Scaling di Engineered vascolari innesti Usando 3D Stampato Guide e il metodo di impilamento Anello

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di generare in modo robusto e coerente vasi sanguigni ingegnerizzati di qualsiasi dimensione. Questa tecnica consente l'ingegnerizzazione affidabile ed efficace dei vasi sanguigni. Il vantaggio principale di questa tecnica è che i recipienti di qualsiasi dimensione possono essere fabbricati in modo semplice e affidabile.

Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando stavamo discutendo su come ingegnerizzare un tubo di tessuto e abbiamo paragonato il nostro metodo alla costruzione di tunnel stradali, un segmento alla volta. Per preparare gli inserti stampati in 3D, aggiungere prima uno strato sottile di due, quattro o sei ml di silicone non polimerizzato sul fondo di una piastra di Petri da 35, 60 o 100 millimetri, rispettivamente. Per creare i montanti per le piastre da 35 mm, versare il PDMS in un'altra piastra da 100 mm a un'altezza di sette mm e riscaldare il PDMS su una piastra riscaldante a 60 gradi Celsius per due o tre ore.

Quando il PDMS è indurito, utilizzare un punzone per biopsia da cinque mm per creare perni cilindrici. Utilizzando una piccola quantità di PDMS non polimerizzato per fissare i cilindri al centro di ciascuna piastra da 35 mm. Posiziona un guscio esterno stampato in 3D di circa 66,7 mm di diametro equidistante dal palo nelle piastre da 100 mm.

Prima che il PDMS nella parte inferiore delle piastre da 60 e 100 mm sia polimerizzato, posizionare i perni stampati in 3D da 10 e 20 mm di diametro centralmente in ciascuna piastra rispettivamente da 60 e 100 mm. Lasciare indurire le stoviglie all'aria aperta sulla piastra riscaldante a 60 gradi Celsius per due o tre ore, seguite da diciotto ore di degasaggio del polimero. Al termine del degasaggio, sterilizzare l'interno di tutte le piastre con etanolo al 70% e coprire ogni piastra per 30 minuti.

Quindi aspirare con cura l'etanolo da ciascuna piastra per consentire l'asciugatura all'aria. Quando le piastre sono asciutte, trasferirle in una cabina di sicurezza biologica accanto ai corrispondenti coperchi rivolti verso l'alto. ed esporre i materiali alla luce UV per 30 minuti per completare la sterilizzazione.

Per preparare l'idrogel di fibrina, aggiungere prima 0,5, 1,1 e 1,81 ml di terreno di coltura integrato con gel di fibrina e TGF Beta 1 rispettivamente a piastre di coltura da 35, 60 e 100 mm. Quindi, aggiungere 40 88,4 e 145 microlitri di trombina rispettivamente alle piastre da 35, 60 e 100 mm e agitare delicatamente ciascuna piastra a mano. Quando la trombina è distribuita uniformemente, aggiungere 160, 354 e 580 microlitri di fibrinogeno con un movimento circolare a goccia alla miscela di terreno di trombina nelle piastre da 35, 60 e 100 mm, rispettivamente, e agitare delicatamente le piastre per distribuire uniformemente l'idrogel.

Lasciare indurire l'idrogel per 10-15 minuti a temperatura ambiente. Quindi tripsinizzare le cellule muscolari lisce di interesse, espanse in piastre di coltura cellulare da 150 mm, e raccogliere le cellule staccate mediante centrifugalizzazione. Risospendere i pellet in tre ml di terreno di differenziazione e utilizzare una pipetta da due ml per triturare vigorosamente le cellule per rompere eventuali grumi di cellule.

Dopo il conteggio, dividere le cellule in 2/10 10 alla 6a, 1/10 10 alla 7a e 1,4 x 10 alla 7a per ml di aliquote in provette coniche da 50 ml, etichettate in base alle corrispondenti piastre di coltura. Aggiungere il terreno di differenziazione a ciascuna provetta per ottenere volumi di semina finali di due, quattro e cinque mL rispettivamente per ogni piastra da 35, 60 e 100 mm. Quindi, aggiungere con cautela le soluzioni cellulari goccia a goccia sull'idrogel preparato in ciascuna piastra corrispondente per l'espansione nell'incubatore per colture cellulari. Dopo due o quattro giorni gli anelli si saranno completamente contratti verso i loro pali.

Quindi aggiungere 10, 20 o 35 mL di TGF Beta 1 a ciascun anello da 35, 60 e 100 mm, rispettivamente. Per assemblare il costrutto vascolare per il vaso da 35 mm, tagliare una sezione di due pollici dalla parte superiore di un tubo conico in policarbonato da 50 ml e PDMS incolla il bordo superiore in una piastra da 35 mm per creare una piastra alta per l'impilamento degli anelli. Per le piastre di impilamento ad anello alte da 60 e 100 mm, tagliare un tubo in policarbonato di 1,75 pollici di diametro in sezioni di 2,5 pollici nel senso della lunghezza per fungere da pareti alte della piastra.

Per i fondi alti della piastra, tagliare una lastra di policarbonato spessa 0,125 pollici in pezzi circolari di due pollici di diametro. Utilizzando cemento acrilico solvente, legare le sezioni del tubo in policarbonato ai pezzi tagliati circolari. Stampa in 3D pali da cinque, dieci e 20 mm di diametro con una lunghezza di 50 mm.

Quindi aggiungere 10 ml di silicone non polimerizzato a ciascun contenitore, posizionando centralmente ogni perno stampato in 3D in ciascun contenitore da 35, 60 e 100 mm prima che il PDMS sia completamente polimerizzato. E posizionare i piatti su una piastra a 60 gradi Celsius per due o tre ore. Quando il PDMS è indurito, sterilizzare le piastre con etanolo al 70% come appena dimostrato, seguito dall'esposizione dei contenitori sterilizzati con etanolo essiccato alla luce UV per 30 minuti.

Ora, usa due paia di pinze molto sottili per sollevare con cautela prima un lato, e poi l'altro, di un anello di idrogel a muscolo liscio strettamente arrotolato dal suo post. Quindi far scorrere con cautela un lato dell'anello e poi l'altro sul montante alto del contenitore più grande di dimensioni successive corrispondente. Lavorando circonferenzialmente, con movimenti delicati e graduali, spingere lentamente l'anello lungo il perno, impilando successivamente ulteriori anelli di tessuto fino a ottenere la lunghezza del vaso desiderata.

Quando tutti gli anelli sono stati impilati, girare le piastre in modo che i montanti siano paralleli alla superficie di lavoro e aggiungere delicatamente 40, 80 e 160 microlitri di trombina alla superficie esterna di ciascun recipiente da 35, 60 e 100 mm rispettivamente ruotando lentamente le piastre. Quindi, aggiungere 40, 80 e 160 microlitri di Fibrinogeno a ciascun costrutto da 35, 60 e 100 mm rispettivamente, il più rapidamente e uniformemente possibile, ruotando rapidamente il costrutto. La trombina e il fibrinogeno si fissano rapidamente in un gel solido dopo la miscelazione.

Quindi aggiungere 20 mL di terreno di differenziazione a ciascun contenitore di costruzione e posizionare i recipienti in un incubatore a 37 gradi Celsius fino al momento del bisogno. L'analisi istologica rivela un'elevata cellularità in tutte le dimensioni degli anelli, con una piccola quantità di gel di Fibrina residua osservata sui bordi esterni dei piccoli anelli. Negli anelli più grandi un po' di gel di fibrina è intervallato dal contenuto cellulare, con indicazioni di produzione di collagene evidenti sia negli anelli intermedi che in quelli grandi.

L'analisi dell'anello tissutale per l'espressione dell'actina della muscolatura liscia alfa e della tropomiosina rivela che tutte le dimensioni dell'anello sono positive per entrambi gli anticorpi, verificando che il fenotipo della muscolatura liscia è stato mantenuto. Le prove di trazione indicano una tendenza costante all'aumento della resistenza correlata a un aumento delle dimensioni dell'anello e del recipiente in tutte e tre le dimensioni degli anelli. I numeri di semina delle celle per la creazione delle varie dimensioni dell'anello sono correlati anche all'area della superficie di semina.

Questi costrutti di recipienti sono anche in grado di resistere a flussi fino a cinque minuti a velocità di flusso da 100 a 417 ml al minuto, con solo lievi perdite osservate nel punto in cui i recipienti si collegano al sistema di profusione. Una volta padroneggiati, gli anelli possono essere ingegnerizzati in un'ora se la tecnica viene eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di mescolare accuratamente i componenti dell'idrogel per garantire l'impostazione del gel e la corretta formazione dell'anello.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come la creazione di anelli di altri tipi di cellule, per l'ingegnerizzazione di altri tipi di tessuti. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare il metodo di impilamento degli anelli per progettare tessuti vascolari di varie dimensioni.