Valutazione della posizione intracellulare di specie reattive dell'ossigeno in spermatozoi Solea Senegalensis
11 marzo 2018
Questo protocollo descrive una dettagliata metodologia per la rilevazione di localizzazione di H2O2 all'interno di spermatozoi, Solea senegalensis utilizzando un fluorocromo sensibile DCFH-DA ROS, una macchia di mitocondri dal vivo per i mitocondri, e DAPI per nuclei visualizzazione, rispettivamente. Il protocollo è progettato per essere eseguito all'interno di 2 h con gli spermatozoi o freschi o scongelati.
L'obiettivo generale di questo esperimento è valutare la localizzazione intracellulare delle specie reattive dell'ossigeno all'interno degli spermatozoi di Solea senegalensis mediante microscopia confocale. Le specie reattive dell'ossigeno compromettono la funzionalità spermatica efficace, causando danni cellulari a diversi livelli. Gli spermatozoi potrebbero essere particolarmente sensibili allo stress ossidativo, poiché la perossidazione lipidica può produrre un effetto negativo sulla motilità e sulla fecondazione.
Le specie reattive dell'ossigeno possono persino innescare una via intrinseca di apoptosi. Il perossido viene rilasciato dai mitocondri ed è in grado di penetrare nel nucleo, alterando il DNA, poiché è una piccola molecola neutra. In questo protocollo utilizziamo un fluorocromo che, dopo essere stato incorporato nella cellula, può essere modificato da una reazione ossidativa, emettendo fluorescenza verde.
Pertanto, è possibile conoscere esattamente la localizzazione delle specie reattive dell'ossigeno. In questo video lavoriamo con gli spermatozoi di Solea senegalensis, ma è possibile utilizzare questo protocollo con specie imparentate di interesse commerciale, o con madri come Sibrifis o Mirica. Alcuni esempi dell'utilizzo di questa tecnica nei campi della biologia redox o dell'apicoltura sono.
La valutazione della crioprecipitazione seguendo i protocolli. Il confronto delle etichette delle specie reattive dell'ossigeno prima e dopo questa attivazione degli spermatozoi. Oppure è possibile correlare le etichette delle specie reattive dell'ossigeno con i soggetti con buona e cattiva respirazione.
Prima di tutto, preparare le soluzioni stock dei fluorocromi. Tenere presente che la manipolazione dei fluorocromi deve essere effettuata seguendo le raccomandazioni della scheda di dati di sicurezza. È necessario prestare particolare attenzione durante la pesatura e la preparazione delle soluzioni stock.
Mantenere le soluzioni stock in aliquote a meno 20 gradi centigradi fino al momento dell'uso. In questo protocollo utilizziamo tre fluorocromi. Il colorante fluorescente nel vicino infrarosso marca i mitocondri nelle cellule vive e può essere utilizzato per la localizzazione mitocondriale.
DAPI, che è un'ampiamente utilizzata sonda nella microscopia fluorescente per la colorazione del DNA. Si lega fortemente a regioni ricche di adenina e timina nel DNA. E, il 27-diclorofluoresceina diacetato è una sonda non fluorescente permeabile alle cellule.
Viene deesterificato a livello intracellulare e si trasforma in 27-diclorofluoresceina altamente fluorescente in seguito all'ossidazione. Questo protocollo può essere avviato con spermatozoi freschi o criopreservati. In questo caso, abbiamo utilizzato un campione criopreservato.
Preparare un bagno per la scongelazione a 40 gradi centigradi. Pulire il materiale. Con la protezione corporea adeguata, selezionare la propria cannuccia criopreservata.
Immergere la cannuccia nel bagno per sette secondi. Utilizzando delle forbici, trasferire il campione scongelato in una provetta per microcentrifuga. Lavorare sempre a quattro gradi centigradi.
Centrifugare il campione per un minuto. Rimuovere con attenzione i crioprotettanti senza alterare i pellet di sowels. Risospendere in un piccolo volume di 50 o 100 microlitri di soluzione RINGA.
Caricare in una nuova camera di Bürker o in una camera di conteggio simile una diluizione della sospensione cellulare e contare le cellule. Calcolare la concentrazione del campione. Diluire la sospensione cellulare fino a uno-due milioni di cellule per millimetro in un volume finale di 0,5 millilitri in soluzione RINGA pre-raffreddata.
Gli spermatozoi devono essere manipolati delicatamente durante la pipettatura e la risospensione. Aggiungere 3,125 microlitri di soluzione stock di diacetato di diclorofluoresceina alla soluzione campione di lavoro. La concentrazione finale nel campione è di 25 micromolare.
Incubare a quattro-sette gradi centigradi per 40 minuti. Dopo 30 minuti, aggiungere al campione 0,5 microlitri della soluzione madre di DAPI e 0,5 microlitri della soluzione madre del colorante per i mitocondri. Entrambi i fluorocromi hanno un tempo di incubazione di 10 minuti.
Posizionare una goccia di sospensione cellulare concentrata da cinque microlitri su un vetrino. Posizionare con attenzione un coprioggetto sulla preparazione e sigillarla. Accendere l'apparecchiatura e selezionare l'obiettivo con ingrandimento 100x nel pannello di controllo.
Posizionare il campione sul microscopio e accendere la lampada. Il software del sistema consente di selezionare direttamente da un elenco i fluorocromi necessari. Selezionare il set.
DAPI, con massimo di eccitazione di 465 nanometri, MitoTracker Deep Red con massimo di eccitazione di 662 nanometri, e DCF con un massimo di emissione di 525 nanometri. Deviare il fascio verso gli oculari. Mettere a fuoco un campo di interesse.
Ritornare al software e selezionare la dimensione del fotogramma. Impostare la modalità di scansione bidirezionale per una migliore risoluzione. Scegliere la velocità di scansione desiderata.
Aprire e centrare l'area di scansione per iniziare. Scattare un'immagine del campo. Utilizzando lo strumento di ritaglio, selezionare la regione di interesse e premere Live.
Quindi avrai selezionato la tua area di lavoro. Con l'aiuto dello strumento indicatore di intervallo, regola l'offset digitale per ridurre lo sfondo. Esegui questa operazione per ogni canale e acquisisci l'immagine.
Questo è un esempio dei risultati. Per un'immagine sovrapposta, singoli canali per ciascun fluorocromo e le loro combinazioni. Questo è uno schema di etichettatura di una cellula spermatica di Solea senegalensis.
Dopo aver visualizzato le immagini acquisite, si può osservare che DAPI e MitoTracker sono, come previsto, localizzati rispettivamente all'interno del nucleo e dell'anello mitocondriale. Il primo passo consiste nell'eseguire un esperimento di zed-stack. Accedere alla finestra di zed-stack e, con l'aiuto della messa a fuoco fine, selezionare la prima e l'ultima posizione di acquisizione.
Scegliere i parametri ottimali di acquisizione ed eseguire l'esperimento. Si otterranno immagini per ogni vetrino. Questo è un esempio di un risultato di zed-stack.
È possibile separare i canali e osservare la localizzazione di ciascun segnale all'interno delle cellule. Passando alla finestra 3D, è possibile selezionare diverse opzioni di grafico. Si possono personalizzare numerosi parametri e separare o unire i canali.
Questo è un esempio di viste tridimensionali che mostrano diversi modelli di localizzazione delle specie reattive dell'ossigeno all'interno dello sperma di Solea senegalensis. Nel campo superiore, il DCF è principalmente colocalizzato con i mitocondri; mentre, nel campo inferiore, il segnale si estende al nucleo. Dopo aver visto questo video, saprai come valutare la localizzazione intracellulare dei perossidi in questi spermatozoi utilizzando la microscopia confocale.
È possibile trovare consigli per la risoluzione dei problemi e altre informazioni nel testo.
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Panoramica
Questo protocollo descrive una metodologia per rilevare la localizzazione di H2O2 negli spermatozoi di Solea senegalensis mediante l'utilizzo di DCFH-DA per le specie reattive dell'ossigeno, un colorante per i mitocondri vitali e DAPI per la visualizzazione dei nuclei. La procedura può essere completata in 2 ore, utilizzando spermatozoi freschi o scongelati.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Biologia della riproduzione
Sfondo
- Le specie reattive dell'ossigeno (ROS) svolgono un ruolo cruciale nella funzione spermatica.
- Lo stress ossidativo può influenzare negativamente la motilità spermatica e la fecondazione.
- Il perossido rilasciato dai mitocondri può penetrare nel nucleo e alterare il DNA.
- Comprendere la localizzazione delle ROS è essenziale per valutare la salute spermatica.
Scopo dello studio
- Valutare la localizzazione intracellulare delle specie reattive dell'ossigeno negli spermatozoi di Solea senegalensis.
- Valutare l'impatto dello stress ossidativo sulla vitalità spermatica.
- Utilizzare la microscopia confocale per una visualizzazione dettagliata delle componenti cellulari.
Metodi Utilizzati
- Utilizzo del fluorocromo DCFH-DA per rilevare le ROS.
- Colorazione dei mitocondri vitali per visualizzare l'attività mitocondriale.
- Colorazione con DAPI per la visualizzazione dei nuclei.
- Microscopia confocale per l'acquisizione di immagini e l'analisi.
Risultati principali
- Localizzazione riuscita di H2O2 all'interno degli spermatozoi.
- Identificazione degli effetti dello stress ossidativo sulla motilità spermatica.
- Visualizzazione delle interazioni mitocondriali e nucleari con le ROS.
- Dimostrazione dell'efficienza del protocollo entro un arco temporale di 2 ore.
Conclusioni
- Il protocollo rivela in modo efficace la localizzazione delle specie reattive dell'ossigeno negli spermatozoi.
- I risultati contribuiscono alla comprensione dello stress ossidativo in biologia della riproduzione.
- La metodologia può essere applicata a ulteriori studi sulla salute e funzionalità spermatica.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La localizzazione quantitativa delle specie reattive dell'ossigeno (ROS) all'interno degli spermatozoi affronta una sfida fondamentale nella biologia della riproduzione e nella ricerca e sviluppo in acquacoltura, dove lo stress ossidativo influisce direttamente sulla vitalità cellulare e sull'integrità genetica. Questo flusso di lavoro basato sulla microscopia confocale consente una mappatura precisa di H2O2 in relazione ai compartimenti mitocondriali e nucleari, supportando la valutazione meccanicistica e predittiva dei protocolli di criopreservazione. L'approccio risulta pertinente per le decisioni strategiche nei percorsi traslazionali in cui la qualità dello sperma e la sua integrità funzionale sono essenziali per la banca genica e i programmi di allevamento.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette l'analisi meccanicistica dei percorsi dello stress ossidativo nella biologia delle cellule gametiche.
- Supporta la riduzione dei rischi biologici chiarificando l'impatto delle specie reattive dell'ossigeno su bersagli nucleari e mitocondriali.
- Facilita una valutazione predittiva affidabile della qualità degli spermatozoi per l'allevamento e la banca del genoma.
Sviluppo di screening e saggi
- Stabilisce saggi di imaging validati per la localizzazione delle specie reattive dell'ossigeno (ROS) in campioni criopreservati e freschi.
- Fornisce output riproducibili e quantitativi per il confronto tra campioni.
- Prepara sistemi biologici standardizzati per lo screening funzionale successivo.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Correla i parametri dello stress ossidativo con biomarcatori tradotti della vitalità spermatica.
- Permette una transizione continua da studi meccanicistici di scoperta a valutazioni precliniche di protocolli di conservazione.
- Supporta l'implementazione graduale di interventi di criopreservazione e fertilità, adeguata al rischio.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo protocollo di imaging confocale si integra nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica nella ricerca e sviluppo nel settore della riproduzione e dell'acquacoltura, fornendo informazioni sia per studi meccanicistici iniziali sia per la validazione traslazionale di strategie di conservazione.
- Biologia della scoperta: Fornisce evidenze dirette del danno cellulare indotto da ROS e della mappatura dei percorsi.
- Screening: Offre output di imaging quantitativi e riproducibili per la standardizzazione dei saggi.
- Analisi: Permette il confronto statistico della localizzazione dei ROS in diverse condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Collega i risultati meccanicistici a endpoint preclinici della qualità e vitalità degli spermatozoi.
- Riutilizzo aziendale: Il protocollo è adattabile a specie correlate e ad altre applicazioni in biologia riproduttiva.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva sulla qualità degli spermatozoi e la comprensione meccanicistica dello stress ossidativo.
- Valore operativo: Standardizza i saggi di localizzazione delle ROS per garantire riproducibilità e scalabilità.
- Valore strategico: Fornisce indicazioni per decisioni di tipo go/no-go riguardo alla criopreservazione e agli investimenti nei programmi di allevamento.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione basata sul rischio delle tecnologie di preservazione e fertilità.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in microscopia confocale e manipolazione di sonde fluorescenti.
- Richiede l'accesso a strumentazione avanzata per l'immagine e a software analitici.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per la preparazione dei campioni e i parametri di acquisizione delle immagini.
- Adattabile a diverse specie di teleostei e specie di interesse commerciale, previa ottimizzazione del protocollo.
- Dipende da un'efficace risoluzione dei problemi e da un rigoroso controllo di qualità per ottenere risultati riproducibili.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:00
Title
1:32
Preparatory work before the experiment
2:58
Sample preparation before fluorochromes incubation
4:40
Fluorochromes incubation
5:33
Sample preparation for confocal microscopy
5:51
Confocal setting up prior to the experiment
6:49
Acquisition of images
7:49
Results
8:24
Creating a 3D image video
9:53
Conclusions
