Identificazione di progenitori eritromieloidi e loro progenie nell'embrione del mouse dalla citometria del flusso

L'obiettivo generale di questo esperimento è caratterizzare in vivo i progenitori ematopoietici del sacco vitellino e le loro progenie, utilizzando un sistema di mappatura del destino indotto da tamoxifene nel topo e la citometria a flusso. Questo approccio può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'immunologia riguardo lo sviluppo e la differenziazione dei progenitori ematopoietici distinti dalle cellule staminali ematopoietiche. Il vantaggio principale di questa tecnica consiste nella possibilità di etichettare i progenitori ematopoietici in una finestra temporale limitata e di monitorare le loro progenie, come i macrofagi residenti, durante lo sviluppo e nell'età adulta.

Generalmente, le persone alle prime armi con questo metodo incontreranno difficoltà a causa della quantità di cellule presenti nel tessuto embrionale e del grande volume dei campioni trattati contemporaneamente. Per iniziare l'esperimento, trasferire innanzitutto le corna uterine di topo dissezionate in una piastra di Petri da 10 millimetri riempita con circa 30 millilitri di PBS freddo di ghiaccio. Immediatamente dopo, afferrare gli strati muscolari dell'utero all'estremità cervicale della corno e inserire una forbice fine tra lo strato muscolare e un tessuto deciduale per liberare gli embrioni.

Quindi, con pinzette fini rimuovere la membrana di Reichert e rimuovere la placenta. Dissezionare delicatamente il sacco vitellino e trasferirlo in una piastra per colture tessutali a 24 pozzetti contenente 0,5 millilitri di soluzione di digestione. Dopo aver reciso i vasi ombelicali e vitellini, trasferire immediatamente l'embrione in una piastra per colture tessutali a 12 pozzetti contenente 2 millilitri di EDTA freddo a 10 millimolari.

Dopo aver rimosso la testa dall'embrione con forbici fini e affilate, incubare il corpo e la testa su ghiaccio per 10-15 minuti, quindi rimuovere l'embrione e raccogliere l'EDTA contenente il sangue. Successivamente, rimuovere l'amnios che circonda l'embrione. In seguito, rimuovere gli arti posteriori e gli arti estranei dall'embrione.

Utilizzando una pinzetta fine, aprire il torace. Successivamente, afferrare l'estremità anteriore del cuore e tirare delicatamente il tessuto, staccando contemporaneamente gli organi interni dal corpo con una seconda pinzetta. Al microscopio stereoscopico, separare il fegato fetale dal cuore e dall'intestino.

Trasferire l'organo in una piastra a 24 pozzetti contenente 0,5 millilitri di soluzione di digestione. La connessione anatomica con il sistema cardiovascolare è fondamentale per l'identificazione del fegato fetale. Il fegato fetale si trova ancora in questa fase di sviluppo e più giovani sono gli embrioni, più difficile può risultare la dissezione.

Per preparare sospensioni cellulari primarie, incubare gli organi raccolti nella soluzione di digestione a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Caricare il tessuto nella soluzione enzimatica in un filtro da 10 micrometri posizionato sopra una delle sei camere di una piastra per colture cellulari riempita con 1 millilitro di buffer FACS. Utilizzare un pistone in gomma nera da una siringa da 2 millimetri per dissociare il tessuto, schiacciando delicatamente fino a ottenere una sospensione di singole cellule.

Quindi, aspirare la sospensione cellulare con una pipetta di Pasteur e trasferirla in un tubo da 15 millilitri. Centrifugare la sospensione a 320 ×g a 4 °C per 7 minuti. Dopo la centrifugazione, aspirare e scartare il soprannatante.

Successivamente, preparare un bloccante Fc fresco e risospendere il pellet in 60 microlitri. Quindi, trasferire 50 microlitri della sospensione cellulare singola in un pozzetto di una piastra a 96 pozzetti con fondo rotondo. Incubare la piastra sul ghiaccio per almeno 15 minuti.

Successivamente, trasferire i restanti 10 microlitri della sospensione in un tubo FACS in polistirene da 5 millilitri per ottenere un pool di campioni derivati da tessuti diversi. Trasferire 50 microlitri del pool nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti per i controlli FMO di ciascun fluorocromo. Per proseguire con la marcatura superficiale dell'antigene, utilizzare un set di sei anticorpi marcati con fluorocromo per preparare una soluzione di anticorpi e tampone FACS.

Quindi preparare sei soluzioni di anticorpi e il buffer FACS utilizzato per la colorazione di controllo FMO. Successivamente aggiungere 50 microlitri delle soluzioni di anticorpi ai campioni nella piastra a 96 pozzetti. Mescolare i campioni mediante pipettaggio delicato doppio e quindi incubare la piastra sul ghiaccio per 30 minuti.

Centrifugare la piastra a 96 pozzetti a 320 ×g a 4 gradi Celsius per 7 minuti ed eliminare il soprannatante. Lavare le cellule con 200 microlitri di buffer FACS e centrifugare nuovamente la piastra. È necessario prestare particolare attenzione durante l'eliminazione del soprannatante mediante inversione della piastra.

La piastra a 96 pozzetti deve essere capovolta con un singolo movimento deciso del polso per evitare di staccare le cellule. Infine, utilizzando un filtro da 70 micrometri, filtrare i campioni di tessuto e di controllo in provette di polistirene da 6 millimetri. È ora possibile eseguire l'analisi mediante citometria a flusso.

Una popolazione di cellule singole vitali non eritrocitiche è stata analizzata per l'espressione del marcatore di progenitore KIT e del marcatore delle cellule ematopoietiche CD45. All'interno della popolazione target, sono state distinte tre diverse sottopopolazioni cellulari: KIT positivo CD45 negativo, KIT positivo CD45 basso e KIT negativo CD45 positivo.

Tra i progenitori positivi al kit del sacco vitellino, le popolazioni cellulari CD45 negative e CD45 basse contenevano cellule positive per AA4.1 che esprimono la proteina fluorescente gialla o YFP, indicando che i progenitori immaturi positivi per KIT esprimono inizialmente AA4.1 indipendentemente dall'espressione di CD45. Le cellule positive per AA4.1 e positive per YFP nel fegato e nel cervello sono state trovate esclusivamente nella popolazione progenitrice KIT positiva e CD45 bassa, e corrispondono molto probabilmente a progenitori circolanti originati dai progenitori del sacco vitellino. I macrofagi sono stati trovati nella popolazione progenitrice negativa al kit e positiva per CD45 ed sono stati identificati come cellule F480 brillanti e positive per CD11B.

I macrofagi nel sacco vitellino, nel fegato e nel cervello sono stati etichettati in modo efficiente mediante una singola somministrazione di 4-idrossi tamoxifene, il che potrebbe indicare la loro origine da ENP. Una volta acquisita padronanza, la procedura di isolamento e colorazione delle cellule può essere completata in tre o quattro ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di mantenere sempre i campioni sul ghiaccio non appena vengono raccolti.

I tamponi FACS freschi devono essere preparati giornalmente e filtrati. Seguendo questa procedura, altri ceppi reporter di mash o ceppi di tipo flux, come le linee Rosa MTMG o Rosa confetti, possono essere utilizzati per rispondere ad ulteriori domande riguardo al potenziale di indifferenziazione e alla fase proto delle cellule marcate in seguito.