Name: Un saggio di HS-MRM per la quantificazione delle proteine di cellula ospite in biofarmaceutica di proteine mediante spettrometria di massa di liquido cromatografia dello ione mobilità QTOF (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Scopri il saggio HS-MRM per la quantificazione delle proteine di cellula ospite nelle biofarmaceutiche mediante spettrometria di massa QTOF con separazione per mobilità ionica. Questo metodo migliora la sensibilità e la selettività analitica.

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Gli autori vorrei ringraziare Lesley Malouin e Tony Catlin da Waters Corporation per la preparazione di figura 6 del manoscritto.

1. preparazione del digest infliximab (procedura di ~ 24 h)
<ol><li>Preparare soluzioni fresche di bicarbonato d'ammonio di 50 mM, 1% tensioattivo anionico 50mm NH4HCO3, 500 mM dithiothreitol (DTT) in 50 mM NH4HCO3e 500mm iodoacetamide (IAM) 50mm NH4HCO3.</li>
	<li>A 750 µ l di 50mm NH4HCO3, aggiungere 200 µ l di infliximab mAb (10 mg/mL) e 50 µ l di soluzione 1% tensioattivo anionico e denaturare la proteina per 15 min a 60 ° C in presenza di tensioattivo anionico 0.05%.</li>
	<li>Aggiungere 40 µ l di 500 mM DTT e ridurre il campione per 60 min a 60 ° C in presenza di 20 mM DTT.</li>
	<li>Aggiungere 20 µ l di 500 mM IAM e alchilata il campione per 30 min a temperatura ambiente al buio in presenza di ~ 10 mM IAM.</li>
	<li>Aggiungere il contenuto del tubo del microcentrifuge per un flaconcino di vetro contenente 20 µ g di sequenziamento-grade MS Lys C/tripsina e digerire il campione per 3 h a 37 ° C.</li>
	<li>Aggiungere un secondo enzima aliquota (20 µ g) trasferendo il campione digerito a un altro flaconcino di vetro contenente 20 µ g di sequenziamento-grade MS Lys C/tripsina e digerire il campione durante la notte (h 12-15) a 37 ° C.</li>
	<li>Dopo la proteolisi durante la notte, aggiungere 5 µ l di acido formico al 100% (FA) ed incubare il digest per 30 min a 37 ° C per decomporre l'acido labile anionico.</li>
	<li>Rotazione verso il basso il digest per 15 min a 4.000 x g in una centrifuga per precipitare il componente insolubile del tensioattivo anionico.</li>
	<li>Recuperare ~ 1.000 µ l del digest infliximab e posizionarlo in un flaconcino di autocampionatore LC; la concentrazione del digest dovrebbe essere ~ 2 mg/mL. Memorizzare il digest in un congelatore a-20 ° C fino a quando il sistema LC/MS è pronto per l'analisi.</li>
</ol>2. chiodare degli standard del peptide (~ 30 min)
<ol><li>Scongelare il digest di infliximab posizionando il campione congelato in flaconcino di vetro su una panchina a temperatura ambiente.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di 0,1% FA in flaconcino del digest di H2O a un coniglio fosforilasi b (PHO) per preparare da 1 µM soluzioni di riserva per tutti e sei gli standard di peptide dal PHO contenuta nel flaconcino (il flaconcino contiene 1 nmol di ciascun peptide).</li>
	<li>Preparare diluizioni 4 x 1 mL della soluzione madre PHO per ottenere soluzioni contenenti 0,1, 1, 10 e 100 nM peptidi, utilizzando 0,1% FA come il solvente di diluizione. Preparare tutte le diluizioni in flaconcini di vetro (LC auto-campionatore flaconcini) e aggiungere 100 µ l di infliximab digest come la matrice di sfondo a tutte le fiale. Carico 2 µ g di digest sfondo su colonna con ogni iniezione di 10-µ l. Preparare un campione in bianco che contiene il digest di infliximab diluito (la stessa 01:10 diluizione), con nessun peptidi a spillo.</li>
</ol>3. configurazione del metodo di acquisizione dei dati di LC/HDMS E
Nota: Il flusso di lavoro che riassume i passaggi necessari per impostare un'acquisizione di HS-MRM è raffigurato nella figura 1 e descritto in dettaglio nelle sezioni 3-6. Per stabilire il tempo di ritenzione di ciascun peptide monitorati, il padre m/z dello ione più abbondante del peptide seguendo ionizzazione electrospray, è necessaria l'acquisizione di un dataset HDMSE dati-indipendente e il corrispondente CCS (Croce collisionale sezione) derivate dalla separazione di mobilità dello ione. Inoltre, il set di dati di dati-indipendente fornisce informazioni per quanto riguarda il m/z degli ioni frammento più abbondanti tre per ogni precursore del peptide. Nel secondo passaggio del flusso di lavoro (ottimizzazione CE), la sensibilità del dosaggio è aumentata ottimizzando l'energia di cella di collisione per ottenere la massima intensità di ioni per ciascuno ione frammento. Infine, nella fase finale, tutti i parametri descritti sopra sono introdotte per l'editor del metodo di HS-MRM per ciascun peptide monitorati.
<ol><li>LC/MS esperimenti su un tempo di volo (QTOF) spettrometro di massa quadrupole accoppiato ad un sistema di cromatografia liquida ultra-prestazioni utilizzando un metodo di acquisizione dati indipendente (HDMSE). Nota: Maggiori dettagli per quanto riguarda la configurazione dello strumento sono inclusi nella sezione materiale. Questo strumento utilizza un dispositivo di mobilità dello ione wave itinerante per la separazione dei peptidi precursori10.</li>
	<li>Preparare due fasi mobili contenenti 0,1% FA in acqua (solvente A) e 0,1% FA in acetonitrile (solvente B). Nota: Utilizzare una colonna C18 carica superficiale ibrido (CSH) (2.1 x 150 mm., pranzo con particelle 1.7-µm) per la separazione del digerisce mAb a spillo.</li>
	<li>Nel software di acquisizione dati, fare clic su "Crea/Analysis Method" e scegliere "Generare un'acquisizione e l'elaborazione del metodo". Digitare il nome del metodo, individuare la cartella (directory) di metodo e fare clic su "Avanti".</li>
	<li>Per "Tipo di analisi," scegliere "Peptide mappa (IMS)" e nella scheda "Sistema", selezionare lo strumento "Quaternario Solvent Manager". Modificare le impostazioni di sfumature per realizzare la separazione del peptide ad una portata di 200 µ l/min. uso un'eluizione di pendenza da 1 a 40% solvente B in 30min seguita da un lavaggio di colonna 2 min e un'equilibrazione 9-min, con un tempo di esecuzione totale di 50 min. introdurre questi sperimentale parametri dell'editor del metodo di LC.</li>
	<li>Nella scheda "Sistema", selezionare lo strumento "gestore del campione". Impostare la temperatura del campione a 10 ° C e la temperatura della colonna a 60 ° C.</li>
	<li>Azionare lo spettrometro di massa QTOF in ioni positivi modalità di sensibilità di ESI, con un potere di risoluzione tipico di 30.000 FWHM. Nota: LC/HDMSE è una modalità di acquisizione dati indipendente (DIA) che opera raccogliendo rapidamente scansioni con alternanza di energie di collisione (nella cella di collisione) tra un basso consumo energetico (6 V per scansioni di canale 1 MS) e un'elevata energia (rampa di 15 - 40 V a produrre gli spettri di frammentazione senza selezione precursore in MS canale 2).<ol>
<li>Immettere i parametri predefiniti relativi origine MS del software di acquisizione dati: dal "Mio lavoro/strumento sistema," selezionare la scheda "Vion IMS Qtof" e nel menu "Strumenti", immettere questi parametri: 3,0 kV di tensione capillare, 100 ° C temperatura della fonte, fonte di 100 V offset, 50 L/h cono flusso di gas e tensione di cono 40 V. Impostare la temperatura di desolvatazione a 250 ° C, la portata del gas di desolvatazione a 500 L/h e la tensione di riferimento capillare a 3.0 kV.</li>
		<li>Nel software di acquisizione dati, fare clic su "Crea/Analysis Method" e scegliere "Generare un'acquisizione e l'elaborazione del metodo". Digitare il nome del metodo e individuare la cartella (directory) di metodo e quindi fare clic su "Avanti".</li>
		<li>Per "Tipo di analisi," scegliere "Peptide mappa (IMS)" e nella scheda "Sistema", selezionare lo strumento "Vion IMS QTof". Fare clic su "Fine". Nota: Il metodo LC/HDMSE appena creato si apre automaticamente nella schermata "Configurazione di metodo dello strumento".</li>
		<li>Nella scheda "Impostazioni", immettere questi parametri: 3,0 kV tensione capillare, 100 ° C temperatura della sorgente, 250 ° C di temperatura di desolvatazione, flusso di gas cono 50 L/h e flusso di gas di desolvatazione di 500 L/h.</li>
		<li>Nelle impostazioni della scheda di "Esperimento", selezionare "MSEad alta definizione" e scegliere "Analisi metodo runtime." Nella scheda "Impostazioni di scansione", inserire questi parametri: bassa massa, 100; messa solenne, 2.000; e tempo di scansione, 400 ms. nella scheda "CE", tipo "6 V" per l'impostazione di basso consumo energetico e scegliere una rampa ad alta energia da 15 a 40 V. Assicurarsi di avere "Disattiva dati riduzione" controllato.</li>
		<li>Infondere una soluzione di encefalina di leucina 50 ng/mL (LE) preparato in 50% acetonitrile con 0,1% FA ad una portata di 10 µ l/min per serratura-massa calibrazione durante l'acquisizione. Nota: Il blocco-massa viene acquisito ogni 5 min utilizzando lo stesso tasso di acquisizione sopra lo stesso intervallo di massa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analizzare il campione 10-nM, PHO-spillo usando l'analisi LC/HDMSE descritto sopra da iniettare 10 µ l di campione (l'importo caricato sulla colonna è fmol 100 per ciascun peptide standard).</li>
</ol>4. installazione del metodo Tof-MRM per ottimizzazione energetica (CE) di collisione
<ol><li>Dal set di dati LC/HDMSE ottenere il tempo di ritenzione, il precursore e il frammento dello ione m/z per ogni peptide PHO. Mantenere il m/z e lo stato di carica per i più abbondanti ioni del frammento dello ione precursore e i tre corrispondenti più abbondanti. Nota: Un esempio di spettri di basso consumo energetico e ad alta energia in genere registrati dall'analisi LC/HDMSE è presentato nella figura 2.</li>
	<li>Utilizzare ottimizzazione energetica (CE) collisione in un esperimento SRM/MRM per ottenere il miglior segnale per ogni peptide23.<ol>
<li>Nel software di acquisizione dati, fare clic su "Crea/Analysis Method" e scegliere "Generare un'acquisizione e l'elaborazione del metodo". Digitare il nome del metodo, individuare la cartella (directory) di metodo e fare clic su "Avanti".</li>
		<li>Per "Tipo di analisi," scegliere "Quantificare". Scegli "Quantificare Assay 2D Tof cromatografica" e fare clic su "Avanti". Nella scheda "Sistema", selezionare "Vion IMS QTof" e fare clic su "Finish". Nota: Il metodo Tof-MRM appena creato si apre automaticamente nella schermata "Configurazione di metodo dello strumento".</li>
		<li>Nella scheda "Impostazioni", immettere questi parametri: 3,0 kV tensione capillare, 100 ° C temperatura della sorgente, 250 ° C di temperatura di desolvatazione, flusso di gas cono 50 L/h e flusso di gas di desolvatazione di 500 L/h.</li>
		<li>Nelle impostazioni della scheda di "Esperimento", selezionare "Funzione tabella" e scegliere "uno o più MS, MSMS o MRM funzioni." Utilizzando le frecce verso il basso, impostare una funzione di "Tof-MRM" per ogni peptide inserendo tre "transizioni" (combinazioni di tre dei suoi più abbondanti ioni frammento e il precursore più abbondante). Nota: In modalità Tof-MRM, la maggiore sensibilità si ottiene utilizzando un approccio di gestione record di messaggistica pianificato.</li>
		<li>Nell'editor "Tof-MRM" funzione, scegliere un intervallo di tempo di ritenzione per ciascun peptide (lunga almeno 1 min), disposte secondo l'ordine di eluizione del peptide. Nell'editor di funzione "Tof-gestione record di messaggistica", inserire il peptide precursore m/z e il prodotto m/z; Selezionare la finestra isolamento quad come "Basso" (4-Da finestra) per il precursore del peptide; Selezionare un tempo di scansione fissa di 100 ms; e scegliere dodici valori di energia di collisione differenti nella gamma di 14-36 V, come segue: 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 e 36, come illustrato nell'esempio nella figura 3. Nota: Con il metodo di Tof-MRM sopra descritto, dati almeno 10 punti per picco cromatografico vengono raccolti per ogni transizione presso ogni CE specificato. Per ridurre la dimensione del file di dati, selezionare l'opzione "Wide" (6-Da finestra) per il segnale dello ione frammento. Esempi di valori CE-ottimizzato sono riportati nella tabella 2.</li>
		<li>Analizzare il campione 10-nM, PHO-spillo usando l'analisi Tof-MRM sopra descritto da iniettare 10 µ l di campione (l'importo caricato sulla colonna è fmol 100 per ciascun peptide standard).</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. installazione dell'ultimo metodo di acquisizione di HS-MRM per quantificazione peptide mediante separazione di mobilità dello ione dei precursori del peptide
<ol><li>Nel menu "Indagare" dei software di acquisizione dati, visualizzare tutte le 11 tracce cromatografiche generate per ogni CE per ogni peptide e integrare le cime utilizzando il pulsante di "Integrare" dalla barra degli strumenti "elaborazione opzioni/operazioni"; l'area del picco più alto indicherà la migliore CE per ogni transizione.</li>
	<li>Visivamente confrontare le migliori aree di picco per i 3 frammenti di ciascun peptide e mantenere solo il meglio di "transizione" (lo ione di frammento che produce il segnale più intenso); La tabella 2 Mostra il meglio "transizioni" ottenuti da quattro peptidi PHO.</li>
	<li>Un metodo di HS-MRM contenente un solo agli ioni frammento al peptide di Setup. Utilizzare i valori di CCS di ogni precursore del peptide da LC/HDMSE dataset.<ol>
<li>Modificare il metodo di Tof-MRM creato nella sezione precedente (sezione 4) selezionando la funzione "HS-MRM" anziché la funzione di "Tof-MRM".</li>
		<li>Nell'editor di funzione "HS-gestione record di messaggistica", inserire i seguenti parametri relativi precursore: m/z, quadrupolo risoluzione: bassa (4 bis), carica dello stato, valore di CCS precursore e precursore CCS risoluzione: basso. Per lo ione prodotto, entrare in sua m/z, l'energia di collisione ottimale, scegliere un tempo di scansione di 0,4 s e selezionare un'impostazione di "Ampio" spettro (6 bis) per includere tutti i suoi isotopi. Un esempio del metodo di acquisizione HS-MRM finale per tutti i quattro peptidi è presentato nella figura 4.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analizzare tutti i campioni utilizzando il metodo di HS-MRM, iniziando con il digest di mAb vuoto (non a spillo campione), seguiti da 4 iniezioni ripetute (10 µ l) delle seguenti concentrazioni: 0,1, 1, 10 e 100 nM PHO peptidi.</li>
</ol>6. creazione di un metodo di elaborazione per l'analisi del dataset HS-MRM
<ol><li>Creare un metodo di elaborazione per l'analisi del dataset HS-MRM.<ol>
<li>Nel metodo di analisi creato per il metodo di acquisizione dati "HS-gestione record di messaggistica", fare clic sulla scheda "Scopo" e scegli "Gestisci componenti."</li>
		<li>Dal menu a discesa sotto "Tipo di esperimento", selezionare l'opzione "HS MS/MS/HS-MRM".</li>
		<li>Fare clic su "Crea/New Entry" e introdurre i seguenti parametri nell'editor del metodo di lavorazione: tempo di ritenzione del peptide (RT), stato di carica del precursore, precursore m/z e tempo di deriva del precursore (DT). Per lo ione di frammento, immettere lo stato di carica e m/z e specificare la traccia "XIC" come modalità di estrazione.</li>
		<li>Nella scheda "Scopo" dello stesso metodo di acquisizione "HS-gestione record di messaggistica", clicca su "Default importi" e Inserisci le seguenti concentrazioni: 0,1, 1, 10 e 100 nM PHO peptidi.</li>
		<li>Inserire i seguenti parametri nella sezione "impostazioni di elaborazione/estrazione": tolleranza di massa di default, 10 ppm (per il m/z di tutti gli ioni frammento) e predefinito deriva tempo, 5%; nella figura 5 è riportato un esempio del metodo di elaborazione del peptide PHO.</li>
		<li>Per il tipo di calibrazione, scegliere il raccordo curva lineare con 1 / X2 ponderazione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Elaborare i dati di HS-MRM per integrare tutti i cromatogrammi e costruire le curve di calibrazione di ciascun peptide PHO.</li>
</ol>

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</ol>

Tutti gli autori sono dipendenti di acque Corporation, che è il produttore di diversi reagenti e strumenti utilizzati in questo articolo.

Ad alta risoluzione (Rs > 20.000) spettrometria di massa è usata ordinariamente per la caratterizzazione strutturale di proteine terapeutiche su una varietà di piattaforme di strumento. Al contrario, quantificazione della proteina basate su MS viene in genere eseguita da SRM/MRM su a bassa risoluzione (Rs ~ 1.000) tandem quadrupolo spettrometri di massa utilizzando peptidi firma generate tramite la fenditura enzimatica di proteine11,12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23. come singolo-dimensione separazioni cromatografiche non possono risolvere completamente miscele complesso peptide prodotte da digestione enzimatica, co-eluizione del peptide è un avvenimento comune, anche nel caso di un digest di singolo-proteina. Per raccolte del proteina molto complessi (ad es., per la quantificazione di 1-100 ppm di HCPs in presenza di un peptide ricco sfondo prodotta dalla proteina terapeutica), la sensibilità, precisione o linearità di SRM/MRM dosaggio può essere influenzata da interferenze.
I dosaggi SRM/MRM hanno selettività unidimensionale, basandosi solo su una combinazione di "unica" delle masse di precursore/frammento. Per questo motivo, queste analisi non riuscire in situazioni quando lo sfondo di peptide cambia in modo imprevisto (ad es., per la biofarmaceutica campioni ottenuti da procedure di purificazione diversi). Per superare queste limitazioni, vi proponiamo qui un saggio di ad alta selettività (HS) gestione record di messaggistica implementato su un ione abilitati alla mobilità ad alta risoluzione tempo di volo (QTOF) ibrido spettrometro di massa quadrupole (per il diagramma di strumento, vedi figura 6).
Lo strumento separa i precursori del peptide di interesse da altri precursori (interferenza) Co-eluizione di peptide nella cella di mobilità dello ione, consente di isolare la busta piena isotopica del precursore nel quadrupole e frammenti di esso con un fisso CE nella cella di collisione. Il segnale prodotto dal suo frammento del peptide più abbondante è ulteriormente rafforzato regolando la frequenza di pusher (Target Enhancement), che spinge in modo selettivo massa regioni di interesse nel tubo di volo, piuttosto che tutti gli ioni, come con una scansione completa. Quantificazione del peptide viene eseguita utilizzando i segnali di alta-MS-risoluzione (Rs ~ 30.000) prodotti da questo ione di frammento. Confronto con i dosaggi SRM/MRM, il dosaggio di HS-MRM offre due ulteriori livelli di selettività: uno è fornito tramite la separazione di mobilità dello ione precursore-livello, mentre il secondo è offerto dalla risoluzione di massa aumentata dell'analizzatore TOF. I risultati portati da questi miglioramenti di selettività sono visibili nei cromatogrammi di HS-MRM visualizzati nella figura 7, che sono privi di interferenze attraverso tre ordini di grandezza.
A differenza di analisi della SRM/MRM, ci sono diversi parametri che possono essere regolati per ottimizzare i dosaggi di HS-MRM: finestra RT intorno il precursore del peptide (in genere impostata a 0,2 min), la finestra di isolamento di quadrupolo (4 bis), la finestra di tempo di deriva che circonda il precursore (± FWHM del picco precursore dal corrispondente mobilogram di ioni) e la risoluzione di MS dello ione frammento (20.000-40.000). I dosaggi di HS-MRM sono molto sensibili: l'importo più basso rilevato per ogni peptidi PHO è 1 femtomole su colonna (o 0,1 nM in termini di concentrazione nel peptide). Quando si considera il peptide MW (Vedi tabella 1 per MWs accurata), l'importo rilevato in colonna è nell'ordine di 1-2 pg, mentre la colonna viene caricata con una quantità significativamente maggiore (2 µ g) di peptidi di sfondo dal digest di mAb.
Considerando il peso molecolare della proteina PHO Full-Length (97,2 kDa) da cui sono stati derivati i peptidi a spillo, il dosaggio è in grado di rilevare 50 ppm di un'impurità di proteine in presenza di ioni di alta-abbondanza sfondo. Limiti inferiori di rilevazione (5-10 ppm) sono realizzabili per peso molecolare inferiore HCPs (10-20 kDa). Il test comprende tre ordini di grandezza (come mostrato in curve di taratura da figura 8), che significa che può misurare HCPs nell'intervallo 1-1.000 ppm. Inoltre, la riproducibilità delle analisi HS-MRM, illustrato nella tabella 3, corrisponde molto bene con la riproducibilità delle analisi SRM/MRM della piccolo-molecola, con area di picco RSDs meglio 15%.
Abbiamo esplorato le funzionalità di un'analisi novella per la quantificazione degli standard del peptide a spillo in un digest di anticorpo monoclonale (mAb) e dimostrato la sua sensibilità e l'utilità per coprire la gamma dinamica ampia (almeno tre ordini di grandezza) in genere incontrate nell'analisi HCP. Tutti e sei gli standard del peptide sono stati rilevati alle concentrazioni basse quanto 0.1 nM (1 femtomole caricato su una colonna cromatografica di 2,1 mm ID) in presenza di uno sfondo di alta-abbondanza peptide (2 µ g di un digest caricato mAb in colonna). Incorporando sia mirata HRMS e separazione di precursore mobilità dello ione, il saggio di HS-MRM ha grande potenziale per diventare un saggio di monitoraggio veloce, ad alta produttività per più operatori sanitari attraverso più batch di biofarmaci.

Quantificazione di grande biomolecole (proteine) in ambienti industriali è attualmente basata su test immunologici (ad es., Elisa), principalmente a causa di diversi vantaggi: sensibilità, ad alta produttività, facilità d'uso e basso costo per campione. Quando viene applicata per analizzare le impurità di basso-abbondanza di proteine (1-100 ppm di proteine della cellula ospite (HCP)) presenti in terapie proteiche, questi saggi biologici in genere forniscono la concentrazione totale di HCP (solitamente espressa in ppm o ng mAb HCP/mg), ma essi non è possibile identificare e misurare i singoli contaminanti HCP. Diversi saggi basati su MS sono stati recentemente sviluppati per integrare ELISAs o per fornire informazioni che Elisa non riesce a offrire1,2,3,4,5,6 , 7 , 8 , 9. a causa della complessità del campione e l'obbligo di rilevare peptidi HCP attraverso una gamma dinamica ampia concentrazione (almeno 3 ordini di grandezza), i metodi cromatografici multidimensionali frazionamento vasto campione di gara hanno tradizionalmente impiegata per aiutare a identificare il basso-abbondanza HCPs1,2,3,4,5,6,7.
Un naturale passo seguito HCP identificazione e convalida è rilevamento di HCP (monitoraggio) attraverso più batch di biofarmaci. In questo caso, metodi di singolo-dimensione LC/MS sono state proposte per migliorare la velocità effettiva del campione8,9. Tuttavia, la precisione e misurazioni gamma dinamica di HCP possono essere influenzati in un'analisi di LC/MS 1D dalla presenza schiacciante di biofarmaceutica peptidi. Rispetto ad una separazione multidimensionale, il potenziale per segnale interferenza19,20,21,22 è aumentato in una separazione cromatografica di singolo-dimensione perché la probabilità di più precursori del peptide di essere co-eluizione è aumentato. L'incorporazione dei mezzi ortogonali per la separazione dei precursori del peptide senza estendere il tempo di separazione cromatografica sarebbe chiaramente vantaggiosa. Viaggiare onda dello ione mobilità (TWIM)10 ha la capacità di risolvere congestionate MS spettri in millisecondi. Circa 500 separazioni di mobilità possono essere eseguite durante l'eluizione di un singolo peptide, assumendo una larghezza del picco cromatografico pieno di 10 s e considerando che il runtime di una separazione IM dello strumento di mobilità dello ione è 20 ms.
Analisi di spettrometrihe di massa per quantificazione della proteina sono state sviluppate con successo nel corso degli ultimi decennio utilizzando ben accettato selezionato monitoraggio approccio (metodo SRM/MRM) implementato su tandem spettrometri di massa11, della reazione (multipli) 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 ,22,23. Uno dei limiti di questa analisi di spettrometria di massa a bassa risoluzione è interferenza fenomeno19,20,21,22 osservato quando il peptide di interesse è la "stessa" precursore e frammento di massa come gli altri peptidi co-eluizione presentano nel campione (all'interno di una finestra di 1-Da). Ci sono due modi per migliorare la precisione dei metodi SRM/MRM: un'opzione comporta un passaggio supplementare separazione a livello di precursore per rimuovere gli ioni interferenti di precursore, mentre l'altra opzione è quello di aumentare la risoluzione di MS del rilevamento del precursore/frammento di evitare sovrapposizioni MS segnali. La modalità di acquisizione ad alta selettività (HS) MRM descritta qui si avvale di entrambi questi approcci accoppiando la separazione di mobilità dello ione dei precursori del peptide con l'alta risoluzione (Rs ~ 30.000) MS rilevamento di frammenti peptidici. Il test descritto qui copre almeno tre ordini di grandezza, che in genere è la gamma dinamica osservati in SRM/MRM proteomics esperimenti17,18,24.
Monitorando la linearità del segnale prodotto da sei standard del peptide a spillo alle concentrazioni differenti (intervallo 0,1 - 100 nM) in un digest di anticorpo monoclonale è stata dimostrata l'utilità del dosaggio HS-MRM per quantificazione di HCP.

<table><tbody><tr><td>Spettrometro di massa Vion IMS Qtof</td><td>Waters</td><td>186009214</td><td></td></tr><tr><td>Acquity H-Class Quaternary solvent manager (QSM)</td><td>Waters</td><td>186015041</td><td></td></tr><tr><td>Acquity H-Class FTN Sample Manager (SM)</td><td>Waters</td><td>186015040</td><td></td></tr><tr><td>Acquity H-Class Column Manager (CM)</td><td>Waters</td><td>186015043</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile (ACN)</td><td>Fisher Chemical</td><td>A996-4</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di ammonio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>40867-50G-F</td><td></td></tr><tr><td>2,1 x 150 mm CSH C18 colonna UPLC, 1,8 &; </td><td>Acque</td><td>186005298</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitolo (DTT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5545-5G</td><td></td></tr><tr><td>Acido formico, additivo eluente per LC/MS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>56302-10X1ML-F</td><td></td></tr><tr><td>Hi3 fosforilasi di coniglio (PHO) MassPREP standard</td><td>Waters</td><td>186006011</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacetamide (IAM)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I-1149-5G</td><td></td></tr><tr><td>Fiale LC (fiale in vetro 12x32 mm, collo a vite)</td><td>Waters</td><td>186000327c</td><td></td></tr><tr><td>Leucina Enkephalin acetato sale idrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L9133-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Protein LoBind 2.0 mL provette (2x50)</td><td>Eppendorf</td><td>22431102</td><td></td></tr><tr><td>RapiGest SF</td><td>Waters</td><td>186001861</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/Lys-C enzyme mix, grado di spettrometria di massa (5 x 20 &; g)</td><td>Promega</td><td>V5073</td><td></td></tr><tr><td>Acqua, grado LC/MS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>39253-1L-R</td><td></td></tr></tbody></table>

un saggio di hs-mrm per la quantificazione delle proteine di cellula ospite in biofarmaceutica di proteine mediante spettrometria di massa di liquido cromatografia dello ione mobilità qtof

An HS-MRM Assay for the Quantification of Host-cell Proteins in Protein Biopharmaceuticals by Liquid Chromatography Ion Mobility QTOF Mass Spectrometry

L'analisi delle impurità di proteina di basso livello (1-100 ppm) (ad es., proteine di cellula ospite (HCP)) nella proteina biotherapeutics è un test impegnativo che richiedono alta sensibilità e un'ampia gamma dinamica. Saggi di quantificazione basati sulla spettrometria di massa per proteine tipicamente coinvolgono la digestione delle proteine seguita dalla reazione di monitoraggio/multiple della reazione selettiva monitoraggio quantificazione (SRM/MRM) dei peptidi usando un tandem (Rs ~ 1.000) a bassa risoluzione spettrometro di massa Quadrupole. Uno dei limiti di questo approccio è il fenomeno di interferenza osservato quando il peptide di interesse è la "stessa" precursore e la massa di frammento (in termini di valori m/z) come altri peptidi co-eluizione presente nel campione (all'interno di una finestra di 1-Da). Per evitare questo fenomeno, proponiamo un approccio alternativo di spettrometrico di massa, un saggio MRM alta selettività (HS) che combina la separazione di mobilità dello ione dei precursori del peptide con l'alta risoluzione (Rs ~ 30.000) MS rilevamento di frammenti peptidici. Abbiamo esplorato le funzionalità di questo approccio per quantificare gli standard di basso-abbondanza peptide spillo in un digest di anticorpo monoclonale (mAb) e ha dimostrato che ha la sensibilità e la gamma dinamica (almeno 3 ordini di grandezza) tipicamente realizzato in HCP analisi. Tutti e sei gli standard del peptide sono stati rilevati alle concentrazioni basse quanto 0.1 nM (1 femtomole caricato su una colonna cromatografica di 2,1 mm ID) in presenza di uno sfondo di alta-abbondanza peptide (2 µ g di un digest caricato mAb in colonna). Quando si considera il MW della fosforilasi coniglio (97,2 kDa), da cui sono stati derivati i peptidi a spillo, LOQ di questo test è inferiore a 50 ppm. Le deviazioni standard relative (RSD) delle aree dei picchi (n = 4 ripetizioni) erano meno del 15% su tutta la gamma intera concentrazione studiata (0.1-100 nM o 1-1.000 ppm) in questo studio.

Le singole sequenze di sei standard di peptide b fosforilasi contenute nella miscela peptide PHO sono riportate nella tabella 1, insieme a loro tempi di ritenzione e loro precursori più abbondante osservati in HDMSE sperimentare. Il primo passo nello sviluppo di un'analisi di gestione record di messaggistica (HS) ad alta selettività è l'acquisizione di un dataset HDMSE stabilire i tempi di eluizione di ciascun peptide PHO, insieme al suo corrispondente più abbondanti precursore e i tre frammenti più abbondanti. Figura 2 Visualizza gli spettri HDMSE acquisiti per uno dei peptidi PHO (Pep 6) a spillo nel digest di infliximab. Dopo aver stabilito i 3 migliori "transizioni" (combinazioni di precursore e frammento masse) per ciascun peptide, un esperimento di Tof-gestione record di messaggistica viene eseguito per trovare l'energia di collisione ottimale per massimizzare i segnali generati per ogni peptide. I risultati dell'esperimento di ottimizzazione CE sono riassunti nella tabella 2. Il test finale di HS-MRM (Vedi figura 4) conserva solo il meglio di "transizione" per ogni peptide e viene utilizzato per l'analisi di tutti i campioni arricchiti. Esempi di cromatogrammi di HS-MRM generati per 4 PHO peptidi attraverso tutte le concentrazioni studiate sono presentati nella figura 7. Quattro curve di calibrazione ottenuta per ciascuno dei successivi peptide l'integrazione delle vette HS-MRM evidenziata nella figura 7 vengono visualizzati nella figura 8. Inoltre, la picco zona deviazione standard relativa, calcolata sulla base di replicare 4 iniezioni, è riassunto in 4 tabelle riportate nella tabella 3.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Peptide</td>
			<td colspan="2">Peptide</td>
			<td>Conservazione</td>
			<td colspan="4">Stati di carica</td>
		</tr>
<tr>
<td>ID</td>
			<td colspan="2">Sequenza</td>
			<td>tempo (min)</td>
			<td>+ 1</td>
			<td>+ 2</td>
			<td>+ 3</td>
			<td>+ 4</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="2"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Pep 1</td>
			<td colspan="2">VLYPNDNFFEGK</td>
			<td>19,4</td>
			<td>1442.6951</td>
			<td>721.8512</td>
			<td>481.5699</td>
			<td>361.4292</td>
		</tr>
<tr>
<td>PEP 2</td>
			<td colspan="2">TCAYTNHTVLPEALER</td>
			<td>16,0</td>
			<td>1874.9065</td>
			<td>937.9569</td>
			<td>625.6404</td>
			<td>469.4821</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pep 3</td>
			<td colspan="2">IGEEYISDLDQLRK</td>
			<td>18,9</td>
			<td>1678.8646</td>
			<td>839.9360</td>
			<td>560.2931</td>
			<td>420.4716</td>
		</tr>
<tr>
<td>PEP 4</td>
			<td colspan="2">LLSYVDDEAFIR</td>
			<td>21,1</td>
			<td>1440.7369</td>
			<td>720.8721</td>
			<td>480.9172</td>
			<td>360.9397</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pep 5</td>
			<td colspan="2">LITAIGDVVNHDPVVGDR</td>
			<td>19,7</td>
			<td>1890.0080</td>
			<td>945.5076</td>
			<td>630.6742</td>
			<td>473.2574</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pep 6</td>
			<td colspan="2">VFADYEEYVK</td>
			<td>17,7</td>
			<td>1262.5939</td>
			<td>631.8006</td>
			<td>421.5362</td>
			<td>316.4039</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1. Norme di peptide PHO contenute nel mix massa PREP a spillo nel digest di infliximab. Tempi di ritenzione del peptide e dei loro precursori più abbondante (evidenziati in grassetto) sono visualizzati in formato tabulare.
<table fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Peptide</td>
			<td colspan="2">Peptide</td>
			<td>Conservazione</td>
			<td colspan="2">Precursore del peptide</td>
			<td colspan="3">Più abbondanti ioni frammento e della carica</td>
			<td>Ottimale</td>
		</tr>
<tr>
<td>ID</td>
			<td colspan="2">Sequenza</td>
			<td>tempo (min)</td>
			<td>m/z & carica</td>
			<td>Tempo di deriva (ms)</td>
			<td>Ho</td>
			<td>II</td>
			<td>III</td>
			<td>CE (V)</td>
		</tr>
<tr>
<td>PEP 2</td>
			<td colspan="2">TCAYTNHTVLPEALER</td>
			<td>16,0</td>
			<td>625.6404 (+ 3)</td>
			<td>6.2</td>
			<td>714.3781 (+ 1)</td>
			<td>807.4177 (+ 2)</td>
			<td>827.4621 (+ 1)</td>
			<td>24</td>
		</tr>
<tr>
<td>PEP 4</td>
			<td colspan="2">LLSYVDDEAFIR</td>
			<td>21,1</td>
			<td>720.8721 (+ 2)</td>
			<td>7.5</td>
			<td>865.4050 (+ 1)</td>
			<td>964.4734 (+ 1)</td>
			<td>1214.5688 (+ 1)</td>
			<td>22</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pep 5</td>
			<td colspan="2">LITAIGDVVNHDPVVGDR</td>
			<td>19,7</td>
			<td>630.6742 (+ 3)</td>
			<td>6.3</td>
			<td>642.3570 (+ 1)</td>
			<td>689.8391 (+ 2)</td>
			<td>832.4236 (+ 2)</td>
			<td>20</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pep 6</td>
			<td colspan="2">VFADYEEYVK</td>
			<td>17,7</td>
			<td>631.8006 (+ 2)</td>
			<td>7.0</td>
			<td>830.3931 (+ 1)</td>
			<td>945.4200 (+ 2)</td>
			<td>1016.4571 (+ 1)</td>
			<td>24</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 2. Risultati dell'esperimento di ottimizzazione Tof-MRM: sono indicati i tre frammenti più abbondanti di ciascun peptide PHO quantificato in questo studio, insieme con l'energia di collisione ottimizzato corrispondente.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Conc</td>
			<td>Importo</td>
			<td colspan="6">PEP 2 aree dei picchi (tabella 3A)</td>
		</tr>
<tr>
<td>(nM)</td>
			<td>(fmoles) in colonna</td>
			<td>Rep01</td>
			<td>Rep02</td>
			<td>Rep03</td>
			<td>Rep04</td>
			<td>Significa</td>
			<td>RSD (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>0.1</td>
			<td>1</td>
			<td>490</td>
			<td>439</td>
			<td>462</td>
			<td>431</td>
			<td>456</td>
			<td>5.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>10</td>
			<td>5121</td>
			<td>4842</td>
			<td>5198</td>
			<td>4842</td>
			<td>5001</td>
			<td>3.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>100</td>
			<td>63853</td>
			<td>64279</td>
			<td>66111</td>
			<td>62509</td>
			<td>64188</td>
			<td>2.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>100</td>
			<td>1000</td>
			<td>612392</td>
			<td>605553</td>
			<td>613229</td>
			<td>611004</td>
			<td>610545</td>
			<td>0.6</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Conc</td>
			<td>Importo</td>
			<td colspan="6">PEP 4 aree dei picchi (tabella 3B)</td>
		</tr>
<tr>
<td>(nM)</td>
			<td>(fmoles) in colonna</td>
			<td>Rep01</td>
			<td>Rep02</td>
			<td>Rep03</td>
			<td>Rep04</td>
			<td>Significa</td>
			<td>RSD (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>0.1</td>
			<td>1</td>
			<td>275</td>
			<td>359</td>
			<td>325</td>
			<td>288</td>
			<td>312</td>
			<td>12,2</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>10</td>
			<td>3559</td>
			<td>3694</td>
			<td>3287</td>
			<td>3754</td>
			<td>3574</td>
			<td>5.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>100</td>
			<td>45259</td>
			<td>45775</td>
			<td>42976</td>
			<td>45548</td>
			<td>44890</td>
			<td>2.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>100</td>
			<td>1000</td>
			<td>459374</td>
			<td>467927</td>
			<td>436272</td>
			<td>458994</td>
			<td>455642</td>
			<td>3.0</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Conc</td>
			<td>Importo</td>
			<td colspan="6">Pep 5 aree dei picchi (tabella 3)</td>
		</tr>
<tr>
<td>(nM)</td>
			<td>(fmoles) in colonna</td>
			<td>Rep01</td>
			<td>Rep02</td>
			<td>Rep03</td>
			<td>Rep04</td>
			<td>Significa</td>
			<td>RSD (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>0.1</td>
			<td>1</td>
			<td>3194</td>
			<td>3243</td>
			<td>3202</td>
			<td>3257</td>
			<td>3224</td>
			<td>1.0</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>10</td>
			<td>31464</td>
			<td>31150</td>
			<td>31464</td>
			<td>31433</td>
			<td>31378</td>
			<td>0,5</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>100</td>
			<td>313638</td>
			<td>320712</td>
			<td>311943</td>
			<td>311943</td>
			<td>314559</td>
			<td>1.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>100</td>
			<td>1000</td>
			<td>2845736</td>
			<td>2840031</td>
			<td>2882006</td>
			<td>2864052</td>
			<td>2857956</td>
			<td>0,7</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Conc</td>
			<td>Importo</td>
			<td colspan="6">Pep 6 aree dei picchi (tabella 3D)</td>
		</tr>
<tr>
<td>(nM)</td>
			<td>(fmoles) in colonna</td>
			<td>Rep01</td>
			<td>Rep02</td>
			<td>Rep03</td>
			<td>Rep04</td>
			<td>Significa</td>
			<td>RSD (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>0.1</td>
			<td>1</td>
			<td>490</td>
			<td>583</td>
			<td>440</td>
			<td>440</td>
			<td>488</td>
			<td>13,8</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>10</td>
			<td>6429</td>
			<td>6429</td>
			<td>6848</td>
			<td>6623</td>
			<td>6582</td>
			<td>3.0</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>100</td>
			<td>71295</td>
			<td>70400</td>
			<td>71563</td>
			<td>70400</td>
			<td>70915</td>
			<td>0.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>100</td>
			<td>1000</td>
			<td>707640</td>
			<td>707640</td>
			<td>694461</td>
			<td>729490</td>
			<td>709808</td>
			<td>2.0</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 3. Tabella contenente le aree dei picchi di cromatogrammi HS-MRM registrato per 4 peptidi PHO (Pep 2, 4, 5 e 6) per ogni iniezione di LC/MS (16 piste di LC/MS e 4 concentrazioni testate). La deviazione standard relativa era migliore del 15% per tutti i peptidi sopra la gamma intera concentrazione studiata.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55325/55325fig1.jpg"> Figura 1. Diagramma di flusso di lavoro che riassume i tre passaggi necessari per impostare un metodo di acquisizione di HS-MRM. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55325/55325fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55325/55325fig2.jpg"> Nella figura 2. Esempio di dati HDMSE: (A) bassa energia spettro risultati dello ione del precursore di Pep 6. (B) spettro di frammentazione ad alta energia del peptide stesso, visualizzando la top 3 più abbondanti frammenti ionici (cerchiati) selezionati per l'ottimizzazione energetica Tof-MRM collisione. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55325/55325fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55325/55325fig3.jpg"> Nella figura 3. Parametri utilizzati per l'impostazione di un'ottimizzazione di Tof-MRM esperimento. Per ogni transizione, undici energie di collisione (nella gamma di 16 a 36 V) sono state testate. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55325/55325fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55325/55325fig4.jpg"> Nella figura 4. Esempio del metodo HS-MRM finale. Diversi parametri sono necessari per ogni "transizione", tra cui il peptide precursore m/z, stato di carica e tempo di deriva di mobilità dello ione, m/z dello ione più abbondante del frammento, l'energia di collisione ottimale e il tempo di acquisizione di MS. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55325/55325fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55325/55325fig5.jpg"> Nella figura 5. Impostazioni utilizzate dal metodo di elaborazione per l'analisi del set di dati di HS-MRM. Ogni peptide è monitorato da un singolo "transizione" descritto dal peptide precursore m/z, stato di carica e previsto tempo di ritenzione, insieme con la m/z il frammento più abbondante e stato di carica. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55325/55325fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55325/55325fig6.jpg"> Nella figura 6. Diagramma dello spettrometro di mobilità dello ione. In modalità acquisizione HS-MRM, i precursori del peptide che è essere quantificati sono separati da altri precursori (interferenza) Co-eluizione di peptide nella cella di mobilità dello ione, isolato dal quadrupolo e frammentato con un'energia di collisione fisso nella cella di collisione. Il segnale prodotto dagli ioni frammento del peptide è stato migliorato regolando la frequenza di pusher e quantificazione peptide viene eseguita utilizzando il MS-risoluzione elevata (> 30.000) segnali prodotti dallo ione frammento più intenso di ciascun peptide. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55325/55325fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55325/55325fig7v2.jpg"> Nella figura 7. Cromatogrammi di HS-MRM registrato per 4 peptidi PHO a 4 differenti concentrazioni che attraversa 3 ordini di grandezza (0,1, 1, 10 e 100 nM). (A) pep 2 cromatogrammi, 4 (B) Pep cromatogrammi, cromatogrammi (C) Pep 5 e 6 (D) Pep cromatogrammi. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55325/55325fig7v2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55325/55325fig8v2.jpg"> Figura 8. Curve di calibrazione per 4 peptidi PHO attraverso 4 diverse concentrazioni (0,1, 1, 10 e 100 nM). Le tabelle sotto ogni curva visualizzazione delle aree di picco individuale (Y-valori) registrate per ogni iniezione, mentre la seconda colonna di ogni tabella indica la deviazione percentuale dalla risposta lineare prevista. (A) pep 2 calibrazione, Pep (B) 4 calibrazione, taratura (C) Pep 5 e 6 (D) Pep calibrazione. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55325/55325fig8v2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Qui, descriviamo un'analisi cromatografica accoppiata con la separazione di mobilità dello ione dei precursori del peptide seguita dalla ad alta risoluzione (~ 30.000) MS-rilevazione dei frammenti peptidici per la quantificazione degli standard del peptide a spillo in un anticorpo monoclonale digest.

Un saggio di HS-MRM per la quantificazione delle proteine di cellula ospite in biofarmaceutica di proteine mediante spettrometria di massa di liquido cromatografia dello ione mobilità QTOF

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring ...

L'obiettivo generale del saggio HS-MRM è ridurre il fenomeno di interferenza MRM che influenza la quantificazione di peptidi o proteine combinando la separazione mediante mobilità ionica dei precursori peptidici con la rilevazione spettrometrica di massa ad alta risoluzione degli ioni frammento. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della caratterizzazione di bio-terapeutici, nonché nella quantificazione di biomarcatori proteici o peptidici e nella proteomica quantitativa. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la rilevazione di proteine di cellule ospiti a bassa abbondanza che potrebbero essere presenti nelle proteine biofarmaceutiche.Prima di tutto, fare clic su "crea metodo di analisi" nel software di acquisizione dati e scegliere il metodo "genera, acquisisci ed elabora". Digitare il nome e la descrizione del metodo, individuare la cartella del metodo e fare clic su "avanti". Per il tipo di analisi, selezionare "mappa peptidica IMS" e fare clic su "avanti".Quindi selezionare la configurazione corrente del sistema e fare clic su Avanti e Fine. Nel metodo appena creato, fare clic sulla scheda strumenti, selezionare il gestore di solvente binario e modificare le impostazioni del gradiente per ottenere la separazione dei peptidi a una portata di 0,2 millilitri al minuto. Utilizzare una diluizione a gradiente dall'1 al 40% di solvente B in 30 minuti, seguita da un lavaggio della colonna di due minuti e da un'equilibratura di 10 minuti, per un tempo totale di analisi di 45 minuti.Successivamente, selezionare il gestore del campione e impostare la temperatura del campione a 10 gradi Celsius e la temperatura della colonna a 60 gradi Celsius. Nella scheda strumenti, selezionare lo strumento Vion IMS QTof. Nella sezione impostazioni, selezionare la modalità analizzatore in sensibilità e inserire tre chilovolt per la tensione del capillare, 100 gradi Celsius per la temperatura della sorgente, 250 gradi Celsius per la temperatura di desolvatazione, 50 litri all'ora per il flusso del gas cono e 500 litri all'ora per il flusso del gas di desolvatazione.Fare clic sulla scheda dell'esperimento e selezionare MSE ad alta definizione come modalità. Inserire quindi 100 come massa bassa, 2000 come massa alta e 0,4 secondi come tempo di scansione. Nella sezione energia di collisione, impostare sei electron volt come valore di energia bassa e scegliere una rampa di energia alta da 15 a 40 electron volt.Per il tempo di acquisizione, utilizzare un tempo personalizzato compreso tra cinque e 30 minuti. Successivamente, fare clic sulla scheda opzioni e selezionare la modalità di correzione automatica del blocco con un intervallo di correzione automatica del blocco di cinque minuti. Quindi selezionare l'opzione di continuazione con correzione del blocco e assicurarsi che il controllo automatico del rivelatore sia disattivato.Nel menu di configurazione del sistema attuale, selezionare lo strumento Vion IMS QTof e fare clic su strumenti. Impostare tre chilovolt per la tensione del capillare, 40 volt per il cono di campionamento, 100 volt per l'offset della sorgente, 100 gradi Celsius per la temperatura della sorgente, 250 gradi Celsius per la temperatura di desolvatazione, 50 litri all'ora per il flusso del gas cono, 500 litri all'ora per il flusso del gas di desolvatazione e tre chilovolt per la tensione del capillare di riferimento. Analizzare un campione fittizio precedentemente preparato a 10 nanomolari utilizzando il saggio LC-HDMSE appena descritto, iniettando 10 microlitri di campione nello strumento.Le sequenze individuali dei sei standard peptidici di fosforilasi B contenuti nella miscela peptidica finta sono mostrate qui insieme ai loro tempi di ritenzione e ai precursori più abbondanti osservati nell'esperimento HDMSE. Gli spettri HDMSE acquisiti per uno dei peptidi finti aggiunti nel digestato di Infliximab sono visualizzati qui. Nel software di acquisizione dati, fare clic su crea metodo di analisi e scegliere genera e acquisisci e elabora metodo.Digitare il nome del metodo e la descrizione, cercare la cartella del metodo e fare clic su Avanti. Per il tipo di analisi, scegliere quantificazione, selezionare il saggio di quantificazione Tof 2D cromatografico e fare clic su Avanti. Quindi selezionare la configurazione attuale del sistema e fare clic su Avanti e su Fine.Fare clic sulla scheda strumenti nel metodo appena creato. Selezionare il gestore binario dei solventi e modificare le impostazioni del gradiente per ottenere la separazione dei peptidi a una portata di 0,2 millilitri al minuto. Utilizzare una diluizione a gradiente dal 1 al 40% di solvente B in 30 minuti, seguita da un lavaggio della colonna di due minuti e da un'equilibratura di 10 minuti, per un tempo totale di esecuzione di 45 minuti.Nella scheda strumenti, selezionare il gestore del campione e impostare la temperatura del campione a 10 gradi Celsius e la temperatura della colonna a 60 gradi Celsius. Selezionare ora lo strumento Vion IMS QTof e nella sezione impostazioni, scegliere sensibilità come modalità dell'analizzatore. Inserire quindi tre chilovolt per la tensione del capillare, 100 gradi Celsius per la temperatura della sorgente, 250 gradi Celsius per la temperatura di desolvatazione, 50 litri all'ora per il flusso del gas cono e 500 litri all'ora per il flusso del gas di desolvatazione.Fare clic sulla scheda dell'esperimento e, per il tipo di esperimento, scegliere una tabella di funzioni o più funzioni MS, MSMS o MRM. Eliminare la funzione di acquisizione predefinita, fare clic su aggiungi più MRM ed editare i parametri della finestra di ritenzione nella sezione di esecuzione. Nell'editor di funzioni Tof MRM, inserire il rapporto carica precursore del peptide, selezionare bassa per la risoluzione del precursore e inserire lo stato di carica del precursore.Quindi inserire il rapporto di carica principale del prodotto di 16 elettronvolt per l'energia di collisione iniziale, 0,1 secondi per il tempo di scansione fisso e "wide" per la colonna dello spettro. Utilizzando il pulsante di duplicazione, aggiungere altre 10 transizioni MRM e usare diversi valori di energia di collisione compresi tra 18 e 36 elettronvolt. Dopo aver stabilito le tre migliori transizioni per ciascun peptide, è stato eseguito un esperimento Tof MRM per determinare l'energia di collisione ottimale in grado di massimizzare i segnali generati per ciascun peptide.Successivamente, configurare un metodo HS-MRM contenente un solo ione frammento per peptide. Modificare il metodo Tof MRM creato in precedenza selezionando la funzione HS-MRM al posto della funzione Tof MRM. Nell'editor della funzione HS-MRM, inserire il rapporto carico principale, selezionare "basso" per la risoluzione del precursore e inserire lo stato di carica del precursore.Quindi inserire il valore CCS del precursore e selezionare l'opzione bassa per la risoluzione CCS del precursore. Per l'ione prodotto, inserire il suo rapporto carica/massa principale, selezionare l'energia di collisione ottimale, impostare un tempo di scansione di 0,4 secondi e scegliere un'impostazione spettrale ampia per includere tutti i suoi isotopi. Il saggio HS-MRM finale conserva soltanto la transizione migliore per ciascun peptide ed è utilizzato per l'analisi di tutti i campioni arricchiti.Nel metodo di analisi creato per il metodo di acquisizione dati HS-MRM, fare clic sulla scheda scopo e scegliere gestisci componenti. Dal menu a discesa sotto il tipo di esperimento, selezionare l'opzione HS MSMS/HS MRM. Fare clic su crea e inserire il nome del componente, il tempo di ritenzione previsto, la finestra di tempo di estrazione e il rapporto carica maestro precursore.Selezionare la modalità di estrazione XIC e digitare il valore CCS previsto. Per l'ione frammento, inserire il suo stato di carica e il rapporto di carica principale. Quindi inserire tutti i componenti peptidici monitorati dal saggio HS-MRM.Nella scheda scopo dello stesso metodo di acquisizione HS-MRM, fare clic su quantità predefinite e inserire 0,1, 1, 10 e 100 nanomolari per tutti i componenti peptidici fittizi. Dopo aver inserito il primo valore, fare clic con il tasto destro e selezionare l'opzione riempi verso il basso per inserire la stessa concentrazione per tutti i componenti. Ripetere la stessa procedura per tutte e quattro le concentrazioni della curva di calibrazione.Ora passare alla scheda di elaborazione e fare clic su impostazioni di estrazione. Inserire 10 PPM per la tolleranza di massa. Quindi fare clic su tolleranza del tempo di deriva CCS e inserire il 5% per la tolleranza CCS.Nella scheda di elaborazione, selezionare le impostazioni di elaborazione dei picchi. Nella sezione di lisciatura, scegliere media come algoritmo di lisciatura, uno come larghezza a mezzo altezza e uno come numero di iterazioni. Nella sezione di integrazione, assicurarsi che siano selezionate entrambe le opzioni di larghezza del picco automatica e rilevamento automatico.Successivamente, selezionare le impostazioni dello schermo target nella scheda di elaborazione e scegliere l'opzione più vicina alla temperatura ambiente (RT) nella finestra RT. Inserire quindi 0,2 minuti come tolleranza del tempo di ritenzione. Selezionare le impostazioni di quantificazione e nel menu di calibrazione, scegliere lineare come tipo di curva di calibrazione, uno su x al quadrato come tipo di peso, concentrazione come tipo di valore del componente, millimoli per litro come unità di valore del componente e nessuna per il calcolo dei punti di calibrazione mediante media.Nel menu "quantify", selezionare l'area come valore di risposta. Di seguito sono riportati esempi di cromatogrammi HS-MRM generati per i peptidi fittizi a tutte le concentrazioni. Le curve di calibrazione ottenute per ciascun peptide a seguito dell'integrazione dei picchi HS-MRM sono mostrate qui. L'area del picco deviazione standard relativa calcolata su quattro iniezioni replicate è riassunta qui. Poiché il saggio MRM ad alta selettività incorpora sia la separazione dei precursori mediante mobilità ionica sia il rilevamento mirato con spettrometria di massa ad alta risoluzione, esso ha un grande potenziale per diventare un saggio di monitoraggio rapido ed ad alto rendimento per multipli proteine della cellula ospite attraverso lotti di farmaci biotecnologici. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione su come impostare un saggio MRM ad alta selettività su uno strumento Vion IMS QTof.

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Un saggio di HS-MRM per la quantificazione delle proteine di cellula ospite in biofarmaceutica di proteine mediante spettrometria di massa di liquido cromatografia dello ione mobilità QTOF (Video) | JoVE Journal

Un saggio di HS-MRM per la quantificazione delle proteine di cellula ospite in biofarmaceutica di proteine mediante spettrometria di massa di liquido cromatografia dello ione mobilità QTOF

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