Identificazione di progenitori eritromieloidi e loro progenie nell'embrione del mouse dalla citometria del flusso

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di caratterizzare i progenitori ematopoietici del sacco vitellino e la loro progenie in vivo utilizzando un sistema di mappatura del destino indotto da tamoxifene di topo e citometria a flusso. Questo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'immunologia riguardanti lo sviluppo e la differenziazione di progenitori ematopoietici distinti dalle cellule staminali ematopoietiche. Il vantaggio principale di questa tecnica è che i progenitori ematopoietici marcati entro una finestra temporale limitata e la progenie come i macrofagi residenti possono essere monitorati durante lo sviluppo e l'età adulta.

In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà a causa della quantità di cellule per il tessuto embrionale e del grande volume dei campioni trattati contemporaneamente. Per iniziare l'esperimento, per prima cosa trasferisci le corna uterine di topo sezionate in una capsula di Petri da 10 millimetri riempita con circa 30 millilitri di PBS ghiacciato. Subito dopo, afferra gli strati muscolari dell'utero all'estremità cervicale del corno e fai scorrere le forbici sottili tra lo strato muscolare e un tessuto deciduale per rilasciare gli embrioni.

Quindi, con una pinza fine, rimuovere la membrana di Reichert e rimuovere la placenta. Sezionare delicatamente il sacco vitellino e trasferirlo in una piastra di coltura tissutale a 24 saldature riempita con 0,5 millilitri di soluzione digestiva. Dopo aver reciso i vasi ombelicali e vitulini, trasferire immediatamente l'embrione in una piastra di coltura tissutale a 12 saldature riempita con 2 millilitri di EDTA ghiacciato da 10 millimolari.

Dopo aver rimosso la testa dall'embrione con forbici sottili affilate, incubare il corpo e la testa in ghiaccio per 10-15 minuti, quindi rimuovere l'embrione e raccogliere l'EDTA contenente il sangue. Quindi, rimuovi l'amnio che circonda l'embrione. Successivamente, rimuovere gli arti posteriori e gli arti estranei dall'embrione.

Usando un paio di pinze sottili, apri il torace. Quindi, afferra la parte anteriore del cuore e tira delicatamente il tessuto mentre rilasci gli organi interni dal corpo con un secondo paio di pinze. Sotto un microscopio da dissezione, separare il fegato fetale dal cuore e dall'intestino.

E trasferire l'organo in una piastra a 24 pozzetti riempita con 0,5 millilitri di soluzione digestiva. La connessione anatomica con il sistema cardiovascolare è fondamentale per l'identificazione del fegato fetale. Il fegato fetale è ancora in questa fase di sviluppo e più giovani sono gli embrioni, più difficile può essere la dissezione.

Per preparare le sospensioni cellulari primarie, incubare gli organi raccolti nella soluzione di digestione a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Caricare il tessuto nella soluzione enzimatica in un colino da 10 micrometri installato su una saldatura di una piastra di coltura tissutale a sei saldature riempita con 1 millilitro di tampone FACS. Utilizzare un pistone di gomma nera da una sinringa di 2 millimetri per dissociare il tessuto schiacciando delicatamente per ottenere una sospensione a singola cellula.

Quindi, aspirare la sospensione cellulare con una pipetta Pasteur e trasferirla in una provetta da 15 millilitri. Centrifugare la sospensione a 320 volte G a 4 gradi Celsius per 7 minuti. Dopo la centrifugazione, aspirare e scartare il surnatante.

Successivamente, preparare un tampone bloccante Fc fresco e risospendere il pellet in 60 microlitri. Quindi, trasferire 50 microlitri della sospensione a cellula singola in un pozzetto di una piastra inferiore rotonda a 96 pozzetti. Incubare la piastra su ghiaccio per almeno 15 minuti.

Successivamente, trasferire i restanti 10 microlitri della sospensione in una provetta FACS di polistirene da 5 millilitri per ottenere un pool di campioni derivati da diversi tessuti. Trasferire 50 microlitri della piscina per i controlli FMO per ogni fluorocromo alla piastra a 96 pozzetti. Per procedere con la colorazione superficiale dell'antigene, utilizzare un set di sei anticorpi al fluorocromo per preparare una soluzione anticorpale e un tampone FACS.

Quindi preparare sei soluzioni anticorpali e il tampone FACS utilizzato per la colorazione di controllo FMO. Successivamente, aggiungere 50 microlitri di soluzioni anticorpali ai campioni nella piastra a 96 pozzetti. Miscelare i campioni con un doppio pipettaggio delicato e quindi incubare la piastra su ghiaccio per 30 minuti.

Centrifugare la piastra a 96 pozzetti a 320 volte G a 4 gradi Celsius per 7 minuti e rimuovere il surnatante. Lavare le cellule in 200 microlitri di tampone FACS e centrifugare la piastra ancora una volta. Prestare particolare attenzione quando si rimuove il surnatante mediante inversione della placca.

La piastra multipozzetto 96 deve essere invertita con un singolo movimento brusco del polso per evitare l'allentamento delle cellule. Infine, utilizzando un microfiltro da 70, filtrare il tessuto e controllare i campioni in provette di polistirene da 6 millimetri. L'analisi citofluorimetrica può ora essere eseguita.

Una popolazione di singole cellule citiche vive non eritrocitiche è stata analizzata per l'espressione del kit di marcatori progenitori e del marcatore di cellule ematopoietiche CD45. All'interno della popolazione target, sono state distinte tre diverse sottopopolazioni cellulari. KIT positivo CD45 negativo, KIT positivo CD45 basso e KIT negativo CD45 positivo.

Tra i progenitori positivi del kit del sacco vitellino, sia le popolazioni cellulari CD45 negative che CD45 basse contenevano cellule AA4.1 positive che esprimono la proteina fluorescente gialla o YFP, indicando che i progenitori immaturi KIT positivi esprimono per primi AA4.1 indipendentemente dall'espressione di CD45. Le cellule AA4.1 positive e YFP positive nel fegato e nel cervello sono state trovate solo nella popolazione di progenitori bassi CD45 positivi per KIT e corrispondono molto probabilmente ai progenitori circolanti che hanno avuto origine dai progenitori del sacco vitellino. I macrofagi sono stati trovati nella popolazione CD45 positiva al kit e sono stati identificati come cellule CD11 B positive F480 luminose.

I macrofagi nel sacco vitellino, nel fegato e nel cervello sono stati etichettati in modo efficiente con una singola somministrazione di 4-idrossi tamoxifene che può indicare la loro origine ENP. Una volta padroneggiata, la procedura per l'isolamento e la colorazione delle cellule può essere eseguita in tre o quattro ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di conservare sempre i campioni sul ghiaccio non appena vengono raccolti.

I tamponi FACS freschi devono essere preparati quotidianamente e filtrati. Seguendo questa procedura, è possibile utilizzare altri ceppi mash reporter o flux come Rosa MTMG o Rosa confetti lines per rispondere a ulteriori domande sull'indifferenziazione e sul potenziale della fase proto delle cellule post marcate.