Una Camera Semplice per l'Imaging Confocale a lungo termine dello sviluppo di radici e ipocotili

L'obiettivo generale di questo sistema di imaging è quello di utilizzare la microscopia a fluorescenza confocale per osservare lo sviluppo degli organi delle piante per diversi giorni a una risoluzione subcellulare. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella morfogenesi delle piante, ad esempio in che modo le cellule degli organismi multicellulari coordinano i loro modelli di crescita e proliferazione durante l'organogenesi? Il vantaggio principale di questa tecnica è che è semplice da configurare e non si basa sulle apparecchiature specializzate spesso utilizzate nell'imaging time lapse, come i sistemi a profusione.

Abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando abbiamo letto la pubblicazione di Littlejohn and Love, su New Phytologist, che descrive i vantaggi della perfluorodecalina per l'imaging all'interno dei tessuti fogliari. Per iniziare, usa un tagliavetro per realizzare strisce di vetro larghe tre millimetri da uno scivolo spesso un millimetro. Quindi, con colla cianoacrilica o nastro biadesivo, fissare le strisce a circa 45 millimetri di distanza l'una dall'altra lungo la larghezza di un nuovo vetrino.

Crea una diapositiva extra con le stesse dimensioni che funga da stampo. Ora, crea una guarnizione della stessa altezza con gomma PDMS permeabile ai gas. Bagnare un secondo vetrino con un po' di etanolo assoluto e appiattire il PDMS sul vetrino all'altezza delle strisce di vetro.

Quindi, bagnare una lama con etanolo assoluto e tagliare il PDMS in eccesso. Questo è fondamentale in quanto gli strumenti bagnati con etanolo non si attaccano al PDMS. Quindi, riappiattire il PDMS fino all'altezza della striscia.

Quindi, incidi una cavità nel PDMS che conterrà la piantina e la lastra di agar. Per produrre una cavità di dimensioni costanti, utilizziamo un cutter fatto in casa su misura costruito con perspecs, ma al suo posto potrebbe essere utilizzata una lama di rasoio. Quindi, taglia intorno al bordo esterno per rendere la guarnizione spessa circa due millimetri.

Ora, su un vetrino senza la guarnizione PDMS, appoggiare un vetrino coprioggetti su entrambe le strisce di vetro. Quindi, nello spazio sotto il vetrino coprioggetti, pipettare circa un millilitro di terreno di agar liquefatto caldo, quanto basta a riempire lo spazio. L'agar può contenere composti sperimentali di interesse.

Quindi, bilancia un po' di PFD agitando un piccolo volume di PFD in un tubo. Una volta che l'agar si è solidificato, caricare circa 200 microlitri di PFD nella guarnizione PDMS, ma non riempirla completamente. Rimuovere il vetrino coprioggetti dalla lastra di agar e tagliarlo in una forma che si adatti bene alla guarnizione in gel PDMS.

Lasciare uno spazio da due a quattro millimetri tra l'agar e la parete della guarnizione. Quindi, riempire completamente la camera con PFD bilanciato ad aria. Per l'imaging delle radici primarie gravitropiche, viene utilizzata una membrana cellulosica come barriera fisica sulla superficie della lastra di agar.

La lastra di agar deve inoltre essere più morbida con lo 0,8% di agar anziché l'1,5% di agar. Tagliare un pezzo della membrana che abbia all'incirca le stesse dimensioni del blocco di agar. Quindi, sterilizzarlo con etanolo all'80% e lasciarlo asciugare all'aria.

Una volta asciugata, immergere la membrana in un terreno di coltura liquido e poi trasferirla sulla superficie dell'agar. Per iniziare, posiziona con cura fino a tre piantine sull'agar. Il loro posizionamento è fondamentale.

I cotiledoni e l'ipocotile devono pendere dal bordo dell'agar, galleggiando nel PFD. Deve essere previsto uno spazio tra le piantine per consentire la crescita. Le piantine possono essere arricciate se sono troppo grandi per entrare nella camera.

Quindi, chiudere la camera utilizzando un vetrino coprioggetti con uno spessore che corrisponda all'obiettivo scelto. Premere delicatamente lungo il bordo in modo che il contatto avvenga con le strisce di vetro. Utilizzare un altro vetrino per premere delicatamente il vetrino coprioggetti in modo che poggi uniformemente sulle due strisce di vetro.

Quindi, fissare il vetrino coprioggetti utilizzando del nastro chirurgico microporoso tagliato a metà nel senso della lunghezza. Ora, lasciare riposare il campione per circa mezz'ora prima dell'imaging. Per preparare le piantine di arabidopsis thaliana per le camere, sterilizzare prima i semi con etanolo al 70%.

E poi piantali su un terreno integrato. Stratificare i semi piantati per due o quattro giorni a quattro gradi Celsius. Quindi, trasferisci i semi piantati a 22 gradi Celsius e coltivali orientati verticalmente con un ciclo di luce giornaliero di 16 ore.

Per visualizzare le radici laterali, fai crescere le piante per sette-10 giorni e poi trasferiscile nelle camere di imaging. Le radici laterali che crescono a ritmi fisiologici nelle camere di imaging sono state documentate ogni mezz'ora. Anche le radici laterali sono state coltivate su piastre di Petri standard nello stesso terreno per il confronto.

Il tasso di crescita delle singole radici variava molto in entrambe le configurazioni, ma l'intervallo era simile in entrambe le condizioni. Nel complesso, il tasso di crescita è aumentato con la lunghezza. Il tasso di crescita delle piante nelle camere di imaging o su piastre era indistinguibile nelle prime 27 ore di crescita.

Entrambi i gruppi hanno iniziato con la stessa lunghezza media della radice laterale. Le radici laterali che co-esprimono un marcatore della membrana plasmatica e un marcatore di micro tubuli sono state visualizzate a intervalli di un'ora nelle camere di imaging. Le radici erano altamente stabili nelle loro posizioni, consentendo diverse ore di imaging confocale.

Durante l'esperimento sono stati osservati indicatori visivi di proliferazione. Nelle cellule meristematiche, sono state identificate bande pre-profase, fusi mitotici e fragmoplasti. Nell'arco di tre giorni, la crescita laterale delle radici non è risultata significativamente diversa nelle camere di imaging rispetto alle piastre di Petri durante le prime 48 ore, ma entro 72 ore il tasso di crescita medio è diminuito.

Tuttavia, una percentuale significativa di radici nelle camere cresceva ancora a tassi paragonabili alle radici sulle piastre nell'arco di 72 ore. Una volta padroneggiati, si possono fare due diapositive in 15 minuti se tutto va liscio. È possibile utilizzare questo sistema di imaging per studiare l'effetto dei trattamenti farmacologici, sebbene siano necessari altri metodi più complessi come i sistemi di perfusione per gli esperimenti di washout.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha fornito un mezzo economico e semplice per seguire gli eventi cellulari alla base della morfogenesi delle piante, in particolare per esplorare il ruolo dei bordi cellulari, delle esigenze spaziali che condividono l'organogenesi nelle radici laterali di arabidopsis thaliana.