Hemi-laringeo Setup per lo studio delle vibrazioni del popolare vocale in tre dimensioni
25 novembre 2017
Questo documento introduce un protocollo per la preparazione di campioni di hemi-laringe facilitando una vista multi-dimensionale di vibrazione del popolare vocale, al fine di indagare i vari aspetti biofisici della produzione vocale negli esseri umani e non umani mammiferi.
Per comprendere come viene prodotta la voce umana e dei mammiferi, è importante studiare le vibrazioni delle corde vocali. Poiché è difficile analizzarle all'interno del corpo, sono stati utilizzati laringi escissi per ottenere informazioni più dettagliate sul comportamento e sulle proprietà delle corde vocali. In questo video, mostriamo come creare un cosiddetto apparato emi-laringeo.
Viene rimossa una metà del laringe al fine di visualizzare la vibrazione delle corde vocali non solo dall'alto, ma anche lateralmente. Questo approccio è vantaggioso per lo studio di caratteristiche vibratorie che rimarrebbero nascoste in un allestimento convenzionale che utilizza un laringe intero. In questa dimostrazione, verrà utilizzato il laringe di un cervo rosso.
Dato che i campioni di laringe utilizzati vengono solitamente congelati rapidamente in azoto liquido e conservati nel congelatore, è necessario scongelare adeguatamente il campione scelto per non alterare le proprietà biomeccaniche del tessuto. Inserire innanzitutto la laringe congelata in un doppio sacchetto per autoclave o in qualsiasi altro sacchetto di plastica con chiusura impermeabile. Aggiungere anche un peso, che aiuta a mantenere la laringe sotto la superficie dell'acqua.
Chiudere il sacchetto ermeticamente e immergerlo in un bagno d'acqua a una temperatura di circa 30 gradi Celsius finché la laringe non si sarà scongelata completamente. Una volta scongelata del tutto, estrarre la laringe dal sacchetto e pulirla accuratamente con soluzione salina. Se presenti, rimuovere le strutture accessorie come i muscoli esterni del collo o l'osso ioide.
Per alcune domande di ricerca bioacustica, le strutture sopralaringee potrebbero essere mantenute integre, il che tuttavia limita la visibilità delle corde vocali dall'alto. Accorciare la trachea a una lunghezza di circa 45 centimetri in modo che possa essere utilizzata successivamente per montare il laringe su un tubo di alimentazione d'aria. Prima di procedere con la preparazione, controllare sempre il laringe alla ricerca di eventuali anomalie del tessuto e di crepe occasionali introdotte durante il processo di congelamento rapido.
Il passo successivo prevede l'esposizione di una metà della cartilagine tiroidea. In primo luogo, rimuovere i muscoli laringei esterni utilizzando un bisturi. Iniziare la procedura di taglio con un taglio verticale iniziale attraverso la parte anteriore della cartilagine tiroidea.
Condurre con attenzione il taglio maggiormente verso il lato che deve essere rimosso, per evitare danni alla corda vocale che deve essere preservata e studiata. Se la cartilagine è troppo rigida a causa dell'ossificazione, utilizzare un piccolo seghetto. Successivamente, tagliare la cartilagine cricoidea in senso medio-sagittale.
Creare l'incisione verticalmente a partire dallo spazio tra le cartilagini aritenoidi e fermarsi approssimativamente al livello orizzontale della scissura tiroidea inferiore. Collegare entrambe le incisioni effettuando un taglio orizzontale che inizia dall'estremità inferiore dell'incisione verticale nella cartilagine cricoidea e proseguire verso la scissura tiroidea inferiore. Ripiegare il lato del laringe che verrà rimosso verso l'estremità anteriore ed effettuare un taglio verticale attraverso il tessuto molle sulla faccia interna della cartilagine tiroidea.
Questo è il momento più cruciale dell'intero procedimento. Pertanto, siate estremamente accurati durante la creazione dell'incisione dall'attacco anteriore delle corde vocali al cartilagine tiroidea. Se il cartilagine tiroideo viene sezionato correttamente, la glottide risultante conterrà sempre un lieve spazio anteriore.
Per esporre le corde vocali e ottenere una buona vista superiore, a volte è utile rimuovere anche le strutture situate al di sopra delle corde vocali. In alcuni casi, i tessuti molli interni della laringe perdono il collegamento con la cartilagine tiroidea dopo la procedura di taglio e interferiscono con la corda vocale. In tal caso, la rimozione di questo tessuto in eccesso è inevitabile.
Infine, rimuovere una piccola parte della cartilagine tiroidea posteriore per facilitare l'adduzione delle corde vocali attraverso i cartilagini aritenoidi. La laringe presenta ora una morte a forma di L, compatibile con la disposizione a piastra a forma di L utilizzata nell'allestimento. Il lato sinistro dell'emilaringe fornisce una vista mediale in cui sono visibili le incisioni nella cartilagine tiroidea e cricoidea, insieme alla corda vocale residua e alla cartilagine aritenoidi.
L'allestimento sperimentale per gli emilaringi consiste in tre parti fondamentali. Un tubo di alimentazione dell'aria che fornisce aria riscaldata e umidificata nella laringe. Due piastre trasparenti, che sostituiscono le parti laringee rimosse, e le forcelle per l'adduzione della piega vocale studiata e la stabilizzazione della laringe.
Ora, monteremo il laringe sul tubo di alimentazione dell'aria. Coprire il tubo con crema adesiva per protesi dentaria e fissare il laringe utilizzando la sua trachea. La crema adesiva per protesi dentaria funge da collante e sigilla eventuali spazi.
Fissare la trachea con una fascetta di plastica serrata o con un altro morsetto utile. Coprire anche i bordi del taglio con la crema adesiva per protesi dentaria e fissare le lastre trasparenti. Stabilizzare il cartilagine tiroidea e addurre la corda vocale utilizzando i rebbi.
A questo punto, l'allestimento emilaringeo è pronto per l'uso. Applicare il flusso d'aria e verificare la presenza di eventuali perdite. Se l'aria fuoriesce lateralmente, sigillare le fessure aggiungendo ulteriore crema fissativa.
Per osservare le vibrazioni delle corde vocali in tempo reale, si può applicare una luce stroboscopica. L'applicazione principale del setup emi-laringeo è osservare le vibrazioni delle corde vocali non solo dall'alto, ma anche lateralmente. A tale scopo, vengono utilizzate due telecamere ad alta velocità sincronizzate.
Una per la vista dall'alto e una per la vista laterale. Qui osserviamo la vibrazione delle corde vocali dell'emilaringe documentata dalle due telecamere sincronizzate che operano a 6.000 fotogrammi al secondo. Il pannello sinistro mostra la vista dall'alto, mentre quello destro mostra la vista laterale.
Le corde vocali vibrano a una frequenza di circa 70 cicli al secondo e i video acquisiti sono mostrati qui al rallentatore. Lo spazio tra la corda vocale e la lastra di vetro è chiamato glottide. Può essere quantificato misurandone l'area mentre varia nel tempo.
Qui, questa area glottica è espressa in pixel. È pari a zero quando le corde vocali sono a contatto con la piastra di vetro e diversa da zero quando l'aria scorre attraverso la glottide. L'analisi del segnale acustico risultante dal processo di vibrazione delle corde vocali nell'emilaringe mostra che i principali eventi di eccitazione acustica si verificano in due istanti durante un ciclo vibratorio.
Nel momento dell'apertura glottica, quando la corda vocale perde il contatto con la piastra di vetro, e nel momento della chiusura glottica, quando la corda vocale ha nuovamente raggiunto un contatto completo con la piastra di vetro. Nell'animazione successiva, l'area di contatto variabile nel tempo tra la corda vocale e la piastra di vetro è mostrata in arancione per un ciclo vibratorio. Qui, il setup emilaringeo viene utilizzato per validare un metodo chiamato elettroglottografia o EGG.
Il segnale EGG acquisito contemporaneamente è mostrato qui in blu. Esiste una ragionevole correlazione tra l'area di contatto delle corde vocali e il segnale EGG. Questo è documentato in maggiore dettaglio in uno studio recente del nostro gruppo.
Nell'ultima sezione di questo video, presentiamo un nuovo metodo per valutare la vibrazione delle corde vocali in tre dimensioni chiamato analisi chemografica del movimento glottico. In un chemogramma digitale, l'informazione immagine presente lungo una linea all'interno di un video ad alta velocità viene analizzata per ogni fotogramma video e riportata da sinistra a destra. Il chemogramma risultante mostra il movimento della struttura della corda vocale lungo la linea di scansione man mano che si sviluppa nel tempo.
I chemogrammi sono generati sia per la vista superiore che laterale, con le linee di scansione chemografiche posizionate esattamente al centro della corda vocale. Viene tracciato lo sfasamento temporale dei margini delle corde vocali. Il grafico in blu chiaro mostra la deflessione laterale della corda vocale, mentre i grafici rosso e verde mostrano rispettivamente la deflessione verticale del margine inferiore e superiore della corda vocale.
Le informazioni risultanti possono essere combinate per sintetizzare un'animazione che mostri il movimento della glottide in due dimensioni, come osservato alla linea mediana glottidea. In questo video, abbiamo fornito un tutorial per la creazione di un apparato emilaringeo. Abbiamo mostrato alcune possibili applicazioni per valutare la vibrazione delle corde vocali non solo dall'alto, ma anche lateralmente, aggiungendo così dati empirici fondamentali per una migliore comprensione di un aspetto chiave della produzione della voce.
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Panoramica
In questo articolo viene presentato un protocollo per la preparazione di campioni di emilaringe che permette una visione multidimensionale della vibrazione delle corde vocali. Questo approccio consente lo studio di diversi aspetti biofisici della produzione della voce negli esseri umani e nei mammiferi non umani.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biophysica
- Vocalizzazione
Sfondo
- Comprendere le vibrazioni delle corde vocali è fondamentale per lo studio della produzione della voce.
- I laringi escissi forniscono informazioni dettagliate sul comportamento delle corde vocali.
- Le configurazioni convenzionali possono oscurare caratteristiche vibratori importanti.
- Le configurazioni a emi-laringe permettono la visualizzazione da più angolazioni.
Scopo dello studio
- Sviluppare un protocollo per la preparazione dell'emilaringe.
- Migliorare la comprensione delle vibrazioni delle corde vocali.
- Favorire studi comparativi tra esseri umani e mammiferi non umani.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di campioni di emilaringe.
- Visualizzazione delle vibrazioni delle corde vocali dall'alto e dal lato.
- Utilizzo di una laringe di cervo rosso ai fini dimostrativi.
- Analisi delle caratteristiche vibratorie in un ambiente controllato.
Risultati principali
- L'allestimento dell'emilaringe fornisce una visione più chiara della dinamica delle corde vocali.
- È possibile osservare caratteristiche vibratori fondamentali che risultano nascoste negli allestimenti con laringe completo.
- Questo metodo migliora la comprensione dei meccanismi di produzione della voce.
- I risultati possono essere applicati a studi vocali sia umani che non umani.
Conclusioni
- La preparazione dell'emilaringe è uno strumento prezioso per la ricerca sulle corde vocali.
- Questo approccio può portare a nuove intuizioni sulla produzione della voce.
- Studi futuri potranno sfruttare questo metodo per analisi comparative.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Comprendere la biomeccanica delle corde vocali è fondamentale per ridurre i rischi nella validazione degli obiettivi nello sviluppo di terapie per disturbi della voce, in particolare per quelli che coinvolgono il controllo neuromuscolare o l'elasticità dei tessuti. Il setup dell'emilaringe permette un'osservazione tridimensionale della dinamica vibratoria, fornendo dati quantitativi e riproducibili che supportano una riduzione del rischio di natura meccanicistica nei modelli preclinici. Questo approccio aumenta la fiducia predittiva collegando osservazioni strutturali a risultati funzionali, guidando le decisioni di avanzamento o interruzione nei primi stadi dei processi di scoperta.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette l'analisi dei meccanismi di vibrazione delle corde vocali in condizioni fisiologiche controllate, supportando la verifica di ipotesi specifiche.
- Valore operativo: Fornisce un modello tissutale asportato riproducibile per valutare le proprietà biomeccaniche del tessuto vocale.
- Valore traslazionale: Consente il confronto interspecifico, facilitando la selezione di modelli preclinici pertinenti per i disturbi della voce umana.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Genera output quantificabili come l'area glottica e l'area di contatto nel tempo, consentendo una valutazione oggettiva della funzione vibratoria.
- Valore operativo: Favorisce la standardizzazione dei saggi mediante acquisizione sincronizzata ad alta velocità e procedure di montaggio definite.
- Valore traslazionale: Produce dataset ripetibili e multiview adatti alla valutazione di interventi che influenzano la dinamica delle corde vocali.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Consente la validazione di biomarcatori surrogati come l'elettroglottografia (EGG) correlando i modelli di vibrazione ai segnali elettrici.
- Valore operativo: Permette la valutazione longitudinale della risposta del tessuto a manipolazioni farmacologiche o genetiche in preparati escissi.
- Valore traslazionale: Collega i risultati ottenuti ex vivo alla funzione in vivo attraverso un'analisi dettagliata del movimento, supportando la modellizzazione predittiva.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
L'allestimento dell'emilaringe si integra nei flussi di lavoro della fase iniziale di scoperta come strumento di screening fenotipico per bersagli legati alla voce, fornendo letture meccanicistiche che guidano l'identificazione dei composti promettenti e il progresso preclinico.
- Biologia della scoperta: Supporta test basati su ipotesi sulla biomeccanica delle corde vocali consentendo l'osservazione diretta del comportamento oscillatorio sotto stimolazione del flusso d'aria.
- Screening: Fornisce metriche quantitative standardizzate del vibrazione (ad esempio, area glottica, tempo di contatto) essenziali per confrontare diverse condizioni sperimentali.
- Analisi dati: Permette l'analisi chemografica del movimento glottico, sintetizzando dati multidimensionali sulla vibrazione in modelli spaziotemporali analizzabili.
- Ricerca traslazionale: Collega i profili vibratori ex vivo a potenziali biomarcatori clinici attraverso la correlazione con segnali elettroglottografici.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per la valutazione della funzione delle corde vocali in diverse specie, composti e modelli di malattia.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica nei modelli di produzione della voce rivelando caratteristiche vibratorie nascoste non visibili nei setup convenzionali.
- Valore operativo: Garantisce la riproducibilità attraverso protocolli standardizzati di scongelamento, montaggio e acquisizione immagini mediante cattura sincronizzata ad alta velocità.
- Valore strategico: Migliora la sicurezza nelle decisioni di avanzamento o interruzione fornendo dati empirici multidimensionali sull'interazione con il bersaglio e sulla risposta del tessuto.
- Impatto sul portafoglio: Permette una prioritizzazione dei candidati mirati alla voce aggiustata in base al rischio, basata su un'attività biomeccanica validata.
Considerazioni per l'Implementazione
- Richiede competenze nelle tecniche di dissezione e nell'identificazione istologica delle strutture laringee, come le cartilagini tiroidea e cricoidea.
- Presuppone l'accesso a bagni termostatati, strumenti di precisione per il taglio (bisturi, seghe) e supporti per il montaggio (tubi tracheali, piastre, forcelle).
- Necessita di protocolli standardizzati di preparazione per minimizzare il degrado del tessuto e garantire proprietà biomeccaniche costanti tra i campioni.
- Richiede l'adattamento di sistemi di imaging per acquisizioni video ad alta velocità sincronizzate con doppia vista a frequenze di acquisizione sufficienti (ad esempio, 6.000 fps) per risolvere le rapide oscillazioni delle corde vocali.
- È limitato dalla vitalità del tessuto dopo il congelamento, richiedendo esperimenti tempestivi per preservare le proprietà viscoelastiche native del tessuto delle corde vocali.
