo la vibrazione delle corde vocali dell'emi-laringe documentata dalle due telecamere sincronizzate che girano a 6.000 fotogrammi al secondo. Il pannello di sinistra mostra la vista dall'alto e il pannello di destra mostra la vista laterale.
La corda vocale vibra alla velocità di circa 70 cicli al secondo e i video catturati vengono mostrati qui al rallentatore. Lo spazio tra la corda vocale e la lastra di vetro è chiamato glottide. Può essere quantificato misurando la sua area man mano che cambia nel tempo.
In questo caso, l'area glottidale è espressa in pixel. È zero quando la corda vocale è a contatto con la lastra di vetro e diverso da zero quando l'aria scorre attraverso la glottide. L'analisi del segnale acustico risultante dal processo di vibrazione delle corde vocali nell'emi-laringe mostra che i principali eventi di eccitazione acustica si verificano in due istanze durante un ciclo vibratorio.
Al momento dell'apertura della glottide, quando la corda vocale perde il contatto con la lastra di vetro e al momento della chiusura glottica quando la corda vocale ha nuovamente raggiunto il pieno contatto con la lastra di vetro. Nell'animazione successiva, l'area di contatto variabile nel tempo della corda vocale con la lastra di vetro viene mostrata in arancione per un ciclo vibratorio. Qui, la configurazione dell'emi-laringe viene utilizzata per convalidare un metodo chiamato elettroglottografia o EGG.
Il segnale EGG acquisito simultaneamente è mostrato qui in blu. Esiste una correlazione ragionevolmente buona tra l'area di contatto delle corde vocali e il segnale EGG. Questo è documentato in modo più dettagliato in un recente studio del nostro gruppo.
Nell'ultima sezione di questo video, introduciamo un nuovo metodo per valutare la vibrazione delle corde vocali in tre dimensioni chiamato analisi chemiografica del movimento glottidale. In un chemiogramma digitale, le informazioni sull'immagine che si trovano lungo una linea all'interno di un video ad alta velocità vengono valutate per ogni fotogramma video e tracciate da sinistra a destra. Il chemiogramma risultante mostra il movimento della struttura delle corde vocali lungo la linea di scansione mentre si sviluppa nel tempo.
I chemiogrammi vengono generati sia per la vista dall'alto che per quella laterale con le linee di scansione chemiografiche posizionate esattamente al centro della corda vocale. Viene tracciato l'offset temporale dei bordi delle corde vocali. Il grafico azzurro mostra la deflessione laterale della corda vocale e i grafici rosso e verde mostrano la deflessione verticale rispettivamente del bordo inferiore e superiore della corda vocale.
Le informazioni risultanti possono essere combinate per sintetizzare un'animazione che mostra il movimento della glottide in due dimensioni, come si vede sulla linea mediana della glottide. In questo video, abbiamo fornito un tutorial per la creazione di una configurazione emi-laringe. Abbiamo mostrato alcune potenziali applicazioni per valutare la vibrazione delle corde vocali non solo dall'alto ma anche lateralmente, aggiungendo così dati empirici cruciali per una migliore comprensione di un aspetto chiave della generazione della voce.
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Panoramica
In questo articolo viene presentato un protocollo per la preparazione di campioni di emilaringe che permette una visione multidimensionale della vibrazione delle corde vocali. Questo approccio consente lo studio di diversi aspetti biofisici della produzione della voce negli esseri umani e nei mammiferi non umani.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biophysica
- Vocalizzazione
Sfondo
- Comprendere le vibrazioni delle corde vocali è fondamentale per lo studio della produzione della voce.
- I laringi escissi forniscono informazioni dettagliate sul comportamento delle corde vocali.
- Le configurazioni convenzionali possono oscurare caratteristiche vibratori importanti.
- Le configurazioni a emi-laringe permettono la visualizzazione da più angolazioni.
Scopo dello studio
- Sviluppare un protocollo per la preparazione dell'emilaringe.
- Migliorare la comprensione delle vibrazioni delle corde vocali.
- Favorire studi comparativi tra esseri umani e mammiferi non umani.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di campioni di emilaringe.
- Visualizzazione delle vibrazioni delle corde vocali dall'alto e dal lato.
- Utilizzo di una laringe di cervo rosso ai fini dimostrativi.
- Analisi delle caratteristiche vibratorie in un ambiente controllato.
Risultati principali
- L'allestimento dell'emilaringe fornisce una visione più chiara della dinamica delle corde vocali.
- È possibile osservare caratteristiche vibratori fondamentali che risultano nascoste negli allestimenti con laringe completo.
- Questo metodo migliora la comprensione dei meccanismi di produzione della voce.
- I risultati possono essere applicati a studi vocali sia umani che non umani.
Conclusioni
- La preparazione dell'emilaringe è uno strumento prezioso per la ricerca sulle corde vocali.
- Questo approccio può portare a nuove intuizioni sulla produzione della voce.
- Studi futuri potranno sfruttare questo metodo per analisi comparative.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Comprendere la biomeccanica delle corde vocali è fondamentale per ridurre i rischi nella validazione degli obiettivi nello sviluppo di terapie per disturbi della voce, in particolare per quelli che coinvolgono il controllo neuromuscolare o l'elasticità dei tessuti. Il setup dell'emilaringe permette un'osservazione tridimensionale della dinamica vibratoria, fornendo dati quantitativi e riproducibili che supportano una riduzione del rischio di natura meccanicistica nei modelli preclinici. Questo approccio aumenta la fiducia predittiva collegando osservazioni strutturali a risultati funzionali, guidando le decisioni di avanzamento o interruzione nei primi stadi dei processi di scoperta.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette l'analisi dei meccanismi di vibrazione delle corde vocali in condizioni fisiologiche controllate, supportando la verifica di ipotesi specifiche.
- Valore operativo: Fornisce un modello tissutale asportato riproducibile per valutare le proprietà biomeccaniche del tessuto vocale.
- Valore traslazionale: Consente il confronto interspecifico, facilitando la selezione di modelli preclinici pertinenti per i disturbi della voce umana.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Genera output quantificabili come l'area glottica e l'area di contatto nel tempo, consentendo una valutazione oggettiva della funzione vibratoria.
- Valore operativo: Favorisce la standardizzazione dei saggi mediante acquisizione sincronizzata ad alta velocità e procedure di montaggio definite.
- Valore traslazionale: Produce dataset ripetibili e multiview adatti alla valutazione di interventi che influenzano la dinamica delle corde vocali.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Consente la validazione di biomarcatori surrogati come l'elettroglottografia (EGG) correlando i modelli di vibrazione ai segnali elettrici.
- Valore operativo: Permette la valutazione longitudinale della risposta del tessuto a manipolazioni farmacologiche o genetiche in preparati escissi.
- Valore traslazionale: Collega i risultati ottenuti ex vivo alla funzione in vivo attraverso un'analisi dettagliata del movimento, supportando la modellizzazione predittiva.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
L'allestimento dell'emilaringe si integra nei flussi di lavoro della fase iniziale di scoperta come strumento di screening fenotipico per bersagli legati alla voce, fornendo letture meccanicistiche che guidano l'identificazione dei composti promettenti e il progresso preclinico.
- Biologia della scoperta: Supporta test basati su ipotesi sulla biomeccanica delle corde vocali consentendo l'osservazione diretta del comportamento oscillatorio sotto stimolazione del flusso d'aria.
- Screening: Fornisce metriche quantitative standardizzate del vibrazione (ad esempio, area glottica, tempo di contatto) essenziali per confrontare diverse condizioni sperimentali.
- Analisi dati: Permette l'analisi chemografica del movimento glottico, sintetizzando dati multidimensionali sulla vibrazione in modelli spaziotemporali analizzabili.
- Ricerca traslazionale: Collega i profili vibratori ex vivo a potenziali biomarcatori clinici attraverso la correlazione con segnali elettroglottografici.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per la valutazione della funzione delle corde vocali in diverse specie, composti e modelli di malattia.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica nei modelli di produzione della voce rivelando caratteristiche vibratorie nascoste non visibili nei setup convenzionali.
- Valore operativo: Garantisce la riproducibilità attraverso protocolli standardizzati di scongelamento, montaggio e acquisizione immagini mediante cattura sincronizzata ad alta velocità.
- Valore strategico: Migliora la sicurezza nelle decisioni di avanzamento o interruzione fornendo dati empirici multidimensionali sull'interazione con il bersaglio e sulla risposta del tessuto.
- Impatto sul portafoglio: Permette una prioritizzazione dei candidati mirati alla voce aggiustata in base al rischio, basata su un'attività biomeccanica validata.
Considerazioni per l'Implementazione
- Richiede competenze nelle tecniche di dissezione e nell'identificazione istologica delle strutture laringee, come le cartilagini tiroidea e cricoidea.
- Presuppone l'accesso a bagni termostatati, strumenti di precisione per il taglio (bisturi, seghe) e supporti per il montaggio (tubi tracheali, piastre, forcelle).
- Necessita di protocolli standardizzati di preparazione per minimizzare il degrado del tessuto e garantire proprietà biomeccaniche costanti tra i campioni.
- Richiede l'adattamento di sistemi di imaging per acquisizioni video ad alta velocità sincronizzate con doppia vista a frequenze di acquisizione sufficienti (ad esempio, 6.000 fps) per risolvere le rapide oscillazioni delle corde vocali.
- È limitato dalla vitalità del tessuto dopo il congelamento, richiedendo esperimenti tempestivi per preservare le proprietà viscoelastiche native del tessuto delle corde vocali.
