Un saggio di HS-MRM per la quantificazione delle proteine di cellula ospite in biofarmaceutica di proteine mediante spettrometria di massa di liquido cromatografia dello ione mobilità QTOF

L'obiettivo generale del saggio HS-MRM è quello di ridurre il fenomeno dell'interferenza MRM che influisce sulla quantificazione di peptidi o proteine combinando la separazione della mobilità ionica dei precursori peptidici con la rilevazione spettrometrica di massa ad alta risoluzione di frammenti di ioni. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nell'area della caratterizzazione bioterapeutica, nonché della quantificazione di biomarcatori di proteine o peptidi e della proteomica quantitativa. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente di rilevare proteine della cellula ospite poco abbondanti che potrebbero essere presenti nelle proteine biofarmaceutiche.

Innanzitutto, fai clic su crea metodo di analisi nel software di acquisizione dati e scegli il metodo di generazione e acquisizione ed elaborazione. Digitare il nome e la descrizione del metodo, accedere alla cartella del metodo e fare clic su Avanti. Per il tipo di analisi, scegliere mappa peptidica IMS e fare clic su Avanti.

Quindi selezionare la configurazione di sistema corrente e fare clic su Avanti e Fine. Nel metodo appena creato, fare clic sulla scheda strumenti, selezionare il gestore del solvente binario e modificare le impostazioni del gradiente per ottenere la separazione dei peptidi a una velocità di flusso di 0,2 millilitri al minuto. Utilizzare una diluizione in gradiente da uno al 40% di solvente B in 30 minuti, seguita da un lavaggio in colonna di due minuti e da un equilibrio di 10 minuti con una durata totale di 45 minuti.

Quindi, selezionare il gestore dei campioni e impostare la temperatura del campione a 10 gradi Celsius e la temperatura della colonna a 60 gradi Celsius. Nella scheda strumenti, selezionare lo strumento Vion IMS QTof. Nella sezione delle impostazioni, selezionare la sensibilità per la modalità analizzatore e inserire tre kilovolt per la tensione capillare, 100 gradi Celsius per la temperatura della sorgente, 250 gradi Celsius per la temperatura di desolvatazione, 50 litri all'ora per il flusso di gas del cono e 500 litri all'ora per il flusso di gas di desolvatazione.

Fare clic sulla scheda dell'esperimento e selezionare MSE ad alta definizione per la modalità. Quindi immettere 100 per massa bassa, 2000 per massa elevata e 0,4 secondi per il tempo di scansione. Nella sezione dell'energia di collisione, digitare sei elettronvolt per l'impostazione a bassa energia e scegliere una rampa ad alta energia da 15 a 40 elettronvolt.

Per il tempo di acquisizione, utilizzare un runtime personalizzato compreso tra cinque e 30 minuti. Quindi, fai clic sulla scheda delle opzioni e seleziona la modalità di correzione automatica del blocco con un intervallo di correzione automatica del blocco di cinque minuti. Quindi selezionare l'opzione continua con la correzione del blocco e assicurarsi che il controllo automatico del rilevatore sia disabilitato.

Nel menu di configurazione del sistema corrente, selezionare lo strumento Vion IMS QTof e fare clic su strumenti. Inserire tre kilovolt per la tensione capillare, 40 volt per il cono di campionamento, 100 volt per l'offset della sorgente, 100 gradi Celsius per la temperatura della sorgente, 250 gradi Celsius per la temperatura di desolvatazione, 50 litri all'ora per il flusso di gas del cono, 500 litri all'ora per il flusso di gas di desolvatazione e tre kilovolt per la tensione capillare di riferimento. Analizzare un campione finto spiked da 10 nanomolari precedentemente preparato utilizzando il test LC-HDMSE appena descritto iniettando 10 microlitri di campione nello strumento.

Le singole sequenze di sei standard di peptidi fosforilasi B contenute nella miscela di peptidi falsi sono mostrate qui insieme ai loro tempi di ritenzione e ai loro precursori più abbondanti osservati nell'esperimento HDMSE. Gli spettri HDMSE acquisiti per uno dei peptidi falsi aggiunti nel digestato di Infliximab sono mostrati qui. Nel software di acquisizione dati, fare clic su crea metodo di analisi e scegliere il metodo di generazione e acquisizione ed elaborazione.

Digitare il nome e la descrizione del metodo, accedere alla cartella del metodo e fare clic su Avanti. Per il tipo di analisi, scegliere Quantifica, selezionare Quantifica test Tof 2D cromatografico e fare clic su Avanti. Quindi selezionare la configurazione di sistema corrente e fare clic su Avanti e Fine.

Fare clic sulla scheda degli strumenti nel metodo appena creato. Seleziona il gestore di solventi binari e modifica le impostazioni del gradiente per ottenere la separazione dei peptidi a una velocità di flusso di 0,2 millilitri al minuto. Utilizzare la diluizione in gradiente da uno al 40% di solvente B in 30 minuti, seguita da un lavaggio in colonna di due minuti e da un equilibrio di 10 minuti con una durata totale di 45 minuti.

Nella scheda strumenti, selezionare il gestore dei campioni e impostare la temperatura del campione a 10 gradi Celsius e la temperatura della colonna a 60 gradi Celsius. Ora seleziona lo strumento Vion IMS QTof e nella sezione delle impostazioni, seleziona la sensibilità per la modalità analizzatore. Quindi inserire tre kilovolt per la tensione capillare, 100 gradi Celsius per la temperatura della sorgente, 250 gradi Celsius per la temperatura di desolvatazione, 50 litri all'ora per il flusso di gas conico e 500 litri all'ora per il flusso di gas di desolvatazione.

Fare clic sulla scheda dell'esperimento e per il tipo di esperimento, scegliere la tabella delle funzioni una o più funzioni MS, MSMS o MRM. Eliminare la funzione di acquisizione predefinita, fare clic su aggiungi più MRM e modificare i parametri della finestra di conservazione nella sezione runtime. Nell'editor della funzione Tof MRM, immettere il rapporto di carica principale del precursore del peptide, selezionare basso per la risoluzione del precursore e immettere lo stato di carica del precursore.

Quindi inserire il rapporto di carica master del prodotto 16 elettronvolt per l'energia di collisione iniziale, 0,1 secondi per il tempo di scansione fisso e ampio per la colonna dello spettro. Utilizzando il pulsante di duplicazione, aggiungere altre 10 transizioni MRM e utilizzare diversi valori di energia di collisione nell'intervallo da 18 a 36 elettronvolt. Dopo aver stabilito le tre migliori transizioni per ciascun peptide, è stato eseguito un esperimento Tof MRM per trovare l'energia di collisione ottimale per massimizzare i segnali generati per ciascun peptide.

Successivamente, impostare un metodo HS-MRM contenente un solo frammento di ione per peptide. Modificare il metodo di gestione record di resurrezione Tof creato in precedenza selezionando la funzione HS-MRM anziché la funzione di gestione record di regonanza Tof. Nell'editor delle funzioni HS-MRM, immettere il rapporto di carica principale, selezionare basso per la risoluzione del precursore e immettere lo stato di carica del precursore.

Quindi inserire il valore CCS del precursore e selezionare basso per la risoluzione CCS del precursore. Per lo ione prodotto, inserire il suo rapporto di carica principale, selezionare l'energia di collisione ottimale, scegliere un tempo di scansione di 0,4 secondi e selezionare un'impostazione ad ampio spettro per includere tutti i suoi isotopi. Il test HS-MRM finale conserva solo la transizione migliore per ciascun peptide e viene utilizzato per analizzare tutti i campioni addizionati.

Nel metodo di analisi creato per il metodo di acquisizione dati HS-MRM, fare clic sulla scheda scopo e scegliere Gestisci componenti. Dal menu a discesa sotto Tipo di esperimento, seleziona l'opzione HS MSMS/HS MRM. Fare clic su Crea e inserire il nome del componente, il tempo di ritenzione previsto, l'intervallo di tempo di estrazione e il rapporto di carica principale del precursore.

Selezionare la modalità di estrazione XIC e digitare il valore CCS previsto. Per lo ione frammento, inserire il suo stato di carica e il rapporto di carica master. Quindi inserire tutti i componenti peptidici monitorati dal test HS-MRM.

Nella scheda dello scopo dello stesso metodo di acquisizione HS-MRM, fare clic sugli importi predefiniti e inserire 0,1, uno, 10 e 100 nanomolari per tutti i componenti del peptide falso. Dopo aver inserito il primo valore, fare clic con il pulsante destro del mouse e selezionare l'opzione di riempimento per inserire la stessa concentrazione per tutti i componenti. Ripetere la stessa procedura per tutte e quattro le concentrazioni della curva di calibrazione.

Ora passa alla scheda di elaborazione e fai clic su Impostazioni di estrazione. Immettere 10 PPM per la tolleranza di massa. Quindi fare clic su Tolleranza tempo di deriva CCS e inserire 5% per la tolleranza CCS.

Nella scheda Elaborazione, selezionare le impostazioni di elaborazione di picco. Nella sezione arrotondata, selezionare media come algoritmo di arrotondamento, uno come mezza larghezza e uno come iterazioni. Nella sezione di integrazione, assicurarsi che le opzioni di larghezza del picco automatico e di rilevamento automatico siano entrambe selezionate.

Quindi, seleziona le impostazioni dello schermo di destinazione nella scheda di elaborazione e seleziona l'opzione più vicina a RT nella finestra RT. Quindi inserire 0,2 minuti per la tolleranza del tempo di ritenzione. Selezionare le impostazioni di quantificazione e nel menu di calibrazione, scegliere lineare per il tipo di adattamento della curva di calibrazione, uno su x al quadrato per il tipo di peso, concentrazione per il tipo di valore del componente, millimoli per litro per le unità di valore del componente e nessuno per calcolare i punti di calibrazione in base alla media.

Nel menu di quantificazione, selezionare l'area come valore di risposta. Di seguito sono presentati esempi di cromatogrammi HS-MRM generati per i peptidi falsi in tutte le concentrazioni. Qui vengono visualizzate le curve di calibrazione ottenute per ciascun peptide in seguito all'integrazione dei picchi HS-MRM.

La deviazione standard relativa dell'area di picco calcolata sulla base di quattro iniezioni di replica è riassunta qui. Poiché il test MRM ad alta selettività incorpora sia la separazione dei precursori della mobilità ionica che la rilevazione mirata con spettrometria di massa ad alta risoluzione, ha un grande potenziale per diventare un test di monitoraggio rapido e ad alto rendimento per più proteine della cellula ospite in lotti di biofarmaci. Dopo aver visto questo video, dovreste avere una buona comprensione di come impostare un saggio MRM ad alta selettività su uno strumento Vion IMS QTof.