Name: Raccolta dello sperma aviaria Cloacal massaggi e isolamento di DNA da sperma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Impara la raccolta dello sperma aviario tramite massaggio cloacale e l'estrazione di DNA di alta qualità con kit commerciali modificati. Questo metodo non invasivo è ideale per studi di ecologia evolutiva ed epigenetica.

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Grazie Jose Noguera per intervento tempestivo con massaggio cloacal, e Jeffrey Kittilson per il laboratorio di supporto. Questo lavoro è stato supportato da un premio di ND EPSCoR FAR0022429 a BJH. Spese di pubblicazione sono stati generosamente sostenute dal dipartimento di scienze biologiche di NDSU.

Questo protocollo coinvolge soggetti animali vertebrati ed è stato approvato dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) North Dakota State University.
1. centri di raccolta da un uccello passeriforme utilizzando cloacal massaggi
Nota: Cloacal massaggio è una tecnica di raccolta di sperma efficace sugli uccelli riproduttivo attivi solo, ma può essere eseguita correttamente di fuori della stagione riproduttiva nelle opportune situazioni in cattività. Attività riproduttiva deve essere determinata per specie di destinazione prima di utilizzare massaggio cloacal. Questa tecnica può essere utilizzata su uccelli selvatici al momento cattura o sugli uccelli tenuti in cattività.
<ol><li>A partire con un uccello maschio, (in condizioni di allevamento) presa di Bonetti nella mano non dominante, trasferire l'uccello alla mano dominante con il lato ventrale toccando il palmo (Figura 1).<ol>
<li>Assicurarsi che la testa dell'uccello è più vicino il bordo laterale del palmo della mano. Garantire leggermente la testa e il corpo utilizzando il mignolo, anello e le barrette centrali. Questo lascia l'uccello dello sfiato e coda esposti.</li>
		<li>Lasciare le gambe d'uccello sciolti o leggermente trattenuto usando il palmo.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55324/55324fig1.jpg"> Figura 1 : Presa per massaggi cloacal. L'uccello è protetto con leggerezza nella mano dominante con il lato ventrale toccando la Palma e la testa, protetta dal dito mignolo. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55324/55324fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<ol start="2"><li>Posizionare l'indice e pollice dominante su entrambi i lati dell'estremità superiore della cloaca e leggermente avvicinare le dita esercitando una pressione molto lieve verso la coda ( Figura 2). La cloaca sarà evert, esponendo la mucosa cloacale (interni rosa). Nota: Se l'uccello non è attualmente in produzione dello sperma, la protuberanza cloacal può essere piccola e la cloaca è difficile da evert. Con esperienza, è facile distinguere tra il cloacas i maschi riproduttivi attivi e inattivi5,11.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55324/55324fig2.jpg"> Figura 2 : Dito posizione e protuberanza cloacal. Evert cloaca applicando leggera pressione all'estremità superiore (A). In un passeriforme maschio riproduttivo attivo, è evidente la protuberanza cloacale e impresa (B). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55324/55324fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<ol start="3"><li>Con la mano non dominante, posizionare il cuscinetto del dito indice sul lato dorsale della base della coda per stabilizzare la mano e quindi posizionare la punta del pollice appena sotto la cloaca anteverso. Nota: Una miniatura corta e liscia è vantaggiosa per l'esecuzione di massaggi cloacal e protegge l'uccello da un infortunio accidentale.</li>
	<li>Spostare il pollice non dominante cranialmente e profondo in un movimento ripetitivo con media pressione, restando di sotto della cloaca. Continuare fino a quando l'uccello eiacula. A seconda dell'individuo, ciò avviene in genere tra 1 e parecchi dozzina colpi.</li>
	<li>Non appena l'uccello eiacula, raccogliere lo sperma in un tubo di microhematocrit. Ripetere cloacal massaggio per ottenere più eiacula. Nota: Lo sperma passeriforme è marrone chiaro e in genere ha una consistenza piuttosto densa. Bianche o scure sostanze espulsione dalla cloaca non sono lo sperma e potrebbero contaminare il campione di sperma. L'aspetto di una piccola quantità di sangue sulla cloaca o misto in con lo sperma è solitamente causato da troppa pressione durante il massaggio.</li>
	<li>Per estrazione del DNA, è possibile inserire lo sperma in un tubo del microcentrifuge con 20 µ l di 1X PBS (pH 7.4). Nota: Semen memorizzati in 1X PBS non è adatto per l'inseminazione artificiale, ma può essere utilizzato per l'estrazione di DNA in un secondo momento quando conservato a-80 ° C. Il PBS può essere a temperatura ambiente o refrigerati, ma dovrebbe essere in uno stato liquido quando viene depositato il campione di sperma.<ol>
<li>Confermare la presenza di spermatozoi nel campione visualizzando una piccola quantità del campione diluito sotto un microscopio composto (Figura 3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Conservare lo sperma diluito a-80 ° C fino all'estrazione.</li>
</ol>2. estrazione di DNA da sperma di uccello
Nota: Questo protocollo è stato testato con più kit commerciali di estrazione del DNA, ma ha solo avuto successo quando viene utilizzato con un DNA kit12. Passaggi che vengono modificati dal protocollo kit sono indicati da *.
<ol><li>Preparare una soluzione 1 M di ditiotreitolo (DTT) in acqua e mescolare usando un vortex.*<ol>
<li>Aliquota della soluzione DTT e conservare a-20 ° C fino a immediatamente prima dell'uso. Ogni campione deve essere estratto richiede 10 µ l di soluzione di 1m DTT</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare un tampone contenente 20 mM Tris-Cl, pH 8.0; 20 mM EDTA; 200 mM NaCL; e 4% SDS. Ogni campione deve essere estratto richiede 90 µ l di questa buffer.*<ol>
<li>Conservare il tampone a temperatura ambiente. Se è precipitato, riscaldarlo a 56 ° C per dissolve.*</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preriscaldare un incubatore contenente un rocker o agitatore a 65 ° c. *</li>
	<li>Immediatamente prima di iniziare l'estrazione, mescolare 10 µ l di soluzione DTT con 90 µ l di tampone preparata al punto 2.2 per ciascun campione da estrarre, ad esempio 900 µ l di tampone più 100 µ l di soluzione DTT se l'estrazione di 10 campioni. Questa miscela si chiamerà DTT-buffer.*</li>
	<li>Aggiungere 70 µ l 1X PBS per il campione di sperma diluito intero e mescolare bene con un vortex.*</li>
	<li>Aggiungere 100 µ l DTT-buffer e 10 µ l di soluzione di proteinasi K al campione. Vortice per 20 secondi, quindi Incubare in incubatrice preriscaldato per 1 ora su un bilanciere o shaker.*</li>
	<li>Aggiungere 200 µ l tampone AL e 200 µ l fresco EtOH (100%) e vortex per 20 seconds.*</li>
	<li>Trasferire l'intero campione a una colonna di spin e centrifugare a 1 minuto a 6.000 x g. gettare la provetta di raccolta.</li>
	<li>Posizionare la colonna su un tubo nuovo e aggiungere 500 µ l preparati buffer AW1. Centrifugare 1 minuto a 6.000 x g. gettare la provetta di raccolta.</li>
	<li>Posizionare la colonna su un tubo nuovo e aggiungere 500 µ l preparati buffer AW2. Centrifugare per 1 minuto a 6.000 g. x eliminare il flusso continuo e posto la colonna posteriore sul tubo.</li>
	<li>Centrifugare per 3 minuti a 20.000 x g. gettare il tubo di raccolta e posizionare la colonna in una microcentrifuga da 1,5 mL.</li>
	<li>Dispensare 35 µ l di AE buffer direttamente sulla membrana di colonna e incubare a temperatura ambiente per 5 minuti. *</li>
	<li>Centrifugare 1 minuto a 14.000 x g. gettare la colonna di spin e conservare i campioni estratti a-80 ° C.</li>
</ol>

<ol><li>Briskie, J. V., Montgomerie, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1349186">Sperm size and sperm competition in birds.</a> Proc. R. Soc. B. 247, 89-95 (1992).</li>
<li>Monaghan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeres+and+life+histories%3A+the+long+and+the+short+of+it%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Telomeres and life histories: the long and the short of it.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1206, 130-142 (2010).</li>
<li>Carrell, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics+of+the+male+gamete%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Epigenetics of the male gamete.</a> Fertility and Sterility. 97 (2), 267-274 (2012).</li>
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<li>Criscuolo, F., et al. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1600-048X.2008.04623.x/abstract">Real-time quantitative PCR assay for measurement of avian telomeres.</a> J. Avian Biol. 40, 342-347 (2009).</li>
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<li>Lüpold, S., Calhim, S., Immler, S., Birkhead, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+morphology+and+sperm+velocity+in+passerine+birds%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+R.+Soc.+B%22%5BJournal%5D)">Sperm morphology and sperm velocity in passerine birds.</a> Proc. R. Soc. B. 276, 1175-1181 (2009).</li>
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<li>Stelzer, G., Crosta, L., Bürkle, M., Krautwalt-Junghanns, M. E. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/232663050_Attempted_Semen_Collection_Using_the_Massage_Technique_and_Semen_Analysis_in_Various_Psittacine_Species">Attempted semen collection using the massage technique and semen analysis in various psittacine species.</a> J. Avian Med. Surg. 19 (1), 7-13 (2005).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Descriviamo un metodo semplice e affidabile per la raccolta dello sperma da uccelli di piccoli e medi in stato riproduttivo attivo ed estrazione di DNA da sperma aviaria.
Il protocollo di estrazione del DNA dello sperma descritto viene modificato da un kit per semplicità, ma è stato perfezionato per l'uso su sperma aviaria. Gli spermatozoi sono resistenti alla lisi di estrazione standard prodotti chimici9,13, e campioni di sperma racco...

Gli uccelli sono soggetti ideali per studi su qualità dello sperma e concorso1, sperma del telomero dinamica2, epigenetica3e argomenti simili, come essi sono ampiamente utilizzati nella ricerca biologica e dello sperma può essere facilmente campionato utilizzando cloacal massaggi. Cloacal massaggio è una tecnica manuale dolce, non invasiva per la raccolta dello sperma da uccelli4,5,6. Campioni ripetuti possono essere ottenuti facilmente e attrezzi speciali non sono necessari, che lo rende semplice da eseguire nel campo o nel laboratorio. Anche se cloacal massaggi sono stato in uso per decenni, è difficile da imparare dalla scritta descrizioni disponibili. Questa pubblicazione è intesa a ridurre il tempo e l'incertezza coinvolti nell'apprendimento massaggi cloacal.
Lo sperma raccolto da uccelli utilizzando cloacal massaggio può essere utilizzato immediatamente per motilità valutazione4,7 o8di inseminazione artificiale, o congelato per altri usi come imaging avanzato e l'estrazione del DNA. Campioni di liquido seminale da uccelli passeriformi sono piccoli ma contengono sperma densamente imballato. Il DNA è estratto usando un kit di estrazione commerciale per semplicità, con modifiche per superare le caratteristiche protettive specializzate di sperma9. Dopo l'estrazione, i telomeri dello sperma possono essere misurati usando qPCR10.

<table><tbody><tr><td>Provette capillari per microematocrito</td><td>Fisherbrand</td><td>22-362566</td><td>È possibile utilizzare qualsiasi fornitore. Provette più piccole possono essere più efficaci per la raccolta di piccoli campioni di sperma, ad esempio da uccelli passeriformi molto piccoli come il passero scheggiatore.</td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga</td><td>Qualsiasi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Qualsiasi</td><td></td><td>Utilizzato per conservare i campioni di sperma prima dell'estrazione del DNA.</td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10708976001</td><td>Qualsiasi fornitore può essere utilizzato.</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1233508</td><td>È possibile utilizzare qualsiasi fornitore.</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>793566</td><td>È possibile utilizzare qualsiasi fornitore.</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1614363</td><td>È possibile utilizzare qualsiasi fornitore.</td></tr><tr><td>Kit micro QIAamp DNA</td><td>Qiagen</td><td>56304</td><td>Il kit micro Qiagen QIAamp DNA è consigliato in modo specifico. Questo protocollo di estrazione del DNA è stato tentato con altri kit commerciali, ma con scarso successo. Le ragioni di ciò ci sono sconosciute.</td></tr></tbody></table>

raccolta dello sperma aviaria cloacal massaggi e isolamento di dna da sperma

Avian Semen Collection by Cloacal Massage and Isolation of DNA from Sperm

Raccolta di sperma può essere utile per una vasta gamma di applicazioni, tra cui studi su qualità dello sperma, sperma del telomero dinamiche e l'epigenetica. Gli uccelli sono soggetti ampiamente usati nella ricerca biologica e sono ideali per studi condotti su campioni di sperma ripetuti. Tuttavia, poche risorse sono disponibili per coloro che desiderano imparare a raccogliere ed estrarre DNA da sperma aviaria. Qui descriviamo cloacal massaggio, una tecnica manuale dolce, non invasiva per la raccolta dello sperma aviaria. Anche se questa tecnica è stabilita nella letteratura, può essere difficile da imparare dalle descrizioni disponibili. Forniamo anche informazioni per l'estrazione del DNA da aviaria sperma usando un kit di estrazione commerciale con modifiche. Massaggi cloacal possono essere facilmente utilizzato su qualsiasi uccello maschio medio-piccole in condizione riproduttiva. Dopo il prelievo, lo sperma può essere utilizzato immediatamente per saggi di motilità, o bloccato per l'estrazione del DNA seguendo il protocollo descritto nel presente documento. Questo protocollo di estrazione è stato perfezionato per aviaria sperma ed è stato utilizzato con successo su campioni raccolti da diverse specie di passeriformi (Passer domesticus, Spizella passerina, Haemorhous mexicanuse Turdus migratorius ) e un columbid (Columba livia).

Cloacal massaggi e DNA estrazione utilizzando che il protocollo descritto è stato eseguito su diverse specie di passeriformi e uno columbid (tabella 1). Visualizzando una piccola quantità di campioni diluiti sotto un microscopio composto a 400 ingrandimenti (Figura 3) è stata confermata la presenza di spermatozoi nel seme campioni raccolti da massaggio cloacal. Dopo l'estrazione del DNA dai campioni di sperma raccolto da passeri della camera ...

Questo protocollo descrive cloacal massaggio, tecnica manuale non invasiva per la raccolta di sperma da uccelli ed estrazione di DNA da aviaria dello sperma usando un kit di estrazione commerciale con modifiche.

Raccolta dello sperma aviaria Cloacal massaggi e isolamento di DNA da sperma

Collection of semen may be useful for a wide range of applications including studies involving sperm quality, sperm telomere dynamics, and epigenetics. ...

L'obiettivo generale di questa procedura è raccogliere il liquido seminale da uccelli maschi e isolare il DNA dai campioni di sperma. Questo metodo può essere utilizzato per rispondere a domande fondamentali in ecologia comportamentale ed evolutiva relative alla competizione spermatica e all'eredità epigenetica. Il principale vantaggio di questa tecnica è la sua facilità d'uso.La massaggio cloacale può essere eseguito rapidamente in campo o in laboratorio, e il metodo di estrazione del DNA utilizza un kit disponibile in commercio con alcune modifiche. Questa tecnica può essere applicata su uccelli selvatici o in cattività durante la stagione riproduttiva, e in determinate condizioni di cattività può risultare efficace tutto l'anno. Afferrare il maschio in attività riproduttiva con una presa da inanellatore nella mano non dominante.Quindi trasferirla alla mano dominante con il lato ventrale a contatto con il palmo e con la testa posizionata sul margine laterale del palmo. A questo punto, fissare delicatamente la testa e il corpo utilizzando il mignolo, l'anulare e il medio. Ora il ventre e la coda dell'uccello sono esposti.Le zampe possono essere lasciate libere o leggermente trattenute utilizzando il palmo della mano. Successivamente, evertire la cloaca posizionando l'indice e il pollice della mano dominante su entrambi i lati dell'estremità superiore e pizzicando leggermente, esercitando al contempo una pressione delicata verso la coda. La mucosa cloacale di colore rosa dovrebbe apparire chiaramente, a meno che l'uccello non stia producendo sperma.Con l'esperienza, è facile distinguere tra le cloache di maschi riproduttivamente attivi e inattivi. Per raccogliere il liquido seminale, posizionare la punta dell'indice della mano non dominante sulla parte dorsale alla base della coda per stabilizzarla, quindi posizionare l'estremità del pollice appena sotto la cloaca evertita. Si raccomanda vivamente un'unghia corta e liscia.Ora spostare ripetutamente il pollice in profondità e in direzione craniale con pressione media, mantenendosi al di sotto della cloaca fino a quando l'uccello non ejacula. Questo può richiedere da una sola a diverse dozzine di movimenti. Non appena l'uccello ejacula, raccogliere il liquido seminale vischioso di colore marrone chiaro in un tubo per microematocrito.Le sostanze bianche o scure sono contaminanti, mentre qualsiasi quantità di sangue indica che è stata applicata troppa pressione. Se necessario, ripetere il massaggio per ottenere più eiaculati. Per l'estrazione del DNA, trasferire il campione in una provetta da microcentrifuga con 20 microlitri di PBS.Per confermare la presenza di spermatozoi nel campione, osservare una piccola quantità del campione diluito al microscopio composto con un ingrandimento di 400X. Successivamente, conservare i campioni di sperma a -80 gradi Celsius fino al momento dell'utilizzo. Questo protocollo è una modifica di un kit commerciale.Preparare aliquote da 10 microlitri di DTT uno molare in acqua, conservate a meno 20 gradi Celsius. Poco prima di iniziare l'estrazione del DNA, mescolare un'aliquote di DTT con un'aliquote di cloruro di tris per ogni campione. Successivamente aggiungere 70 microlitri di PBS a ciascun campione e vortexare le miscele.Quindi aggiungere a ciascun campione una miscela di tampone DTT e 10 microlitri di soluzione di proteinasi K. Per mescolare i campioni, vortexare per 20 secondi. Ora posizionare i campioni in un incubatore a 65 gradi Celsius su un agitatore e incubare i campioni per un'ora con agitazione delicata.Dopo l'incubazione, aggiungere 200 microlitri di tampone AL e 200 microlitri di etanolo fresco al 100%, quindi vortexare i campioni per 20 secondi. Successivamente, trasferire ciascun campione in una colonna da centrifuga e centrifugare per un minuto a 6.000 × g. Scartare il tubo di raccolta e posizionare le colonne su nuovi tubi.Aggiungere 500 microlitri di tampone AW1 sulla colonna e centrifugare nuovamente le colonne. Scartare nuovamente il tubo di raccolta e posizionare le colonne su nuovi tubi. Aggiungere ora 500 microlitri di tampone AW2 e ripetere il ciclo di centrifugazione.Successivamente, eliminare il flusso passante e riposizionare la colonna da centrifuga nella centrifuga per tre minuti di centrifugazione, ora a 20.000 ×g. Quindi eliminare il tubo di raccolta e posizionare la colonna su un tubo da microcentrifuga. Aggiungere direttamente sulla membrana della colonna 35 microlitri di tampone AE e lasciare che la soluzione eluisca il DNA per cinque minuti a temperatura ambiente.Quindi trasferire il tampone di eluizione contenente il DNA nel tubo da microcentrifuga mediante una centrifugazione di 60 secondi. A questo punto scartare le colonnine e conservare il DNA a meno 80 gradi Celsius. I metodi descritti di massaggio cloacale ed estrazione del DNA sono stati utilizzati con successo su diverse specie di passeriformi e su un esemplare di Columbide.Quando un'elettroforesi su gel del DNA estratto presenta bande distinte e prive di sbavature, ciò indica un isolamento di DNA di alta qualità. Questo esempio riguarda il DNA ottenuto dal seme del passero domestico. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione della tecnica per raccogliere delicatamente campioni di sperma da uccelli maschi riproduttivi mediante massaggio cloacale e del metodo per estrarre il DNA da tali campioni di sperma utilizzando un kit di estrazione.Una volta padroneggiata, la massoterapia cloacale può essere eseguita in pochi secondi se effettuata correttamente.

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Questa procedura mira a identificare i metaboliti trasferiti dagli spermatozoi agli ovociti durante la fecondazione utilizzando la marcatura degli isotopi stabili con 2H2O o U13C Glucosio seguita da analisi metabolomica. I tori marcati con deuterio sono accoppiati con madri non marcate. Gli embrioni pre-impianto raccolti vengono analizzati mediante spettrometria di massa per separare i metaboliti paterni (deuterati) da quelli materni (non deuterati).

Marcatura in vivo di isotopi stabili per l'identificazione con spettrometria di massa dei metaboliti paterni trasferiti dallo spermatozoo all'ovocita durante la fecondazione

Questo protocollo presenta una semplice tecnica di microaspirazione per isolare cellule somatiche (SC) vitali dal seme equino criopriservato. A differenza degli approcci tradizionali, questa tecnica evita lunghe colture in vitro e supera la contaminazione da spermatozoi, consentendo un uso immediato nella clonazione delle cellule somatiche.

Una semplice tecnica di microaspirazione per isolare cellule somatiche da sperma equino criopreservato come donatori nucleari per la clonazione

Impara la raccolta dello sperma aviario tramite massaggio cloacale e l'estrazione di DNA di alta qualità con kit commerciali modificati. Questo metodo non invasivo è ideale per studi di ecologia evolutiva ed epigenetica.

Raccolta dello sperma aviaria Cloacal massaggi e isolamento di DNA da sperma

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