Tracciamento in vivo di sviluppo dell'edema e patologia microvascolare in un modello di malaria cerebrale sperimentale mediante l'utilizzo di immagini a risonanza magnetica

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di monitorare i cambiamenti patologici della malaria cerebrale sperimentale in vivo. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella patogenesi della malaria cerebrale sperimentale in quanto ci permette di visualizzare in vivo come la patologia dell'intero cervello si evolve nello spazio e nel tempo. La tecnica consente quindi una valutazione dettagliata della patologia cerebrale e può essere utilizzata per valutare l'efficacia di nuove strategie di trattamento nella malaria cerebrale.

A eseguire la configurazione della risonanza magnetica sarà Manuel Fischer, il nostro responsabile di laboratorio. Inizia raccogliendo le zanzare femmine dalla loro gabbia, da 17 a 22 giorni dopo il pasto di sangue. Usa una pinza per posizionare tre o quattro zanzare su un vetrino, combinato con una goccia di terreno RPMI freddo.

Quindi, posizionare il vetrino sotto un microscopio. Allunga con cura la zanzara tra la testa e il corpo con una pinza e usa una siringa e un ago per isolare la ghiandola salivare. Successivamente, raccogliere le ghiandole salivari dal vetrino aspirandole con una pipetta di vetro e trasferendole in una provetta da centrifuga da 1,5 millilitri.

Quindi, utilizzare un piccolo bastoncino di plastica per schiacciare le ghiandole salivari isolate all'interno della provetta da centrifuga per tre minuti al fine di isolare gli sporozoiti dal tessuto delle ghiandole salivari. Centrifugare per tre minuti a 1.000 volte g e quattro gradi Celsius per purificare gli sporozoiti dal tessuto rimanente. Pipettare il surnatante, che contiene gli sporozoiti, in una nuova provetta da centrifuga e contare gli sporozoiti purificati in un emocitometro Neubauer.

Gli sporozoiti mostrano un tipico movimento in senso antiorario. Successivamente, regolare la concentrazione degli sporozoiti purificati a 10.000 per millilitro aggiungendo soluzione salina tamponata con fosfato. Infine, metti un topo C57BL/6 in un sistema di ritenuta e metti la coda in acqua tiepida per visualizzare meglio la vena della coda.

Quindi, iniettare un totale di 1.000 sporozoiti, o 0,1 millilitri, nella vena caudale per avviare l'infezione. Inizia portando il mouse a una risonanza magnetica per piccoli animali da 9,4 T, o scanner MRI, che utilizza un risonatore di volume per la trasmissione a radiofrequenza. Quindi, applicare l'unguento per gli occhi al dexpantenolo su entrambi gli occhi.

Accendere il bagnomaria a temperatura controllata a 42 gradi Celsius per mantenere la temperatura corporea del mouse. Quindi, posizionare un catetere della vena caudale nella vena caudale del topo. Quindi, posiziona il mouse per la risonanza magnetica posizionandolo prono e con la schiena scricchiolata su un letto per animali dotato di un blocco della testa e di una barra per i denti per ridurre al minimo il movimento della testa.

Fare attenzione a non raddrizzare il rachide cervicale del topo. Collegare un sistema di iniezione di mezzo di contrasto riempito con 0,3 millimoli per chilogrammo di Gd-DTPA al catetere della vena caudale. Quindi, posizionare la bobina della testina del ricevitore di superficie phased array a 4 canali sulla testa del mouse.

Infine, posizionare un tampone respiratorio sul retro del mouse e controllare la respirazione sul dispositivo di monitoraggio. Accendi il laser posizionale premendo F2 sul pannello di controllo e sposta il mouse fino a quando la luce di posizione orizzontale non si trova al centro della parte più piccola della bobina, che copre la testa del mouse. Spegnere il laser posizionale premendo nuovamente F2, quindi spostare il mouse nella posizione finale premendo F3 sul pannello di controllo.

Inizia eseguendo una scansione localizzata per assicurarti che il cervello del topo si trovi nell'isocentro del magnete. Valutare qualitativamente l'edema vasogenico utilizzando l'imaging 3D pesato in T2. Seleziona una sequenza RARE multi-slice e regola la posizione della slice, assicurandoti che l'intero cervello, dal naso al cervelletto, sia coperto.

Dopo aver regolato le fette di saturazione, avviare la sequenza e attendere 10 minuti e 48 secondi per acquisire le immagini. Successivamente, eseguire la rilassometria T2 per valutare quantitativamente l'edema vasogenico selezionando una sequenza di eco multi-slice e multi-spin. Regola la posizione della sezione e avvia l'acquisizione della sequenza, che richiede otto minuti e 53 secondi.

Per valutare quantitativamente sia l'edema vasogenico che l'edema citotossico, eseguire l'imaging pesato in diffusione selezionando una sequenza di diffusione EPI spin-echo. Regolare la posizione della sezione e la sezione di saturazione. Quindi avvia la sequenza e attendi sette minuti e 56 secondi fino all'acquisizione delle immagini raw.

Successivamente, valutare le microemorragie, utilizzando l'imaging 3D T2 pesato a stella. Selezionare una sequenza FLASH con compensazione del flusso, regolare la posizione della fetta e avviare la sequenza, che dura 15 minuti e 40 secondi. Successivamente, valutare la pervietà arteriosa utilizzando l'angiografia a tempo di volo selezionando una sequenza 3D FLASH.

Regolare la posizione della porzione, avviare la sequenza, quindi attendere sette minuti e 16 secondi fino all'acquisizione delle immagini. Infine, valutare l'interruzione della barriera emato-encefalica. Selezionare un'immagine 3D pesata in T1 con una sequenza FLASH, regolare la posizione della fetta e avviare la sequenza.

Attendere un minuto e 14 secondi fino a quando non vengono acquisite immagini senza contrasto. Quindi, iniettare un contrasto di 0,3 millimoli per chilogrammo e ripetere la misurazione. Un aumento dell'interruzione della barriera emato-encefalica e un aumento dei liquidi indicano un edema vasogenico precoce nel bulbo olfattivo che è già presente nella malattia lieve e inizia a diffondersi verso il tronco encefalico all'aumentare della gravità della malattia.

Sulle mappe T2, la gravità dell'edema vasogenico può essere quantificata disegnando le regioni di interesse in specifiche regioni anatomiche. Per ogni regione si può ottenere un tempo di rilassamento T2 che aumenta con l'aumentare dell'edema. Inoltre, il volume cerebrale indicativo di edema inizia ad aumentare significativamente nei topi moderatamente malati rispetto al basale e aumenta ulteriormente nei topi gravemente malati.

Infine, la patologia microvascolare, come evidenziato dalle microemorragie e da un aumento del contrasto di suscettibilità dei vasi, si verifica dopo i primi segni di rottura della barriera emato-encefalica nell'edema vasogenico. Questi microemorragi si verificano prevalentemente nel bulbo olfattivo. Se si ottiene l'intero protocollo MRI, tutte le immagini, compreso il posizionamento, possono essere ottenute entro un'ora, se eseguite correttamente.

Il protocollo minimo dovrebbe includere una sequenza pesata in T2 o rilassometria in T2 e una sequenza pesata in T2 a stella per giudicare la presenza di edema vasogenico, carico di microemorragie e compromissione microvascolare. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come la risonanza magnetica dell'intero cervello visualizza i cambiamenti patologici nella malaria cerebrale sperimentale, inclusi cambiamenti come il gonfiore cerebrale, che è difficile da rilevare ex vivo.