Name: Identificazione di progenitori eritromieloidi e loro progenie nellembrione del mouse dalla citometria del flusso (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Scopri come caratterizzare i progenitori eritromieloidi del sacco vitellino e la loro progenie nell'embrione di topo usando la citometria del flusso e il sistema di fate mapping indotto da tamoxifene.

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Gli autori ringraziano Prof. Frederic Geissmann e Prof. Christian Schulz per approfondite discussioni; Dr Hannah Garner per la lettura critica del manoscritto, il dottor Xavier Montagutelli e il dottor Jean Jaubert e il personale dell&#39;istituzione degli animali Institut Pasteur per il sostegno con la gestione del mouse; E Pascal Dardenne e Vytaute Boreikaite, un Amgen Scholar, per la loro assistenza tecnica. La ricerca nel laboratorio EGP è finanziata dall&#39;Istituto Pasteur, dal CNRS, dal Cercle FSER (FRM e da un pacchetto iniziale dell&#39;Istituto Pasteur e dal consorzio REVIVE. LI è sostenuto da una borsa di studio del consorzio REVIVE.

Le procedure animali sono state eseguite in conformità con il comitato istituzionale approvato per l&#39;assistenza e l&#39;istruzione degli animali dell&#39;Istituto Pasteur (CETEA). 1. In etichettatura a impulsi di Utero in Csf1r MeriCreMer Rosa LSL-YFP Embryos <ol><li> Preparare la soluzione di base di 4-idrossi-tamoxifene (OH-TAM, 50 mg / mL). <ol><li> Sotto il vapore, aprire il flaconcino da 25 mg di OH-TAM e aggiungere 250 μL di etanolo (100%). </li><li> Trasferire la soluzione OH-TAM in un tubo di microcentrifuga da 2 mL con una punta troncata e vortexa alla velocità massima per 10 minuti. </li><li> Sonicare 30 min in un bagno sonicator. </li><li> Aggiungere 250 μl di olio di ricino PEG-35 sotto il fumogeno per ottenere una soluzione di stock di 50 mg / ml. NOTA: L&#39;olio di ricino PEG-35 è un solvente con proprietà amfifiliche che lega le molecole idrofobe e li solubilizza in solventi acquosi. </li><li> Vortex per circa 5 minAlla velocità massima e sonicare 30 minuti in un bagno di sonicatore. </li><li> Aliquota 90 μL (4,5 mg) per tubo microcentrifuga (1 aliquota per iniezione). </li><li> Conservare a 4 ° C per 1 settimana oa -20 ° C per un lungo periodo come descritto in precedenza 13 . </li></ol></li><li> Preparare la soluzione di base di progesterone (10 mg / mL) <ol><li> Aggiungere 250 μl di 100% etanolo a 25 mg di progesterone per preparare una sospensione da 10 μg / 100 μl sotto il fumo. Vortex dolcemente. </li><li> Aggiungere 2250 μL di olio di girasole autoclavato per ottenere una soluzione di progesterone da 10 mg / ml sotto il cappuccio. </li><li> Vortex per circa 5 min alla velocità massima, aliquota e conservazione a 4 ° C. Si noti che la soluzione è chiara quando viene memorizzata. </li></ol></li><li> Somministrazione di tamoxifene NOTA: lo sviluppo dell&#39;embrione è stato stimato considerando il giorno della formazione di spina vaginale come giorno embrionale (E) 0,5. La ricombinazione è indotta da singola iniezione a E8.5Nelle femmine di MeriCreMer in stato di gravidanza 12 . Supplemento OH-TAM con 37,5 μg per g di progesterone per ridurre i tassi di aborto dopo la somministrazione di tamoxifene. Iniettare alle 13 (per la spina vaginale osservata al mattino). <ol><li> La mattina dell&#39;iniezione, sonicare una aliquota della soluzione OH-TAM per 10 minuti (o fino a quando completamente riorganizzata). </li><li> Aggiungere 360 ​​μl di NaCl 0,9% sotto il fumetto per ottenere una soluzione OH-TAM da 10 mg / ml e vorticarsi accuratamente. Sonicate fino a quando la soluzione è chiara e completamente risospessa (almeno 30 minuti). </li><li> Progesterone pre-caldo a temperatura ambiente. </li><li> Mescolare 450 μL di OH-TAM e 225 μL di progesterone in un tubo di microcentrifuga. Vortice. </li><li> Sonicare almeno 10 min e caricare su una siringa da 1 ml con un ago da 25G. </li><li> Nella struttura degli animali, pesare la femmina incinta (le femmine di Csf1r MeriCreMer sono in un background genetico FVB inbred e pesano tra loro tipicoEn 25 e 33 g). </li><li> Eseguire un&#39;iniezione intraperitoneale iniettando lentamente il volume calcolato nel mouse. Dopo aver ritirato l&#39;ago, premere delicatamente la ferita di puntura e massaggiare l&#39;addome per distribuire l&#39;OH-TAM. NOTA: La dose di iniezione OH-TAM è di 75 mg / kg e la dose di progesterone è di 37,5 mg / kg. La Tabella 1 fornisce il volume da iniettare in femmine in gravidanza. </li></ol></li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Peso del mouse (g) </td><td> Volume totale da iniettare dal mix (μL) </td></tr><tr><td> 25 </td><td> 281 </td></tr><tr><td> 26 </td><td> 292 </td></tr><tr><td> 27 </td><td> 303 </td></tr><tr><td> 28 </td><td> 315 </td></tr><tr><td> 29 </td><td> 326 </td></tr><tr><td> 30 </td><td> 338 </td></tr><tr><td> 31 </td><td> 348 </td></tr><tr><td> 32 </td><td> 360 </td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> 33 </td><td> 371 </td></tr><tr><td> 34 </td><td> 382 </td></tr><tr><td> 35 </td><td> 394 </td></tr></tbody></table> Tabella 1: Volume di iniezione di 4-OH-tamoxifene (OH-TAM). Volume richiesto per una singola iniezione a E8,5 di 75 μg per g (peso corporeo) di OH-TAM completato con 37,5 μg per g di progesterone. 2. Dissezione del Yolk Sac (YS) e del fegato fetale (FL) NOTA: Le tecniche sterili rigorose non sono necessarie per manipolare gli embrioni a meno che non siano utilizzati per una cultura a lungo termine. Tuttavia, l&#39;area di lavoro deve essere pulita e coperta di fogli di carta sotto assorbente. <ol><li> Preparare la miscela di digestione (PBS) e miscela digestiva (PBS contenente 1 mg / mL collagenasi D, 100 U / mL Deoxyribonuclease I (DNase I) e 3% serum bovino fetale). </li><li> Sacrificare le femmine incinte di cerDislocazione vica al giorno di gravidanza richiesto ( ad es. Stadio embrionale E10.5). </li><li> Pinch la pelle appena sopra i genitali e fare una piccola incisione alla linea mediana con le forbici. Tirare la pelle verso la testa per esporre completamente la parete del corpo senza pellicce. Tagliare i muscoli addominali per esporre gli organi interni e spingere l&#39;intestino per esporre le due corna uterine. </li><li> Con le pinze a media taglia, afferrare il grasso-pad attaccato all&#39;ovaio e tirare delicatamente l&#39;utero. Tagliare al livello cervicale delle corna uterine e sollevare le corna dalla cavità peritoneale. Rimuovere il grasso-pad per liberare completamente le corna uterine e tagliare le corna dall&#39;ovario da ogni lato. </li><li> Mettete le corna in PBS ghiacciato in un piatto di Petri da 10 mm. Prendi rapidamente gli strati muscolari dell&#39;utero ad una estremità (fine cervicale) e scorri le forbici sottili tra lo strato muscolare e il tessuto deciduo per liberare gli embrioni con il tessuto deciduo circostante. NOTA: I muscoli tendono a contratto rapidamenteR l&#39;estrazione, quindi questo passo deve essere il più veloce possibile. </li><li> Usare una coppia di pinze fine per tagliare la membrana del Reichert e la placenta. </li><li> Rimuovere delicatamente il sacco di tuorlo e metterlo in una piastra di coltura da 24 pozzetti con 0,5 ml di miscela di digestione. NOTA: a questo passo può essere raccolto il sangue embrionale. <ol><li> Subito dopo aver interrotto i vasi ombelicali e vitellini, trasferire l&#39;embrione in una piastra di coltura da 12 pozzetti contenenti 10 mM acido etilenediammetratoacetico ghiaccio freddo (EDTA). Decapitate l&#39;embrione utilizzando forbici raffinate, cercando di limitare il più possibile la dilacerazione dei tessuti. Incubare su ghiaccio per 10-15 min e raccogliere l&#39;EDTA contenente il sangue. </li></ol></li><li> Rimuovere l&#39;amnione che circonda l&#39;embrione. </li><li> Per le fasi &lt;E11.5, contate il numero di coppie somite per una migliore stadiazione degli embrioni e una migliore risoluzione di tempo (ogni coppia somite si sviluppa in ~ 1 h 30 min). </li><li> Tagliate la testa dell&#39;embrionePinze o forbici. Trasferire la testa su una piastra da 24 pozzetti con 0,5 ml di digestione. NOTA: il neuroectoderm e il cervello in fase successiva vengono ulteriormente disseccati per l&#39;analisi della citometria a flusso; Rimuovete attentamente il plesso vascolare circostante. </li><li> Tagliate l&#39;embrione sopra il dorso e rimuovete i forelimbs. </li><li> Per isolare il fegato, aprire il torace usando un paio di pinze fine. Pinch anteriormente al cuore e tirare delicatamente usando la seconda pinza per liberare gli organi dal corpo. <ol><li> Separare con cautela il fegato fetale dal cuore e dall&#39;intestino. Trasferire il fegato fetale in un piatto da 24 pozzetti con 0,5 ml di digestione. Monitorare attentamente il trasferimento sotto il microscopio di dissezione. </li></ol></li><li> Raccogliere la regione di coda (o qualsiasi altra parte embrionale) per la genotipizzazione mediante il processo di reazione a catena della polimerasi (PCR). NOTA: Altri tessuti e organi possono essere raccolti da embrioni E10.5 per un&#39;analisi simile usando la citometria a flusso. Sangue, sci di testaN, regione aorta-gonad-mesonephros (AGM), cuore e neuroectoderm possono essere raccolti a E10.5. Nelle fasi successive possono essere raccolti anche polmone, rene, milza e pancreas. Una descrizione dettagliata della dissezione dell&#39;AGM in diverse fasi di sviluppo è stata precedentemente descritta 14 . </li></ol> 3. Elaborazione di tessuti embrionali per la citometria di flusso <ol><li> Incubare gli organi (posizionati nella miscela di digestione) per 30 minuti a 37 ° C. </li><li> Trasferire il tessuto e la soluzione enzimatica su un filtro da 100 μm posto in una piastra di coltura da 6 pozzetti riempita con 6 ml di FACS buffer (0,5% Bovine Serum Albumin (BSA) e 2 mM EDTA in 1x PBS). Dissociare meccanicamente accuratamente schiacciando con il pistone in gomma nero di una siringa da 2 ml per ottenere una sospensione a singola cellula. NOTA: Da ora in poi tutti i passaggi devono essere eseguiti a 4 ° C. </li><li> Raccogliere la sospensione cellulare con una pipetta Pasteur e trasferirla in un tubo da 15 mL. </li><li> SpiN per 7 minuti a 320 xg a 4 ° C. Scartare il surnatante mediante aspirazione. </li><li> Resuspendere il pellet in 60 μl di Fc-bloccante tampone (CD16 / CD32 bloccante anticorpo diluito 1/50 in FACS buffer). <ol><li> Trasferire 50 μL della sospensione a cellula singola per pozzetto in una lastra rotonda a 96 piastre a più pozzetti. Incubare per almeno 15 minuti in ghiaccio. NOTA: La colorazione può essere eseguita anche in 5 mL di polistirolo FACS quando si tratta di un piccolo numero di campioni. </li><li> Trasferire il restante 10 μL in un tubo FACS da 5 ml di polistirolo per ottenere una raccolta di campioni da ciascun tessuto. Questa piscina servirà come controlli ( es. Campioni non conservati e controlli fluorescenti meno uno (FMO) per ogni fluorochrome). Trasferire 50 μL della piscina per ogni controllo fluorescente meno uno (FMO) (uno per fluorochrome) alla piastra a 96 piastre. NOTA: Ogni controllo FMO contiene tutti gli anticorpi collegati al fluorocromo dal pannello anticorpale, tranne quelloChe viene misurato. Le FMO sono utilizzate per identificare i confini delle porte e per controllare la sovrapposizione spettrale nei pannelli multicolori. Per correggere correttamente le variazioni di sfondo e autofluorescenza tra diversi tessuti, è importante preparare questi controlli dalla raccolta di campioni di ciascun tessuto. Il controllo appropriato per l&#39;espressione di YFP sarà il campione di embrioni Cre-negativi, che sono confermati dalla genotipizzazione PCR. </li></ol></li></ol> 4. Colorazione di antigeni superficiali <ol><li> Preparare il mix di anticorpi nel buffer FACS (Tabella 2). Preparare 50 μL di miscela di anticorpi per campione. <ol><li> Utilizzare i seguenti anticorpi accoppiati con fluorocromo: anti-CD45.2 (clone 104); Anti-CD11b (clone M1 / ​​70); Anti-F4 / 80 (clone BM8); Anti-AA4.1 (clone AA4.1); Anti-Kit (clone 2B8); E anti-Ter119 (clone Ter119). </li><li> Preparare sei miscele anticorpali per i controlli FMO nel buffer FACS. Preparare 50 μL di miscela di anticorpi per campione di controllo. NOTE: La diluizione degli anticorpi nel miscuglio anticorpale è due volte più concentrata rispetto alla concentrazione finale indicata nella tabella dei materiali. Per un pannello con sei anticorpi accoppiati con fluorochrome, vengono preparati sei controlli FMO. La Tabella 2 fornisce la composizione del mix di anticorpi e dei controlli FMO per un tubo. </li></ol></li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td></td><td colspan="7"> Volume (μL) di anticorpo (volume finale 50 μL) </td></tr><tr><td> Anticorpo </td><td> Clone </td><td> Miscela anticorpi </td><td> FMO CD45.2 </td><td> FMO CD11b </td><td> FMO F4 / 80 </td><td> FMO AA4.1 </td><td> Kit FMO </td><td> FMO Ter119 </td></tr><tr><td> anti-CD45.2 </td><td> 104 </td><td> 1 </td><td> 0 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> anti-CD11b </td><td> M1 / 70 </td><td> 0.5 </td><td> 0.5 </td><td> 0 </td><td> 0.5 </td><td> 0.5 </td><td> 0.5 </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> anti-F4 / 80 </td><td> BM8 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 0 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> anti-AA4.1 </td><td> AA4.1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 0 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> anti-Kit </td><td> 2B8 </td><td> 0.5 </td><td> 0.5 </td><td> 0.5 </td><td> 0.5 </td><td> 0.5 </td><td> 0 </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> anti-Ter119 </td><td> Ter119 </td><td> 0.5 </td><td> 0.5 </td><td> 0.5 </td><td> 0.5 </td><td> 0.5 </td><td> 0.5 </td><td> 0 </td></tr><tr><td colspan="2"> FACS buffer </td><td> 45.5 </td><td> 46.5 </td><td> 46 </td><td> 46.5 </td><td> 46.5 </td><td> 46 </td><td> 46 </td></tr></tbody></table>Tabella 2: Volume degli anticorpi che utilizzano per la colorazione e fluorescenti meno uno (FMO) controlli. Volume (μL) di anticorpo richiesto per un volume finale di 50 μL. <ol start="2"><li> Aggiungere 50 μL di miscela anticorpale ai campioni nella piastra a 96 piastre (il volume finale durante la colorazione è di 100 μL). Pipettare delicatamente pipette due volte e incubare sul ghiaccio per 30 minuti. </li><li> Spin la piastra a 96 piastre per 7 minuti a 320 xg a 4 ° C e scartare il supernatante. Resuspendere in 200 μL di buffer FACS. </li><li> Ripetere la procedura di lavaggio (punto 4.3) due volte con 150 μL di buffer FACS. </li><li> Filtrare i campioni ei controlli (FMO e campioni non campionati) in 5 ml di polistirolo attraverso un filtro da 70 μm. Conservare sul ghiaccio fino all&#39;acquisto. </li></ol> 5. Identificazione di EMP e Macrofagi derivanti da YS da citometria a flusso NOTA: Questo protocollo è stato ottimizzato utilizzando un citometro a flusso laser 4 eqDotato di un laser viola 405 nm, di un laser blu a 488 nm, di un laser giallo da 562 nm e di un laser rosso da 638 nm. <ol><li> Preparare le perle di compensazione per ogni anticorpo accoppiato seguendo le istruzioni del produttore. Utilizzare campioni non colorati e perle di compensazione per ottimizzare le intensità laser. </li><li> Per identificare i confini delle porte, utilizzare controlli FMO (Fluorescenza meno uno) per ciascun anticorpo. </li><li> Al fine di escludere le cellule morte, aggiungere 1 μL di DAPI (1 mg / ml) al tubo (contenente 200 μL di sospensione cellulare) 1 min prima dell&#39;acquisizione. Utilizzare il forte segnale DAPI e il parametro sparso in avanti (FSC) per eseguire l&#39;esclusione di cellule morte e detriti. NOTA: Utilizzare il software dal citometro di flusso per disegnare i cancelli durante l&#39;acquisizione. La matrice di compensazione e l&#39;analisi possono essere eseguite dopo l&#39;acquisizione del campione utilizzando altri software commercialmente disponibili. </li><li> Utilizzare lo spostamento avanti e laterale (FSC vs SSC) per eseguire la discriminazione delle cellule vive e dei doppi dall&#39;evento totale. </li><li> Creare grafici a punti di fluorescenza in asse log-scala e disegnare cancelli figlia, da un lato, esclude eritrociti (Ter119 +) e, quindi, per identificare le cellule progenitrici (Kit +) e cellule ematopoietiche (CD45 + Kit neg) (vedi figura 1). </li><li> Crea istogrammi di fluorescenza per quantificare l&#39;efficacia di etichettatura della YFP tra le differenti popolazioni identificate nella YS ( Figura 2 ), nel fegato fetale ( Figura 3 ) e nel cervello ( Figura 4 ). </li></ol>

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<li>Sheng, J., Ruedl, C., Karjalainen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Most+Tissue-Resident+Macrophages+Except+Microglia+Are+Derived+from+Fetal+Hematopoietic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Most Tissue-Resident Macrophages Except Microglia Are Derived from Fetal Hematopoietic Stem Cells.</a> Immunity. 43 (2), 382-393 (2015).</li>
</ol>

Gli autori non hanno niente da rivelare.

Le diverse onde delle cellule precursori ematopoietiche si sovrappongono parzialmente in un breve lasso di tempo, il che rende tecnicamente molto impegnativo l&#39;analisi del contributo di ogni onda di ematuria di sviluppo a cellule immunitarie. I sistemi Cre creati da tamoxifene offrono l&#39;opportunità di tagliare cellule specifiche in modo temporaneamente iniettato e di eseguire analisi di lineage in embrioni o adulti, senza la necessità di cultura ex vivo o in vitro o...

Ci sono diverse ondate successive ma sovrapposte di progenitori ematopoietici durante lo sviluppo, la cui progenie mieloide rimane nell&#39;età adulta. Innanzitutto, i progenitori &quot;primitivi&quot; unipotenti emergono nel sacco di tuorlo del topo 1 , 2 tra E7.5-E8.25 e danno origine a macrofagi embrionali senza alcuna intermedia monocitica. Sia che i macrofagi derivati ​​da progenitori primitivi persistano nel cervello adulto come microglia rimane un soggetto di indagine attiva. In secondo luogo, i precursori eritro-mieloidi (EMP) sorgono nel sacco di tuorlo all&#39;E8.5, entrano nel flusso sanguigno e colonizzano l&#39;embrione. EMP emergono dall&#39;endotelio hemogenico del tuorlo in una transizione endoteliale-ematopoietica dipendente da Runx1 3 , 4 . Mentre l&#39;EMP può differenziarsi in macrofagi all&#39;interno del sacco di tuorlo, colonizzano anche il fegato fetale dalla giornata embrionale (E) 9 5 e differenTiatriciti, macrofagi, monociti granulociti e cellule digestive 6 . I macrofagi che derivano da EMP presentano capacità proliferativa nei tessuti di sviluppo e nei tessuti adulti. Se i macrofagi derivati ​​da EMP superano lo stadio di differenziazione monocitaria, è ancora controversa poiché non si sa molto sul loro percorso di differenziazione 7 , 8 . Infine, le cellule staminali ematopoietiche (HSCs) emergono a E10.5 all&#39;interno dell&#39;embrione corretto dalla regione aorta-gonad-mesonephros e migrano verso il fegato fetale. HSCs con capacità di ripopolamento a lungo termine sono rilevati solo dopo E11 (alla fase di coppia pari a 24) 9 . Essi si espandono e differenziano da E12.5 fino a che l&#39;ematopoietica definitiva inizia a spostarsi verso il midollo osseo, che diventa il sito predominante della produzione di cellule del sangue per tutta la durata della vita postnatale 10 . La spLa sovrapposizione aziale e temporale in emergenza, nonché i marcatori immuno-fenotipici condivisi ha finora ostacolato la nostra capacità di distinguere i contributi specifici di queste onde di progenitori ematopoietici embrionali. Mentre entrambi EMP e HSC sono generati in modo dipendente da Runx1 ed esprimono il fattore di trascrizione Myb e il recettore del fattore di crescita Csf1r (Colony-Stimulating Factor 1 Receptor, noto anche come Macrophage Colony Stimulating Factor Receptor), tra gli altri, EMPs possono essere distinti da HSC per la loro mancanza di potenziale linfoide, sia in vitro che in vivo , la loro mancanza di potenziale repopulante a lungo termine e la mancanza di espressione superficiale del marcatore di lineage Sca- 11 . I modelli di mappatura genetica sono necessari per caratterizzare l&#39;ontogenesi dei macrofagi in quanto consentono di mirare i progenitori embrionali in modo specifico e specifico per le celle. Qui presentiamo il protocollo di mappatura del destino usato nel nostro laboratorio per discriminare i due lignaggiDei macrofagi trovati nella maggior parte dei tessuti adulti: macrofagi infiltrati derivanti da HSC e macrofagi residenti indipendenti da HSC. I macrofagi residui del tessuto sono stati ricondotti a cellule precursori indipendenti da Myb che esprimono il recettore del citocino Csf1r 12 e sono presenti nell&#39;embrione a E8.5-E10.5 utilizzando tre strategie complementari di mappatura dei fatti 6 . Al fine di studiare l&#39;ematopoiesi sacchi di tuorlo senza etichettatura di HSC fetali, utilizziamo un ceppo transgenico, Csf1r MeriCreMer , che esprime una proteina di fusione indotta da tamoxifene di recombinasi &quot; Crea &quot; migliorata e due recettori di estrogeni del mouse (Mer-iCre-Mer) sotto il controllo di Il promotore Csf1r. Quindi, la ricombinasi Cre sarà attiva nelle cellule esprimenti Csf1r durante una finestra temporale limitata. Se utilizzato con un ceppo di reporter contenente una proteina fluorescente a valle di una cassetta lox-STOP-lox (Rosa26 LSL-eYFP ),Etichettatura genetica delle cellule presenti al momento dell&#39;induzione, ma anche della loro progenie. L&#39;amministrazione a E8.5 della forma attiva di tamoxifene, 4-idrossimetossifene (OH-TAM), etichette EMP e macrofagi, senza etichettatura di progenitori &quot;primitivi&quot; o di HSC fetali. Di conseguenza, abbiamo caratterizzato l&#39;immunofenotipo di EMP e la loro progenie durante lo sviluppo embrionale, oltre a valutare il contributo dei macrofagi derivanti dal tuorlo da zucchero nei pool di macrofagi adulti. Ulteriori lavori sono necessari per caratterizzare se i macrofagi primitivi derivanti da progenitori sono anche etichettati utilizzando questo approccio e se possono contribuire a pool di macrofagi adulti.

<table><tbody><tr><td>#5 Pinze dritte</td><td>Strumenti per la scienza fine</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>MC19 / B Forbici a molla Pascheff-Wolff&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>15371-92</td><td></td></tr><tr><td>Forbici dritte da 8,5 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-09</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse Kit-PE (clone 2B8)</td><td>BD Pharmingen</td><td>553355</td><td>diluizione 1/200 in FACs Buffer</td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD45.2 APC-Cy7 (clone 104)</td><td>Sony</td><td>1149120</td><td>diluizione 1/100 in FACs Buffer</td></tr><tr><td>Anti-Mouse AA4.1-APC (CD93, clone AA4.1)</td><td>eBioscience</td><td>17-5892</td><td>Diluizione 1/100 in FACs Buffer</td></tr><tr><td>Anti-Mouse Ter119 PerCP-Cy5.5 (clone Ter119)</td><td>Biolegend</td><td>560512</td><td>diluizione 1/200 in FACs Buffer</td></tr><tr><td>Anti-Mouse F4/80-BV421 (clone BM8)</td><td>BD Pharmingen</td><td>123137</td><td>diluizione 1/100 in FACs Buffer</td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD11b PE-Cy7 (clone M1/70)</td><td>BD Pharmingen</td><td>552850</td><td>1/200 diluizione in FACs Buffer</td></tr><tr><td>Anti-Topo CD16/CD32 (Blocco Fc BD di Topo, clone 2.4G2)</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td>Fischer Scientific</td><td>12559069</td><td></td></tr><tr><td>Siero Fetale Bovino</td><td>Fischer Scientific</td><td>11570506</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi D&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11088882001</td><td></td></tr><tr><td>Deossiribonucleasi I</td><td>Sigma</td><td>D4527-20KU</td><td></td></tr><tr><td>Piastra per coltura tissutale a 6 pozzetti</td><td>Dutscher Dominique</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Piastra per coltura tissutale a 12 pozzetti</td><td>Dutscher Dominique</td><td>353224</td><td></td></tr><tr><td>Piastra per coltura tissutale a 24 pozzetti</td><td>Fischer Scientific</td><td>11874235</td><td></td></tr><tr><td>96 pozzetti Coltura tissutale inferiore a forma di U piatto</td><td>Dutscher Dominique</td><td>353227</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Siringa Plastipak 2 mL&nbsp;</td><td>Dutscher Dominique</td><td>300185</td><td></td></tr><tr><td>Griglia in nylon 100 &micro; filtri per celle m</td><td>Dutscher Dominique</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Griglia in nylon 70 &micro; filtri cellulari m</td><td>Dutscher Dominique</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>provette Falcon da 15 ml</td> Kit di filtrazione <td>Dutscher Dominique</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Stericup GP Millipore, 0,2 &; m</td><td>Dutscher Dominique</td><td>51246</td><td></td></tr><tr><td>Siero bovino Albumina Sigma</td><td></td><td>A7906-500G</td><td></td></tr><tr><td>(Z)-4-IDROSSITAMOXIFENE 25mg</td><td>Sigma</td><td>H7904-25MG</td><td>Particolare attenzione deve essere prestata durante la preparazione e il lavoro con il tamoxifene e i suoi derivati. Utilizzare sempre dispositivi di protezione individuale adeguati</td></tr><tr><td>Progesterone</td><td>Sigma</td><td>P3972</td><td>Utilizzare sempre dispositivi di protezione individuale adeguati</td></tr><tr><td>Olio di ricino PEG-35 (Kolliphor/Cremophor EL)</td><td>Sigma</td><td>C5135</td><td></td></tr><tr><td>Olio di girasole</td><td>Sigma</td><td>S5007-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>24103-1L-R-D</td><td>Utilizzare sempre dispositivi di protezione individuale adeguati e utilizzare sotto il cofano</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E9884-500G</td><td></td></tr><tr><td>DAPI, 1 ML (1 MG/ML IN ACQUA)</td>citometro <td>a flusso Fischer Scientific</td><td>10116287</td><td></td></tr><tr><td>CytoFLEX S B2-R3-V4-Y4</td><td>Beckman Coulter</td><td>B75408</td><td></td></tr><tr><td>CytoFLEX Daily QC Fluorosfere</td><td>Beckman Coulter&nbsp;</td><td>B53230</td><td></td></tr><tr><td>Kit di perline per la cattura degli anticorpi VersaComp (2x5 mL)</td><td>Beckman Coulter&nbsp;</td><td>B22804</td><td></td></tr><tr><td>FVB-Tg(Csf1r-cre/Esr1*)1Jwp/J</td><td>Il laboratorio Jackson</td><td>19098</td><td></td></tr><tr><td>B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J</td><td>Il laboratorio Jackson</td><td>6148</td><td></td></tr></tbody></table>

identificazione di progenitori eritromieloidi e loro progenie nell&#39;embrione del mouse dalla citometria del flusso

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

I macrofagi sono fagociti professionali dal braccio innato del sistema immunitario. In steady state, i macrofagi sessili si trovano nei tessuti adulti dove agiscono come sentinelle di linea frontali di infezione e danni ai tessuti. Mentre altre cellule immunitarie sono continuamente rinnovate da staminali ematopoietiche e cellule progenitrici (HSPC) situate nel midollo osseo, una linea di macrofagi, conosciuta come macrofagi residenti, è stata dimostrata autopulita nei tessuti senza l&#39;ingresso di HSPC di midollo osseo. Questa linea è esemplificata da microglia nel cervello, cellule Kupffer nel fegato e cellule di Langerhans nell&#39;epidermide tra gli altri. La lamina propria intestinale e colon è l&#39;unico tessuto adulto privo di macrofagi residenti indipendenti da HSPC. Recenti indagini hanno identificato che i macrofagi residenti provengono dall&#39;emotopoiesi extra-embrionale di tuorlo da progenitori distinti dalle cellule staminali ematopoietiche fetali (HSC). Tra l&#39;ematopoiesi definitivo del sacco di tuorlo, eI progenitori ritmicoeloidi (EMP) danno origine a cellule eritroidiche e mieloide, in particolare macrofagi residenti. EMP vengono generati solo all&#39;interno del sacco di tuorlo tra E8.5 e E10.5 giorni di sviluppo e migrano verso il fegato fetale già quando la circolazione è collegata, dove si espandono e si differenziano fino a almeno E16.5. La loro progenie comprende eritrociti, macrofagi, neutrofili e mastociti, ma solo i macrofagi derivanti da EMP persistono fino all&#39;età adulta nei tessuti. La natura transitoria dell&#39;emergere dell&#39;EMP e la sovrapposizione temporale con la generazione HSC rendono difficile l&#39;analisi di questi progenitori. Abbiamo stabilito un protocollo di mappatura dell&#39;induzione di tamoxifene-indottabile basato sull&#39;espressione del promotore di Csf1r del recettore dei citocinosi del macrofago per caratterizzare in vivo le cellule EMP e le cellule EMP mediante citometria a flusso.

La mappatura del destino genetico è stata ottenuta mediante somministrazione a E8.5 di OH-TAM nelle femmine Csf1r-Mer-iCre-Mer accoppiate con maschi con un giornalista Rosa26-LSL-eYFP. In presenza di OH-TAM, l&#39;escissione della cassetta di stop porta all&#39;espressione permanente di YFP nelle cellule che esprimono Csf1r . Abbiamo raccolto due tessuti ematopoietici: il sacco di tuorlo e il fegato fetale e un tessuto non ematopoietico, il neuroectoderm, dagli embrioni a E10.5....

Mentre i macrofagi infiltranti vengono reclutati continuamente nei tessuti adulti da precursori circolanti, i macrofagi residenti seminano il loro tessuto durante lo sviluppo, dove vengono mantenuti senza ulteriori input da progenitori. I progenitori per i macrofagi residenti sono stati recentemente identificati. Qui presentiamo metodi per la mappatura genetica dei fenomeni genetici dei progenitori macrofagi.

Identificazione di progenitori eritromieloidi e loro progenie nell&#39;embrione del mouse dalla citometria del flusso

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è caratterizzare in vivo i progenitori ematopoietici del sacco vitellino e le loro progenie, utilizzando un sistema di mappatura del destino indotto da tamoxifene nel topo e la citometria a flusso. Questo approccio può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'immunologia riguardo lo sviluppo e la differenziazione dei progenitori ematopoietici distinti dalle cellule staminali ematopoietiche. Il vantaggio principale di questa tecnica consiste nella possibilità di etichettare i progenitori ematopoietici in una finestra temporale limitata e di monitorare le loro progenie, come i macrofagi residenti, durante lo sviluppo e nell'età adulta.Generalmente, le persone alle prime armi con questo metodo incontreranno difficoltà a causa della quantità di cellule presenti nel tessuto embrionale e del grande volume dei campioni trattati contemporaneamente. Per iniziare l'esperimento, trasferire innanzitutto le corna uterine di topo dissezionate in una piastra di Petri da 10 millimetri riempita con circa 30 millilitri di PBS freddo di ghiaccio. Immediatamente dopo, afferrare gli strati muscolari dell'utero all'estremità cervicale dell

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JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Un metodo di citometria a flusso per l'identificazione e l'analisi molecolare di cellule progenitrici murino differenziazione fase-specifici eritroide e precursori, direttamente nel midollo del mouse appena raccolte osseo, milza o del fegato fetale. Il test si basa sulla superficie cellulare marker CD71, Ter119, e le dimensioni delle cellule.

Identificazione e analisi dei mouse progenitori eritroidi utilizzando il CD71/TER119 Flow-citometria Assay

Un metodo per analizzare la distribuzione di progenitori midollari ematopoietiche citometria di flusso e per isolare in modo efficiente altamente purificate cellule staminali ematopoietiche (CSE) è descritto. La procedura di isolamento è essenzialmente basata su un arricchimento magnetico di c-kit + e le cellule di separazione delle cellule per purificare CSE per studi cellulari e molecolari.

L&#39;analisi fenotipica e l&#39;isolamento di murini cellule staminali ematopoietiche e Lineage-committed progenitori

Il presente protocollo descrive un nuovo metodo di identificazione di una popolazione di enucleare eritroblasti ortocromatiche dal flusso di imaging multispettrale citometria, fornendo una visualizzazione del processo di enucleazione eritroblasti.

Identificazione di un Murine eritroblasto sottopopolazione Enriched in enucleare Eventi da Multi-spettrale Imaging Citometria a Flusso

Dimostriamo come identificare e isolare 6 sottoinsiemi dei progenitori mieloidi dal midollo osseo murino utilizzando una combinazione di magnetico e fluorescenza ordinamento (MACS e FACS). Questo protocollo può essere usato per analisi di RNA/proteine, in vivo gli esperimenti di trasferimento adottivo e saggi di cultura in vitro (colture di metilcellulosa o liquido).

Identificazione e isolamento di Oligopotent e dei progenitori mieloidi Lineage-commesso dal midollo osseo del topo

Descriviamo qui una semplice analisi dell'eterogeneità del compartimento delle cellule B immunitarie murine nel peritoneo, nella milza e nei tessuti del midollo osseo mediante citometria a flusso. Il protocollo può essere adattato ed esteso ad altri tessuti di topo.

Caratterizzazione citometrica a flusso dello sviluppo delle cellule B murine

Qui, descriviamo un semplice protocollo per l'isolamento e la colorazione delle cellule del midollo osseo murino al fenotipo delle cellule staminali emopoietiche e progenitrici insieme alle cellule staminali endoteliali e mesenchimali di nicchia di supporto. È incluso anche un metodo per arricchire le cellule situate nelle aree endostali e centrali del midollo osseo.

Analisi citometrica a flusso di cellule staminali e progenitrici ematopoietiche del midollo osseo murino e cellule di nicchia stromale

Qui, descriviamo un nuovo metodo citometrico a flusso per l'isolamento prospettico dei progenitori eritroidi dell'unità esplosiva precoce (BFU-e) e dell'unità eritroide formante colonie (CFU-e) direttamente dal midollo osseo e dalla milza freschi di topo. Questo protocollo, sviluppato sulla base di dati trascrittomici a singola cellula, è il primo a isolare tutti i progenitori eritroidi del tessuto con elevata purezza.

Identificazione e isolamento di progenitori eritroidi dell'unità burst-forming e dell'unità formante colonie da tessuto murino mediante citometria a flusso

Questo articolo descrive la metodologia in vivo e in vitro per caratterizzare i progenitori di sedimentazione timica mediante l'analisi della cinetica di generazione, fenotipo e numero della loro progenie di cellule T.

Caratterizzazione di timica assestamento Progenitori nell&#39;embrione mouse Uso<em&gt; In Vivo</em&gt; E<em&gt; In Vitro</em&gt; Saggi

Qui, presentiamo un protocollo per la coltura di archi faringei per studiare la biologia delle cellule progenitrici del cuore e dei muscoli e del loro microambiente.

Ex Cultura Vivo del faringea Archi allo Studio cuore e muscoli Progenitori e la loro nicchia

Descriviamo una strategia di selezione per spermatidi di topo utilizzando la citometria a flusso. Gli spermatidi sono suddivisi in quattro popolazioni altamente pure, tra cui rotonda (fasi di spermiogenesi 1-9), allungamento precoce (fasi di spermiogenesi 10-12), allungamento tardivo (fasi di spermiogenesi 13-14) e spermatidi allungati (fasi di spermiogenesi 15-16). La colorazione, la dimensione e la granulosità del DNA sono utilizzate come parametri di selezione.

Specifiche Step-ordinamento di mouse spermatidi mediante citometria di flusso

Scopri come caratterizzare i progenitori eritromieloidi del sacco vitellino e la loro progenie nell'embrione di topo usando la citometria del flusso e il sistema di fate mapping indotto da tamoxifene.

Identificazione di progenitori eritromieloidi e loro progenie nell'embrione del mouse dalla citometria del flusso

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