Name: Utilizzando colture di neurosfere primarie al primario dello studio Cilia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Scopri come studiare la biogenesi e il traffico delle ciglia primarie nelle cellule staminali neurali utilizzando colture di neurosfere. Questo metodo fornisce un modello rilevante per la ricerca in neuroscienza.

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Il lavoro nel laboratorio di S.M. è finanziato da sovvenzioni di reclutamento da CPRIT (R1220) e NIH (1R01GM113023-01).

1. Isolamento di neurosfere dal cervello di topo per adulti <ol><li> Euthanize un topo adulto (circa 2 mesi) per una dose eccessiva di isoflurano. Fare doppio verificare che il mouse ha smesso di respirare e sezionare immediatamente dopo la morte. </li><li> Utilizzando le forbici, fare un&#39;incisione mediana per aprire il cranio. Rimuovere il cervello. </li><li> Mettere il cervello in PBS freddo in un piatto di 10 centimetri sul ghiaccio. Seguire tutta montaggio metodo dissezione avere la SVZ dal ventricolo laterale 48. </li><li> Posizionare il ventricolo laterale in una provetta da 1,5 ml, aggiungere 500 ml di 0,05% tripsina-EDTA in PBS, e incubare la provetta per 15 minuti a 37 ° C in un bagno d&#39;acqua. </li><li> Dopo 15 minuti, aggiungere 500 ml di media arresto e pipettare delicatamente 20 - 30 volte con una punta ml 1. Evitare la formazione di bolle d&#39;aria durante il pipettamento. NOTA: Questo passaggio è fondamentale per la sopravvivenza delle cellule. </li><li> Spin giù le cellule a 500 xg per 8 minuti. Eliminare il surnatante, aggiungere 1 ml di PBS e risospendere tegli cellule pipettando gentilmente 5x con una punta mL 1. </li><li> Spin down a 500 xg per 8 minuti. Eliminare il surnatante utilizzando un mL punta 1 e aggiungere 1 ml di terreno di base. </li><li> (Facoltativo) Se si osservano detriti cellulari, passare le cellule attraverso una cella di 70 micron-filtro. </li><li> Contare il numero di cellule con un emocitometro; in generale, circa 30.000 - 60.000 cellule / SVZ si ottengono. </li><li> Piastra le cellule da una SVZ in 10 cm piatto con 10 ml di terreno di coltura e NSC a 37 ° C con 5% di CO 2. </li><li> (Opzionale) Per evitare la fusione tra le sfere 49, mettere a 1000 cellule in un singolo pozzetto di una piastra da 6 pozzetti bassissimo legame che è preriempita con 1,5 ml di terreno di coltura e NSC a 37 ° C con 5% di CO 2. NOTA: Dopo 5-7 giorni, neurosfere possono essere osservati (Figura 2A). Il periodo di coltura può essere diverso con l&#39;età del mouse o il background genetico. </li><li> Aggiungere 2 ml di terreno NSC ogni 3-4 giorni per mantenere la cultura(Non rimuovere il supporto esistente). </li></ol> 2. Analisi della Capacità Differenziazione di neurosfere e Ciliogenesis Test <ol><li> Per analizzare la capacità di differenziazione, analizzare le neurosfere in condizioni aderenti in terreno di differenziazione. </li><li> Sterilizzare 12 mm coprioggetto tondo in autoclave o con l&#39;esposizione ai raggi UV prima dell&#39;uso. Per una cultura di cellule aderenti, mettere un bicchiere coperchio tondo 12 millimetri sterilizzati in un pozzetto di una piastra da 24 pozzetti in condizioni asettiche. </li><li> Rivestire il vetro di copertura per 10 s con 500 microlitri di 0,002% di poli-L-lisina (PLL). Aspirare la soluzione e asciugare per 10-15 min. </li><li> Aggiungere 500 ml di soluzione di laminina (5 mg / mL). Incubare il vetro di copertura per 1 ora a 37 ° C. </li><li> Aspirare il laminina e aggiungere 500 ml di mezzo di differenziazione o medio NSC (controllo indifferenziata). </li><li> Per il saggio di differenziazione, prendere un 100-200 micron sfera con una punta di 200 microlitri sotto il microscopio. Inserisci5-10 neurospheres a ciascun pozzetto di una piastra da 24 pozzetti e coltura per 7-10 giorni in terreno di differenziamento. </li><li> Per analizzare neurosfere indifferenziate, aggiungere 5-10 neurosfere a ciascun pozzetto di una piastra e coltura a 24 pozzetti per 1-2 giorni in media NSC. Neurosfere allegate diffondere e crescere come monostrato (Figura 2B). </li><li> Dopo aver rimosso attentamente il mezzo, fissare le cellule con 4% paraformaldeide (PFA) in PBS per 15 minuti a RT, e poi lavare con PBS due volte per 5 minuti a temperatura ambiente. La piastra può essere conservato a 4 ° C per 1-2 mesi. NOTA: per visualizzare le cellule staminali / progenitrici neurali in media NSC e cellule differenziate in terreno di differenziamento, eseguire immunostaining contro Nestin (staminali neurali / marcatore di cellule progenitrici), β-tubulina III (TUJ1 monoclonale, marcatore neuronale), GFAP (fibrillare gliale Acidic Protein , marcatore astrociti), e O4 (marcatore oligodendrociti) (Figura 2B-e). Per analizzare le ciglia, eseguire immunostaining contro Arl13b (CI primariolia marker) e Gpr161 (GPCR ciliare) (Figura 3). </li><li> Montare il vetro di copertura con soluzione di montaggio su un vetrino. Inclinare il vetrino per rimuovere la soluzione in eccesso. </li></ol> 3. Analisi di Ciliogenesis in Neurosfere <ol><li> Per analizzare cellule in neurosfere intatte mediante immunocolorazione, trasferimento 1 ml di terreno di coltura contenente più neurospheres ad una provetta da 1,5 ml e centrifugare a 500 xg per 8 min. Fissare le sfere con 4% (PFA) dopo aver rimosso il mezzo per 15 minuti e lavare con PBS. Spin down sfere a 500 xg per 8 minuti, rimuovere il surnatante e incubare le sfere O / N con 30% saccarosio a 4 ° C. </li><li> Eliminare il surnatante utilizzando un mL punta 1 e aggiungere 500 ml di soluzione di ottobre con un taglio di 1 punta mL. Tagliare il bordo della punta di allargare l&#39;apertura, come PTOM viscoso. </li><li> Trasferire la soluzione contenente i Ottobre neurosfere in uno stampo di plastica monouso di congelamento (10 mm x 10 mm x 5 mm). </li><li> Congelare il mvecchio in ghiaccio secco per almeno 15 min. </li><li> (Opzionale) interrompere l&#39;esperimento e memorizzare lo stampo in un congelatore C -80 ° fino a 1 anno. </li><li> Tagliare le sezioni con un criostato; lo spessore delle sezioni deve essere di 15-30 um. </li><li> Per visualizzare le ciglia primario in un neurosfere, eseguire immunostaining contro Arl13b (Figura 4). </li></ol> 4. Cultura e Passaggio di neurosfere e NSC aderenti <ol><li> Passage le neurosfere mentre la dimensione della sfera è tra 100-200 micron; quando le neurosfere sono troppo grandi (300 micron o superiore), non sono l&#39;ideale per gli esperimenti. </li><li> Trasferire le neurosfere in un tubo da 50 ml usando una punta mL 1 e centrifugare a 500 xg per 8 min. </li><li> Scartare il surnatante mediante un aspiratore, aggiungere 500 ml di 0,05% tripsina-EDTA in PBS, e incubare per 5 min a 37 ° C. La quantità di tripsina varia a seconda del numero di sfere. </li><li> Aggiungere 500 microlitri di media siero e delicatamente il tubot 20 volte con una punta mL 1. </li><li> Spin down a 500 xg per 8 minuti. Eliminare il surnatante utilizzando un mL punta 1 e aggiungere 1 ml di terreno di base. </li><li> (Opzionale) Se detriti cellulari o indissociate neurosfere si vedono passare le cellule attraverso una cella di 70 micron-filtro. </li><li> Passaggio le cellule in 10 cm piatto ad una densità di 10.000 cellule / cm 2 in media NSC; le cellule saranno pronti per il prossimo passo, dopo una settimana. </li><li> (Facoltativo) Per congelare le cellule, aggiungere il congelamento medio di generare 500.000 a 1.000.000 cellule / ml sospensione. Congelare le cellule utilizzando contenitori crio-congelamento; neurosfere indissociate possono anche essere congelati. </li><li> Per la coltura aderente, dillute le cellule a 50.000 cellule / cm 2 sul PLL- e coprioggetto con media NSC e cultura laminina rivestite per 1-2 giorni. </li></ol> 5. La fame e analisi di Cilia <ol><li> Preparare mezzo inedia (Tabella 1). </li><li> 1-2 giorni dopo l&#39;iniziale plCORTEGGIAMENTO di cellule aderenti dopo la dissociazione, il cambiamento medio NSC in un pozzetto (controllo) e media fame in un altro pozzo (esperimento). </li><li> Coltura le cellule aderenti per 24 h. </li><li> Fissare le cellule con 4% PFA in PBS per 15 minuti a RT e lavare due volte con PBS per 5 minuti ciascuno a RT. </li><li> (Opzionale) interrompere l&#39;esperimento e memorizzare le piastre a 24 pozzetti con coprioggetto in PBS a 4 ° C per 1-2 mesi. </li><li> Eseguire un protocollo di immunofluorescenza per la colorazione 7, 50. </li><li> Montare i coprioggetti con soluzione di montaggio. Asciugare il vetrino O / N a temperatura ambiente al buio. </li><li> Acquisire immagini su un microscopio composto all&#39;ingrandimento necessario. Utilizzare un microscopio, una macchina fotografica, e gli obiettivi (40X / 1.3 olio e 63X / 1.4 olio), controllata utilizzando il software accompagnato. Prendere sufficienti z sezioni a 0,5-0,8 micron intervalli (Figura 5). </li><li> Per l&#39;analisi quantitativa della localizzazione in ciliarecellule aderenti, acquisiscono pile di immagini dal 3-8 campi consecutivi con cellule confluenti, cercando nel canale DAPI. Quantificare il numero di ciglia primarie utilizzando ImageJ / Figi. In genere, utilizzare la funzione &quot;contatore cella&quot; nel ImageJ Plugin&gt; Analizzare finestra di dialogo per contare le cellule con cilia GPCR-positivi; proiezioni massime da pile di immagini possono essere esportati da ImageJ / Fiji.Use simile intensità dell&#39;immagine ei parametri di contrasto per tutte le immagini dello stesso esperimento per il conteggio e scopi esportazione. </li></ol> 6. La trasfezione di neurosfere <ol><li> Aderire dissociato cellule di vetrini per 24 h. Utilizzare una densità cellulare tipicamente tra 75.000 e 150.000 cellule in 500 microlitri di NSC media in un singolo pozzetto di una piastra da 24 pozzetti. </li><li> Mescolare 25 ml di mezzo di siero ridotto e 1,5 ml di reagente di trasfezione in un mL microtubo 0,5 vortex per 5 s. </li><li> Aggiungere 2,5 mg di DNA plasmidico privo di endotossine ad un separato 0,5 ml microtube contenente 25 ml di mezzi di siero ridotto e mescolare nel vortex per 5 s. </li><li> Aggiungere 1 ml di reagente di trasfezione al secondo DNA provetta contenente e mescolare nel vortex per 5 s. </li><li> Aggiungere il composto dal tubo di DNA contenenti alla prima provetta e mescolare pipettando. </li><li> Incubare la miscela per 10-15 minuti a temperatura ambiente. Dopo l&#39;incubazione, aggiungere delicatamente la goccia a goccia mix trasfezione ai pozzetti in cima alla media NSC (500 pl / pozzetto). </li><li> Cambiare il mezzo 24 h dopo la trasfezione per il controllo di media (media NSC) o medio fame (500 pl / pozzetto). </li><li> Fissare le cellule cambiando il mezzo di 4% PFA dopo 24 he eseguire immunostaining; tipicamente, fino ad un&#39;efficienza di transfezione 10% è ottenuto usando questo protocollo. </li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Qui, descriviamo un metodo per generare e mantenere colture di neurosfere da SVZ topo adulto. Alcuni punti pertinenti riguardanti le culture sono i seguenti. In primo luogo, le dimensioni delle sfere sono tipicamente tra 50 - 200 um. Nella nostra esperienza, quando un neurosfere diventa più grande di 300 micron di diametro, il momento ottimale per passaging è stato mancato. Queste sfere più grandi contengono cellule morte nel nucleo. In secondo luogo, come neurosfere sono comunemente usati per studiare le cellule stamin...

Cilio primario è un compartimento subcellulare dinamica microtubuli-based che funziona come antenna sensoriale nel coordinare percorsi di segnalazione cellulare, tra cui la via di Sonic Hedgehog (Shh) durante lo sviluppo embrionale neuronale 1, 2, e compartimentato segnalazione subcellulare nell&#39;adulto funzione neuronale 3, 4 . Segnalazione componenti di queste vie, come il recettore Patched Shh 5; la via attivatore Smoothened (SMO) 6; e Gpr161 7, un recettore orfano accoppiato alla proteina G (GPCR) che regola negativamente il pathway Shh, localizzarsi a cilia in modo dinamico. GPCR Molteplici sono stati segnalati per localizzare alle ciglia nei neuroni nel cervello 7, 8, 9, 10 </sup&gt;, 11, 12, 13, 14, 15, 16. Difetti di cilia e vie di segnalazione cilia generata influenzano molteplici tessuti e sono noti collettivamente come ciliopatie 17, 18, 19. Lo spettro malattia ciliopathy frequentemente include difetti neurologico, quali difetti craniofacciali 20, 21, 22. Inoltre, ciglia primarie nei neuroni ipotalamici regolare percorsi sazietà centrali, e difetti provocare obesità centrale 23, mirroring obesità in ciliopatie sindromici come Bardet Biedel sindrome 24. Inoltre, recettore neuropeptide segnalazione in cilia regola centrAl sazietà Percorsi di 11, 14. Localizzazione ciliare ciclasi III (ACIII) e GPCR come recettore della somatostatina 3 in neuroni ippocampali provocare difetti di riconoscimento dell&#39;oggetto nuovi e deficit di memoria 25, 26 e parallela una mancanza di integrità ciliare 27. Gli aspetti dello sviluppo di segnalazione cilia generati sono strettamente legate alla omeostasi tissutale; in particolare, cilia sono importanti per la progressione di medulloblastomas Shh-sottotipo derivanti da progenitori dei granuli nel cervelletto 28, 29. Così, cilia primarie svolgono un ruolo importante durante embrionale, postnatale e adulta sviluppo e la funzione neuronale. Neurali cellule staminali (NSC) risiedono nella zona sottoventricolare (SVZ) del ventricolo laterale, la zona subgranulare del giro dentato dell&#39;ippocampo, ezona ventricolare del terzo ventricolo nell&#39;ipotalamo nei mammiferi 30, 31, 32. NSC sono multipotenti, possiedono la capacità di auto-rinnovamento, e sono importanti per lo sviluppo del cervello e la medicina rigenerativa 30. La maggior parte NSC nella SVZ sono quiescenti e possiedono un cilium primario solitaria che, in molti casi, si estende verso il ventricolo laterale 33. I segnali cilium primarie tramite la localizzazione dei vari recettori, inducendo risposte cellulari a valle, in particolare in relazione alla Shh, TGFp, e del recettore tirosina chinasi vie 2, 34, 35, 36. Poiché cilia primarie estendono nel ventricolo laterale, si ipotizza che cilia primaria rilevare citochine nel liquido cerebrospinale (CSF) per attivare NSC 37 </sup&gt;. Studi recenti suggeriscono che la via di segnalazione Shh e ciglia primarie sono fondamentali per l&#39;attivazione delle cellule staminali nella riparazione e rigenerazione di tessuti multipli, tra l&#39;epitelio olfattivo, polmone, rene e 38, 39, 40, 41. Tuttavia, i meccanismi mediante i quali CSF comunica con NSC e se cilia primaria sono coinvolti non sono noti. NSC aderenti in coltura sono ciliato; localizzare componenti della via Shh, come Smo e Gpr161 in cilia; e sono Shh reattivo 42. Così, NSC possono servire come un importante sistema modello per studiare il percorso Shh, il traffico ciliare, e percorsi di differenziazione neuronale. Inoltre, i neuroni differenziati da NSC possono essere utilizzati anche per saggi traffico ciliare. Neurosfere sono costituiti da gruppi di cellule fluttuanti derivanti dalla proliferazione di neural cellule staminali / progenitrici che crescono in presenza di fattori di crescita specifici e superfici non adesivo 43, 44. Neurosfere servono come importante in modelli di coltura in vitro per studiare le cellule staminali / progenitrici neurali nello sviluppo normale e malattie 31, 45, 46, 47. Qui, descriviamo un saggio neurosfere-based per la coltura di cellule progenitrici / staminali neurali e di differenziazione in neuroni / glia. Si sottolinea in particolare il traffico di segnalazione componenti cilia di staminali neurali / cellule progenitrici e neuroni differenziati (Figura 1). Al contrario di coltura neuroni primari, neurosfere primarie sono relativamente facili da coltura, sono suscettibili di passaggi multipli e congelare-disgelo, e possono differenziarsi in neuroni / glia. È importante sottolineare che abbiamo stabilito che neurale neurosfere di derivazionecellule staminali / progenitrici e neuroni dissociati sono Ciliated in coltura e localizzare molecole di segnalazione relativi alla funzione ciliare in questi compartimenti. i metodi di coltura neurosfere-based può servire come un sistema modello ideale per lo studio del traffico ciliogenesis e ciliare in NSC e neuroni differenziati.

<table><tbody><tr><td>Vetro di copertura rotondo da 12 mm</td><td>Fisherbrand</td><td>12-545-80&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>piastra a 24 pozzetti</td><td>Falcon</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldeide (PFA)</td><td>Affymetrix</td><td>19943</td><td></td></tr><tr><td>provetta da 50 mL</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>piastra di Petri 95 mm x 15 mm, coperchio scorrevole</td><td>Fisherbrand</td><td>FB0875714G</td><td>piastra da 10 cm</td></tr><tr><td>70 &; filtro per cellule m</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Affinipure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>711-545-152</td><td>Donkey anti Rabbit, Alexa 488 anticorpo secondario</td></tr><tr><td>Arl13B, clone N295B/66</td><td>Neuromab</td><td>AB_11000053</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement (50X),</td><td></td><td></td><td></td>centrifuga ThermoFisher Scientific 17504001 B27 senza siero</tr><tr><td></td><td>Thermo scientific</td><td>ST 40R</td><td></td></tr><tr><td>Fiala criogenica</td><td>Corning</td><td>430488</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Deossiribonucleasi I da pancreas bovino</td><td>Sigma</td><td>D5025-15KU</td><td>Dnase I</td></tr><tr><td>Dimetil solfossido</td><td>Sigma</td><td>D8418-100ML</td><td>DMSO</td></tr><tr><td>Stampi monouso per campioni di vinile</td><td>Sakura Tissue-Tek Cryomold</td><td>4565</td><td>10 mm x 10 mm x 5 mm</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco 10X, modificata, senza cloruro di calcio e cloruro di magnesio, liquida, filtrata sterile, adatta per colture cellulari</td><td>Sigma</td><td>D1408-500ML</td><td>DPBS</td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinze</td><td>Strumenti per la scienza</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F9026-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione</td> <td>Fluoromount-GSouthern Biotech</td><td>0100-01</td><td>soluzione di montaggio</td></tr><tr><td>GFAP</td><td>DAKO</td><td>Z0334</td><td></td></tr><tr><td>Capra anti Mouse IgG1 Anticorpo, Alexa Fluor 555 coniugato</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-21127</td><td>Capra anti Mouse IgG1, Alexa 555 anticorpo secondario</td></tr><tr><td>Capra anti Mouse IgG2a, Alexa Fluor 555 coniugato</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-21137</td><td>Capra anti Mouse IgG2a, Alexa 555 anticorpo secondario</td></tr><tr><td>Gpr161</td><td>fatto in casa</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>umano bFGF</td><td>Sigma</td><td>F0291</td><td></td></tr><tr><td>Emocitometro</td><td>FGF Hausser Scientific</td><td>Neubauer migliorato</td><td>profondo 0,100 mm</td></tr><tr><td>Isothesia</td><td>Henry Schein</td><td>NDC 11695-0500-2</td><td>Isofluorane</td></tr><tr><td>Laminin da Engelbreth-Holm-Swarm Sarcoma membrana basale</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td>Laminina</td></tr><tr><td>L-Glutammina (200 mM)</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina 3000 Reagente di trasfezione</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L3000</td><td></td></tr><tr><td>Mr. Frosty</td><td>Nalgene</td><td>5100-0036</td><td></td></tr><tr><td>Integratore N-2 (100X)</td><td>ThermoFisher Scientific 17502001</td><td></td><td>N2</td></tr><tr><td>Medium neurobasale</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Siero d'asino normale</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Composto OCT</td><td>Sakura Tissue-Tek</td><td>4583</td><td>OCT</td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Sigma</td><td>P4333-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-lisina (PLL)</td><td>Sigma</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Proteina EGF umana ricombinante,</td><td>sistemi CF R e D</td><td>236-EG-200</td><td></td></tr><tr><td>Forbice</td> EGF <td>Strumenti per la scienza</td><td>14060-10</td><td></td></tr><tr><td>Vetrino per microscopio Superfrost plus</td> Fisher <td>scientific</td><td>12-550-15</td><td>vetrini</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0407</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di tripsina-EDTA (10X)</td><td>Sigma</td><td>T4174-100</td><td>Piastra</td></tr> a <tr><td>6 pozzetti Tripsina COSTAR, con coperchio Fondo piatto Superficie di attacco ultrabassa Polistirene, sterile</td><td>Corning</td><td>3471</td><td>Piastra a 6 pozzetti a bassissimo legame</td> &</tr><tr><td>beta;-tubulina III</td><td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td>TUJ1</td></tr></tbody></table>

utilizzando colture di neurosfere primarie al primario dello studio cilia

Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia

Il cilio primario è di fondamentale importanza per la proliferazione delle cellule staminali/progenitrici neurali e per la differenziazione neuronale durante la vita embrionale, postnatale e adulta. Inoltre, la maggior parte dei neuroni differenziati possiede ciglia primarie che ospitano recettori di segnalazione, come i recettori accoppiati a proteine G, e molecole di segnalazione, come le adenilil ciclasi. Il cilio primario determina l'attività di molteplici vie di sviluppo, tra cui la via del riccio sonico durante lo sviluppo neuronale embrionale, e funziona anche nel promuovere la segnalazione subcellulare compartimentalizzata durante la funzione neuronale adulta. Non sorprende che i difetti nella biogenesi e nella funzione del cilio primario siano stati collegati ad anomalie dello sviluppo del cervello, obesità centrale e deficit di apprendimento e memoria. Pertanto, è imperativo studiare la biogenesi del cilio primario e il traffico ciliare nel contesto delle cellule staminali/progenitrici neurali e dei neuroni differenziati. Tuttavia, i metodi di coltura per i neuroni primari richiedono una notevole esperienza e non sono suscettibili di cicli di congelamento-scongelamento. In questo protocollo, discutiamo i metodi di coltura per popolazioni miste di cellule staminali/progenitrici neurali utilizzando neurosfere primarie. I metodi di coltura basati sulla neurosfera offrono i vantaggi combinati dello studio delle cellule staminali/progenitrici neurali primarie: adattabilità a passaggi multipli e cicli di congelamento-scongelamento, potenziale di differenziazione in neuroni/glia e trasfettibilità. È importante sottolineare che abbiamo determinato che le cellule staminali/progenitrici neurali derivate dalla neurosfera e i neuroni differenziati sono ciliati in coltura e localizzano molecole di segnalazione rilevanti per la funzione ciliare in questi compartimenti. Utilizzando queste colture, descriviamo ulteriormente i metodi per studiare la ciliogenesi e il traffico ciliare nelle cellule staminali/progenitrici neurali e nei neuroni differenziati. Questi metodi basati sulla neurosfera ci consentono di studiare i percorsi cellulari regolati dalle ciglia, tra cui il recettore accoppiato a proteine G e la segnalazione del riccio sonico, nel contesto delle cellule staminali/progenitrici neurali e dei neuroni differenziati.

Dopo la placcatura le cellule dalla SVZ in terreno NSC per una settimana, neurosfere galleggianti sono stati osservati (Figura 2A). Le dimensioni delle sfere variavano tra 50 e 200 um. Per esaminare se le sfere sono state derivate da cellule staminali / progenitrici neurali, le neurosfere furono piastrate su PLL- e coprioggetto in terreno NSC laminina rivestite per 2 giorni. Sono stati poi immunostained contro il marcatore staminali / progenitrici neurali delle cellule, ...

Cilium principale è di fondamentale importanza nella proliferazione delle cellule progenitrici neurali, la differenziazione neuronale e la funzione neuronale adulta. Qui, si descrive un metodo per studiare ciliogenesis e il traffico di segnalazione proteine ​​di cilia nelle cellule staminali / progenitrici neurali e neuroni differenziati utilizzando colture di neurosfere primarie.

Utilizzando colture di neurosfere primarie al primario dello studio Cilia

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, ...

L'obiettivo generale di questa procedura è utilizzare metodi di coltura basati su neurosfere per cellule staminali neurali e progenitrici primarie al fine di studiare la biogenesi e il traffico del ciglio primario. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dei cigli primari, come la biogenesi dei cigli e il traffico delle molecole cigliari verso i cigli primari. Nelle cellule staminali neurali primarie, nei progenitori neurali e nei neuroni.Il vantaggio principale di questa tecnica è che possiamo utilizzare i criteri principali delle cellule staminali neurali, dei progenitori neurali e dei neuroni per analizzare la biogenesi e i percorsi ciliari nel contesto del ciglio primario. In generale, le persone nuove rispetto a questo metodo incontreranno difficoltà, poiché la coltivazione delle cellule staminali neurali è tecnicamente impegnativa per i principianti. Mostreremo una dimostrazione di questo metodo, che è fondamentale, poiché la dissezione del ventricolo laterale e le fasi come la coltivazione di neurosfere e la quantificazione dei cigli primari possono essere apprese facilmente osservando i passaggi critici.Iniziare questa procedura con una z

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JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Qui si descrive un protocollo dettagliato per la generazione simultanea di colture di cellule precursore neuronali, sia come monostrati aderenti o neurosfere, dalla zona subventricolare e giro dentato di singoli topi adulti.

Un mouse, due culture: isolamento e la coltura di Adult Neural Stem Cells dalle due zone neurogena Mice individuale

Presentato qui è un protocollo per la generazione spontanea di neurosfere arricchite in cellule progenitrici neurali da neuroni placcati ad alta densità. Durante lo stesso esperimento, quando i neuroni sono placcati ad una densità inferiore, il protocollo si traduce anche in colture di neuroni ratti primari prolungati.

Generazione di neurosfere da neuroni ippocampali primari misti e corticali isolati da E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo

Condurre esperimenti in vitro per riflettere le condizioni in vivo nel modo più adeguato possibile non è un compito facile. L'uso delle colture cellulari primarie è un passo importante verso la comprensione della biologia cellulare in un intero organismo. Il protocollo fornito descrive come crescere e coltivare neuroni cerebellari embrionali del topo.

Cultura primaria dei neuroni isolata dal cerbellello del topo embrionale

Le ciglia primarie sono strutture extracellulari associate al centriole. Il rilevamento delle ciglia primarie mediante colorazione immunofluorescente è una procedura relativamente semplice che si traduce in immagini di altissima qualità. In questo protocollo, i fibroblasti che esprimevano ciglia primarie sono stati fissati, immunizzati e immagini in un microscopio fluorescente o confocale.

Semplice rilevamento delle ciglia primarie per immunofluorescenza

L'uso dell'intelligenza artificiale (Ai) per analizzare le immagini sta emergendo come un approccio potente, meno parziale e rapido rispetto ai metodi comunemente usati. Qui abbiamo addestrato Ai a riconoscere un organello cellulare, ciglia primarie e analizzare proprietà come la lunghezza e l'intensità della colorazione in modo rigoroso e riproducibile.

Approcci di intelligenza artificiale per valutare le ciglia primarie

Presentiamo protocolli dettagliati per la generazione e la caratterizzazione di modelli 2D e 3D basati su cellule staminali pluripotenti indotte umane (hIPSC) di sviluppo neocorticale, nonché metodologie complementari che consentono l'analisi qualitativa e quantitativa della biogenesi e della funzione del cilio primario (PC).

Modelli 2D e 3D basati su cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo per sezionare il coinvolgimento primario del cilio durante lo sviluppo neocorticale

Qui, presentiamo un protocollo di elettroporazione riproducibile in vitro per la manipolazione genetica dei precursori delle cellule del granulo cerebellare primario (GCP) che è economico, efficiente e praticabile. Inoltre, questo protocollo dimostra anche un metodo semplice per lo studio molecolare delle vie di segnalazione primarie del riccio cilio-dipendenti nelle cellule GCP primarie.

Metodo di elettroporazione efficiente ed economico per studiare le vie di segnalazione cilium-dipendenti primarie nel precursore della cella del granulo

Qui, descriviamo un sistema di nucleofecazione progettato per migliorare l'efficienza del rilascio genico in cellule staminali neurali espanse (NSC) isolate dalla zona subventricolare murina adulta. I risultati dimostrano che questo metodo migliora significativamente la perturbazione genica nelle NSC, superando l'efficacia dei protocolli di trasfezione tradizionali e migliorando il tasso di sopravvivenza cellulare.

Isolamento, espansione e nucleofezione di cellule staminali neurali dalla zona subventricolare murina adulta

Questo metodo descrive lo sfruttamento del segnale endogeno in un modello murino transgenico ARL13B-CENTRIN-2 per visualizzare le ciglia primarie in situ, in tre dimensioni su ampie aree di tessuto mineralizzato, dalla raccolta dei tessuti all'analisi dell'organizzazione delle ciglia. Questo protocollo può essere applicato anche ad altri tipi di tessuti.

Imaging volumetrico e analisi delle ciglia primarie nel tessuto muscoloscheletrico utilizzando il modello murino ARL13B-CENTRIN-2

La coltura di goccioline verticali ex vivo è un'alternativa alle attuali tecniche sperimentali in vitro e in vivo. Questo protocollo è facile da eseguire e richiede piccole quantità di reagente, consentendo al contempo la capacità di manipolare e studiare la vascolarizzazione, la morfogenesi e l'organogenesi fetale.

Utilizzando<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Upright Droplet Culture di interi organi fetali per studiare i processi evolutivi durante mouse Organogenesi

Scopri come studiare la biogenesi e il traffico delle ciglia primarie nelle cellule staminali neurali utilizzando colture di neurosfere. Questo metodo fornisce un modello rilevante per la ricerca in neuroscienza.

Utilizzando colture di neurosfere primarie al primario dello studio Cilia

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