Utilizzando colture di neurosfere primarie al primario dello studio Cilia

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di utilizzare metodi di coltura basati sulla neurosfera per cellule staminali neurali primarie e progenitrici per studiare la biogenesi e il traffico del cilio primario. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle ciglia primarie come la biogenesi delle ciglia e il traffico di molecole di ciglia alle ciglia primarie. Nelle cellule staminali neurali primarie, nei progenitori neurali e nei neuroni.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che possiamo utilizzare i criteri delle cellule staminali neurali, dei progenitori neurali e dei neuroni per analizzare la biogenesi e le vie ciliari nel contesto del cilio primario. In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché la coltura di cellule staminali neurali è tecnicamente impegnativa per i principianti. Mostreremo che una dimostrazione di questo metodo è fondamentale, poiché la dissezione del ventricolo laterale e passaggi come la coltura delle neurosfere e la quantificazione delle ciglia primarie sono facilmente appresi osservando i passaggi critici.

Iniziare questa procedura con una zona subventricolare del ventrico laterale sezionata da un topo adulto utilizzando il metodo di dissezione dell'intera montatura. Posizionare il fazzoletto contenente la SVZ in una provetta da 1,5 millilitri. Aggiungere 500 microlitri di tripsina-EDTA allo 0,05% in PBS e incubare 15 minuti a 37 gradi Celsius a bagnomaria.

Dopo l'incubazione, aggiungere 500 microlitri di terreno di arresto e pipettare delicatamente da 20 a 30 volte utilizzando un puntale da 1 millilitro. Evitare la formazione di bolle d'aria durante il pipettaggio. Successivamente, centrifugare le celle a 500 volte G per otto minuti.

Scartare il surnatante, quindi aggiungere 1 millilitro di PBS e risospendere le cellule pipettando delicatamente cinque volte utilizzando una punta da 1 millilitro. Centrifugare a 500 volte G per otto minuti. Quindi aspirare il terreno utilizzando una punta da 1 millilitro e aggiungere 1 millilitro di terreno basale.

Dopo aver contato le cellule, piastrarle da una SVZ in un piatto di 10 centimetri con 10 millilitri di terreno NSC e coltivare a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Dopo cinque-sette giorni, si possono osservare le neurosfere. Per analizzare le cellule nelle neurosfere attaccate mediante immunocolorazione, trasferire 1 millilitro di terreno contenente più neurosfere in una provetta da 1,5 millilitri e ruotare a 500 volte G per otto minuti.

Dopo aver rimosso il terreno, fissare le sfere con il 4% di paraformaldeide per 15 minuti. Dopo aver rimosso la paraformaldeide, incubare le sfere con il 30% di saccarosio, per una notte. E poi centrifugare di nuovo.

Lavare con PBS. Quindi, dopo la centrifugazione come prima, rimuovere e scartare il surnatante. Quindi, inserire una pipetta con un puntale tagliato da 1 millilitro e pipettare 500 microlitri di soluzione OCT sulle neurosfere.

Trasferire la soluzione OCT contenente le neurosfere in uno stampo di plastica monouso per il congelamento. Quindi, congelare lo stampo su ghiaccio secco per almeno 15 minuti. Tagliare le sezioni con un criostato.

Per visualizzare le cellule staminali nella neurosfera, eseguire l'immunocolorazione contro il marcatore delle cellule staminali Nestin. Per visualizzare le ciglia primarie in una neurosfera, eseguire l'immunocolorazione contro ARL13B. Inizia questo esperimento uno o due giorni dopo aver seminato cellule staminali neurali dissociate aderenti su vetrini di copertura rivestiti di poli-L-lisina e laminina.

Cambiare il terreno nei pozzetti sperimentali in terreno di fame e in terreno NSC fresco nei pozzetti di controllo. Incubare per altre 24 ore. Il giorno successivo, fissare le cellule con il 4% di paraformaldeide in PBS per 15 minuti a temperatura ambiente.

Dopo il fissaggio, lavare con PBS due volte per cinque minuti ciascuna, a temperatura ambiente. E poi eseguire l'immunofluorescenza utilizzando protocolli standard. Montare i vetrini coprioggetto con la soluzione di montaggio.

Quindi, asciugare il vetrino per una notte a temperatura ambiente al buio. Il giorno successivo, acquisire immagini su un microscopio composto all'ingrandimento necessario. La fotocamera e gli obiettivi del microscopio devono essere controllati utilizzando il software in dotazione.

Prendi sezioni Z sufficienti a intervalli da 0,5 a 0,8 micron. Per l'analisi quantitativa della localizzazione ciliare nelle cellule aderenti, selezionare da tre a otto campi consecutivi con cellule confluenti visualizzando il canale DAPI. Acquisisci pile di immagini da ogni campo.

Quantifica il numero di ciglia primarie utilizzando ImageJ. Aprire la finestra di dialogo Analizza plug-in e selezionare lo strumento Contatore celle per contare le celle con ciglia GPCR positive. Utilizza parametri di intensità e contrasto dell'immagine simili per tutte le immagini dello stesso esperimento a scopo di conteggio ed esportazione.

24 ore dopo la coltura le cellule dissociate nel terreno NSC o nel terreno di digiuno, le cellule sono state fissate e immunocolorate contro GPR161 mostrato in verde, ARL13B che appare rosso e DNA mostrato come blu. Le ciglia GPR161 positive sono osservate nelle cellule di controllo a sinistra e nelle cellule affamate a destra. Come si vede in queste viste ingrandite.

Le frecce bianche e le punte di freccia indicano rispettivamente le ciglia positive e negative GPR161. Questa immagine mostra la quantificazione delle cellule ciliate positive per ARL13B. La quantificazione viene eseguita da due campi di vista, ciascuno da due repliche tecniche di un singolo esperimento.

La percentuale di cellule ciliate positive per ARL13B aumenta dopo la fame. Questa immagine mostra la quantificazione della localizzazione di GPR161 nelle ciglia ARL13B positive nelle cellule di controllo e nelle cellule affamate. La percentuale di GPR161 che si localizza nelle ciglia ARL13B positive, aumenta anche dopo la fame.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in meno di due ore se eseguita correttamente. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire un altro metodo di coltura di cellule derivate dal tumore primario per rispondere a ulteriori domande come il ruolo delle ciglia nella genesi del tumore. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle ciglia primarie per esplorare la biogenesi ciliare e il traffico nei sistemi basati sulla neurosfera primaria.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come analizzare le ciglia primarie nelle cellule staminali neurali, nei progenitori neurali e nei neuroni derivati da colture basate sulla neurosfera.